Посещений: 
РЫБКИ ДАНИО
Исследования гепатотоксичности различных соединений
Zebrafish: An emerging model system to study liver diseases and related drug discovery
Swati Katoch
Vikram Patial
О. Appl. Toxicol. | https://doi.org/10.1002/jat.4031
| |
|
Рыбки данио (Danio rerio), небольшие (3-5 см в длину) эндемические тропические пресноводные рыбки, обитающие в сев. Индии и сев. Пакистане и некоторых регионах Южной Азии. Рыбки данио по их отчетливым линейным пигментированным полоскам, напоминающими полоски зебры. В 1972, George Streisinger пионер работ с рыбками данио предложил их использовать в качестве модельного организма. Его группа изучала развитие нервной системы и установила, что они пригодны для генетических манипуляций. Рыбки данио обнаруживают функциональное сходство с 70% генов, вызывающих болезни у людей помимо многочисленных физиологических и генетических сходств. Модельные рыбки данио пригодны для изучения болезней людей, генетики развития, токсикологии, рака и регенерации (Goessling & Sadler, 2015).
Печень осуществляет многие жизненно важные функции в теле, включая деинтоксикацию, синтез макромолекул, хранение витаминов и т.д. Большое количество наследственных и приобретенных болезней связано с нарушениями функции печени. Экспериментальные исследования развития и болезней печени а основном осуществляются на клеточных культурах модельных грызунах. Однако, использование модельных рыбок данио в изучении развития печени и поиске защищающих печень лекарств становится популярным. Показано, что события в развитии печени у людей и рыбок данио обнаруживают существенное сходство (Wilkins & Pack, 2013), как и болезни и терапевтические подходы (Kar & Subbiah, 2013).
2 HEPATIC SYSTEM OF ZEBRAFISH Печень рыбок данио, относящихся к teleost, обнаруживают обчные отличия от млекопитающих, но играют сходную роль в детоксификации, гоеостазе и метаболизме. Развитие печени у рыбок данио проходит три определенные фазы; спецификации, дифференцировки и роста. В фазе спецификации латеральная область энтодермы передней части передней кишки дает клетки предшественники, которые объединяются, чтобы сформировать лежащий в основе каркас из гепатобластов, предшественников гепатоцитов (Tao & Peng, 2009). Картирование судеб этих клеток происходит в 22 h post-fertilization (hpf), когда появляются первые признаки детерминации (stipulation) печени. Клетки передней части энтодермы экспрессируют печеночные транскрипционные факторы с hematopoietically expressed homeobox (hhex) и Prospero homeobox 1 (prox1) на этой ст. (Wallace & Pack, 2003). Вентральная и дорсальная часть энтодермы дифференцируется, чтобы заложить зачаток печени и поджелудочной железы, соотв. Основными транскрипционными факторами жизненно важными для собственно поддержания и спецификации энтодермы являются GATA 4-6, forkhead box A (FOXA) и sex determining region Y (SRY)-box 32/17 (SOX 32/17) (Shin et al., 2005; Tiso, Filippi, Pauls, Bortolussi, & Argenton, 2002). Фаза дифференцировки происходит на ст. 24-50 hpf, когда обнаруживается экспрессия молекулярных маркеров, таких как ceruloplasmin, в примордиальной печени (32 hpf) (Korzh, Emelyanov, & Korzh, 2001). На ст. 24-30 hpf, передняя кишка подвергается изгибу в левую сторону из-за выпячивания, образующего печеночный зачаток, который становится ещё более выступающим на ст. 48 hpf. На этой ст. гепатобласты дифференцируются, чтобы продуцировать гепатоциты, т.е., печеночные клетки и внутрипеченочные желточные клетки, формирующие желчные протоки. Обнаруживаются некторые др. фундаментальные маркеры дифференцировки гепатобластов, такие как transferrin и liver fatty acid-binding protein (L-FABP) на ст. 48 hpf (Her, Chiang, Chen, & Wu, 2003). Эти маркеры созревания желчных клеток варьируют от маркеров дифференцировки гепатоцитов благодаря экспрессии cytokeratins, преимущественно keratin-18 на 3-5 дни post-fertilization (dpf). Фаза роста обнаруживается со ст. 50 hpf до juvenile фазы. Печеночный зачаток пролиферирует и индуцирует развитие желчных протоков путем воздействия сигналов, необходимых для поляризации гепатоцитов (Field, Ober, Roeser, & Stainier, 2003). На ст. 72 hpf, печеночная система рыбок данио соответствует организации желчных протоков и образованию сосудистой паутинной структуры, расположенных между гепатоцитами (Korzh et al., 2008; Ward, Warga, & Prince, 2007).
Печень осуществляет фундаментальные процессы оксидативной каталитической трансформации, которая приводит к активации различных эндогенных и экзогенных соединений. Печеночные клетки рыбок данио экспрессируют cytochrome P450 (CYP) , который метаболизирует xenobiotic соединения посредством того же самого пути, что и у гепатоцитов человека. Окисление, восстановление и гидролиз это три фундаментальные метаболические реакции, осуществляемые энзимами CYP. Эти метаболические регуляторы являются исключительными для выбора модельных животных для процедуры скрининга токсичности лекарств (Browning & Horton, 2004). Профили транскрипции генов CYP обнаруживают пол-специфические уровни экспрессии, но основные CYP гены присутствуют у обоих полов, которые регулируют метаболизм ксенобиотиков на передовой границе, это cyp2ad2, cyp3a65, cyp1a, cyp2p9 и cyp2y3 (Alderton et al., 2010; Goldstone et al., 2010; Kubota et al., 2019).
Гистологически печень млекопитающих и рыбок данио выглядят по-разному на первый взгляд, т.к. кровеносные сосуды случайно распределены по всей печени рыбок данио (Figure 1). Отсутствует морфологически различимая центральная портальная вена, вместо этого обнаруживается определенная портальная структура, гепатоциты в печени рыбок данио организованы в виде пучков пустотелых трубок и желчных протоков, которые проходят между ними (Schlegel & Gut, 2015). Несмотря на эту уникальную анатомию и архитектуру печень млекопитающих и рыбок данио обнаруживает cущественную гомологию в отношении их типов клеток, за исключением Kupffer клеток. Печеночные клетки обнаруживают общие аналогичные функции, такие как секреция желчи, чувствительность к инсулину, биотрансформация ксенобиотиков, хранение липидов и гликогена, секреция сывороточных белков и факторов образования сгустков (Kar & Subbiah, 2013). Отсутствует районирование (zonation) печеночных клеток в печени рыбок данио по сравнению с млекопитающими. Печень имеет три доли (две боковые и одну вентральную) с отсутствием разделяющего стебля. Присутствуют два типа желчных клеток: небольшие preductal желчные эпителиальные клетки и крупные цилиндрические холангиоциты. Клетки первого желчного типа создают внутрипеченочные просветы (canaliculi), которые анастомозируют, чтобы сформировать желчные протоки. Последний тип клеток формирует внутрипеченочный желчный канал (Goessling et al., 2008; Ward et al., 2007). У млекопитающих развитие внутрипеченочного желчного канала осуществляется посредством ductal пластинки, тогда как отсутствуют доказательства ductal пластинки в развивающейся печени у рыбок данио. Желчные канальцы распределяются между гепатоцитами и их клетки запечатываются (sealed) с помощью непроницаемых плотных соединений у млекопитающих, чтобы предупредить протекание желчи. Канальцы формируются за счет инвагинации апикальной мембраны гепатоцитов (Wilkins & Pack, 2013). Многочисленные холангиоциты обычно присутствуют во внутрипеченочных желчных протоках млекопитающих, обладающих самостоятельной эпителиальной морфологией, тогда как печень рыбок данио состоит из немногих холангиоцитов (Goldsmith & Jobin, 2012; Pham, Zhang, & Yin, 2017).
FIGURE 1 Schematic representations of zebrafish liver architecture. (A) Scattered presence of hepatic tubule, bile duct, hepatic artery, central vein, sinusoids and stellate cells in the hepatic parenchyma. (B) The hepatic tubule is composed of hepatocyte arranged around the bile duct which collects the bile from hepatocyte canaliculi. (C) Showing the location of the liver in transparent zebrafish larva. (D) Histology of the liver of adult zebrafish showing (Ч200) presence of hepatic tubule (circle), blood vessels (arrows) and sinusoids (arrowheads) in hepatic parenchyma
3 LIVER INJURY MODELS IN ZEBRAFISH Многие модели были оптимизированы для оценки гепатотоксичности у рыбок данио. Тесты различных соединений могут осуществляться посредством инъекций или или растворенными в воде, как и в случае модельных грызунов. Детальные результаты разных гепатотоксических соединений представлены в Table 1. В целом внешние токсиканты запускают нарушения функции гепатоцитов за счет повреждений митохондрий, эндоплазматического ретикулума (ER) и изменений клеточной морфологии. Нарушения функционирования крупных органелл приводит к митохондриальным стрессам, стрессам, ER и оксидативным стрессам. Эти события в дальнейшем стимулируют воспалительные, пролиферативные и клеточной гибели пути (Figure 2).
TABLE 1. Different compounds/manipulations used to induce hepatotoxicity at various stages of zebrafish
FIGURE 2
Schematic representation of major cellular events in toxicant-induced liver damage. The various toxicants trigger impairment of cell function by affecting mitochondria, endoplasmic reticulum and cellular morphology. The compromised functioning of major organelles leads to a cascade of injuries by activating cell death, inflammation and proliferation. ER, endoplasmic reticulum; IL-6, interleukin 6; ROS, reactive oxygen species; TGF-β, transforming growth factor-beta; TNF-alpha, tumor necrosis factor-alpha
3.1. Drug-induced liver injury (DILI) В области разработки лекарств и клинической медицины, DILI становятся настоящими беспокойствами для безопасности и они становятся главной причиной для отклонения лекарственного подхода. Процедура скрининга является элементарным инструментом для прицельного обнаружения потенциальных гепатотоксических агентов, особенно у рыбок данио (Driessen et al., 2013). Печеночные клетки хорошо развиты у рыбок данио на 3 dpf, поэтому DILI уже можно изучать на этой стадии (Zhang, Li, & Gong, 2014). DILI могут приводить к скоротечной печеночной недостаточности, обусловленной громадной гибелью гепатоцитов. Токсикологические исследования с использованием модельных рыбок данио предоставили целую систему быстрого скрининга исходов на разные токсические агенты, т.к. весь организм может быть проанализирован во время разных ст. развития.
3.1.1. Analgesics and non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) Модальные рыбки данио были использованы для изучения гепатотоксических эффектов NSAIDs. Эти обычно предписываемые медикаментозные препараты для снижения боли и воспаления, предупреждают образование кровяных сгустков и снижают лихорадку (Lange, Mortz, Bindslev-Jensen, & Kjeldsen, 2019). NSAIDs работают путем супрессии действия cyclo-oxygenase enzymes (COX-1 and COX-2) и тем самым снижается продукция prostaglandins. Независимо от их сильного противовоспалительного действия эти лекарства имеют побочные эффекты в виде гепатотоксичности и нефротоксичности (Blanca-Lopez, Soriano, Garcia-Martin, Canto, & Blanca, 2019).
Valproic acid (VPA) является стандартным предписанием при эпилепсии, биполярных расстройствах и мигрени, несмотря на гепатотоксические побочные эффекты. В исследовании для прогноза пригодности проводили скрининг на гепатоксичность целых модельных эмбрионов рыбок данио, 3-dpf эмбрионы рыбок данио подвергали воздействию трех разных концентраций (67, 200 и 600 µM) VPA в течение 48 h. Взрослые рыбки данио также подвергали воздействию сходных концентраций в течение 48 h, чтобы оценить гепатотоксические эффекты VPA. Воздействие приводило к вакуолизации гепатоцитов и сильному накоплению липидов в печени (Driessen et al., 2013). Сходным образом, воздействие VPA у мышей, как было установлено, стимулирует изменения жира в печени, обусловленные отложением липидов и коллагенов в гепатоцтах (Vitins et al., 2014). Оно также усиливает накопление липидов в oleic acid-индуцированной линии клеток FL83B зависимым от дозы способом. Воздействие VPA, как полагают, повышает уровни CD36, низкой плотности lipoprotein receptor-related protein 1 (lrp1), diacylglycerol O-acyltransferase 2 (dgat2) и perilipin 2 (plin2), снижает активность генов acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyl transferase subunit a (acca) и fatty acid synthase (fasn). Это индуцирует транслокацию в ядра peroxisome proliferator-activated receptor gamma (pparγ) и повышает уровни белка клеточной поверхности CD36. VPA способствует накоплению печеночных липидов за счет приумножения pparγ и CD36-зависимое потребление липидов, приводя к печеночному жировому перерождению (Chang et al., 2016).
3.1.2. Acetaminophen Acetaminophen это широко используемое аналгетическое и жаропонижающее средство, которое безопасно в терапевтических дозах. Превышение дозы этого лекарства запускает избыточную продукцию токсического метаболита N-acetyl-p-benzoquinone imine (NAPQI), это может приводить к фатальным гепатоцеллюлярным повреждениям и печеночной недостаточности. N-acetylcysteine (NAC) используется в качестве эффективного антидота при acetaminophen-индуцированной гепатотоксичности; однако, оно эффективно только если дается немедленно. Избыточное формирование NAPQI вносит вклад в истощение резервов glutathione (GSH), приводя к оксидативным стрессам и дисфункции митохондрий (Vliegenthart, Tucker, Del Pozo, & Dear, 2014).
Исследование, предпринятое на личинках рыбок данио, оценивало зависимые от концентрации гепатотоксические эффекты acetaminophen. 3-dpf эмбрионы подвергали воздействию разных концентраций acetaminophen viz. 1000, 2000 and 5000 µM вплоть до 6 dpf. No Observed Adverse Effect Level (NOAEL) лекарства обнаруживалось при дозе 500 µM. При дозе 5000 µM, личинки рыбок данио обнаруживали достоверные количества печеночных некрозов и гепатоцеллюлярные повреждения (Pandya et al., 2016). У взрослых рыбок данио acetaminophen индуцировал гепатотоксичность зависимым от дозы способом. Рыбки подвергались воздействию 10 mM acetaminophen в течение 24 h и затем им позволяли размножаться. Были отмечены параметры, такие как снижение доли вылупления и скорости роста, искривления формы тела и 100% смертность после 4 dpf, указывающие на токсичность и нарушения развития от acetaminophen. Повышение печеночных и воспалительных маркеров, вместе с синусоидным расширением и печеночным некрозом подтверждает гибель из-за печеночной недостаточности. се эти результаты согласуются с гепатотоксическими эффектами acetaminophen (Swarnalatha, 2017).
3.2. Preservatives-induced liver injury
3.2.1. Bisphenol A (BPA)
BPA (2,2-bis(4-hydroxyphenyl)propane) является органическим синтетическим соединением, используемым для синтеза polycarbonate пластиков, эпоксидной смолы, покрывающих внутреннюю сторону контейнеров для еды и напитков, чтобы консервировать пищу на долгое время. BPA считается химическим соединением нарушающим эндокринную систему, он индуцирует гепатотоксичность у рыбок данио. У взрослых рыбок данио воздействие BPA в течение 60 приводит к увеличению индекса массы тела, диффузному накоплению липидных капель и к потере гепатоцеллюлярного гликогена при 100 µg/L. Эффект, как полагают, обусловлен изменением экспрессии адипогенеза и гомеостаза липидов, регулирующих белки (pparγ и CCAAT/enhancer связывающий белок alpha [c/ebpα]) (Ngo et al., 2017). Сходным образом, Cao et al. (2010) описали токсические эффекты BPA у самцов и самое рыбок данио при 0.2, 2, 6.1 и 6.3 mg/L дозах в течение 96 h. Наивысшая доза (6.3 mg/L) приводила к гепатоцеллюлярному некрозу, разрушению структуры семенников и атрезии (35%) фолликулов яичников. Однако, более низкие дозы индуцировали лишь умеренные повреждения печени при отсутствии влияние на гонады (Cao et al., 2010). Сходным образом, исследования самцов крыс показали, что долговременное воздействие BPA вызывает накопление липидов в печени и привдит к аномальному гомеостазу (Hassan et al., 2012).
3.2.2. Bisphenol S (BPS)
Чтобы понять токсикологические механизмы BPS (заменителя BPA), который обычно обнаруживается в человеческой крови и моче. Самцы и самки рыбок данио подвергались воздействию BPS в разных концентрациях (1, 10, 100 и 1000 µg/L) в течение 120 дней. У самцов снижался уровень транскрипции генов, участвующих с метаболизме липидов, sterol regulatory element-binding transcription factor 1 (srebp1) и ppara, защищающих от подавления синтеза жирных кислот и клеточной деградации при 1000 µg/L. Жирные кислоты используются как предшественники для формирования печеночного triglycerol (TAG) , а его пониженные уровни подтверждают также изменения экспрессии 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferase 4 (agpat4) и dgat2. Однако, самки обнаруживают не монотонные эффекты на экспрессию генов fasn, dgat2 и ppara . Не подвергшиеся воздействию потомки от BPS-обработанных рыб также обнаруживали большие количества накопления желточных липидов на 5 dpf. В целом исследования долговременных эффектов BPS и его роли в увеличении риска печеночных болезней, в основном не связанных с алкоголем печеночных болезней (NAFLD) у самцов рыбок данио (Wang et al., 2019). Эти токсикологические эффекты у модельных рыбок данио подтверждают их ценность для токсикологического скрининга in vivo.
3.3 Antibiotics-induced hepatotoxicity
3.3.1. Tetracycline hydrochloride (TET) and erythromycin (ERY)
Рыбки данио были использованы для изучения гепатотоксических эффектов разных антибиотиков. TETs, открыт в 1940s, обладает сильным действием против разных микробов (chlamydiae, mycoplasmas и др. простейших паразитов) (Chopra & Roberts, 2001; Roberts, 2005). С др. стороны, ERY используется для лечения инфекций респираторного тракта, инфекций кожи, инфекций chlamydia и многих др. (Cai et al., 2019). В одном исследовании на эмбрионах рыбок данио изучали воздействие концентраций (0.1, 1, 10, 100 и 1000 µM) этого антибиотика в течение 72-120 hpf чтобы оценить макс. нелетальную концентрацию (MNLC) и летальную концентрацию-10 (LC10). MNLC и LC10 для TET составляли 425 µM и 583.8 µM, соотв.; тогда как для ERY, MNLC составляла 5000 µM и нет LC10. Гепатотоксичность соединений была оценена при 4-х разных концентрациях (1/10 MNLC, 1/3 MNLC, MNLC и LC10). Воздействие антибиотиков в концентрациях 583.8 µM (TET) и 5000 µM (ERY), уменьшало размер печени и задерживало абсорбцию желтка. TET и ERY вызывали дегенерацию печени со скоростью 13.5-37.5% и 11.3-46.3%, соотв. Печень обработанных эмбрионов теряла прозрачность и выглядела темной в результате токсичности в печени. Исследование подтвердило индуцируемую антибиотиками гепатотоксичность у рыбок данио, как и у млекопитающих (He et al., 2013).
3.3.2. Mitoxantrone
Mitoxantrone является противоопухолевым антибиотиком. Эмбрионы рыбок данио подвергались воздействию разных концентраций (0, 10, 50 and 100 µg/L) mitoxantrone в течение 96 h и выборки получали каждые 24 h. После 48 hpf, концентрация в 100 µg/L снижала уровни мРНК fab10a (биомаркер гепатотоксичности у рыбок данио), тогда как др. гены биомаркеры гепатотоксичности, напр., glutamate-cysteine ligase catalytic subunit (gclc), glutathione-disulfide reductase (gsr) и NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (nqo1) обнаруживали повышенную экспрессию. Печень 72 hpf эмбрионов обнаруживал нерегулярно расположенные печеночные клетки, пикноз, образование липидных вакуолей, и набухание печеночных клеток (Liu et al., 2018). Повышенные уровни экспрессии генов окисления и детоксификации вместе с измененной гистопатологией, подтверждают, индуцируемые mitoxantrone повреждения печени у рыбок данио. Параллельное наблюдение усиления окисления GSH и снижение уровней печеночного АТФ в печени крыс после воздействия mitoxantrone давало сходные результаты с таковыми у рыбок данио (Rossato et al., 2014).
3.4. Carcinogen-induced liver injury
3.4.1. Thioacetamide (TAA)
Thioacetamide (TAA) растворимое в воде organo-sulfur соединение (класса 2B канцероген), вызывает выраженную гепатотоксичность. В исследовании трансгенная линия рыбок данио с L-FABP промотором была подвергнута воздействию 0.025% TAA с 72 hpf до 7 dpf. Немногие часы воздействия на эмбрионы TAA, как было установлено, достаточны для формирования апоптических телец, которые были наиболее очевидными у 5-dpf личинок. На 7 dpf апоптические тельца замещались некротическими массами, характерными для болезни. Обработанные TAA гепатоциты обнаруживали некроз с разными уровнями накопления жировых вакуолей, которые выталкивали ядро на периферию. Повышенная экспрессия адипогенных генов, adiponectin C1Q и collagen domain containing (adipoq); β-oxidation-связанных генов, peroxisomal 3-ketoacyl-CoA thiolase (ptl); а также первичных факторов транскрипции, ответственных за регуляцию синтеза липидов, напр., srebp1c, подтвердила эффект TAA на гомеостаз липидов. Умноженная экспрессия основных апоптических маркеров, напр., caspase 3, caspase 8, c-Jun N-terminal kinase (jnk 1), B-cell leukemia/lymphoma 2 (Bcl2)-associated agonist of cell death (bad), Bcl2-associated X, apoptosis regulator (bax) и p38a, выявила уровни апоптоза после TAA (Rekha et al., 2008). В др. сообщении, TAA в разных концентрациях воздействуя на 3-dpf личинок в течение 72 h, вызывал аномальный фенотип у личинок; TAA приводил к формированию нерегулярных ядер и накоплению капелек жира в гепатоцитах. Токсический эффект, как полагают, обусловлен усилением активности генов, связанных с адипогенезом и фиброзом. TAA также усиливает экспрессию апоптических генов (BH3-interacting domain death agonist [bid] и bax-2) и подавляет анти-апоптические гены (myeloid cell leukemia 1 [mcl-1b] и bcl2). Аналогичное сообщение получено при изучении млекопитающих (Zhang, 2014). Эти сообщения показывают, что TAA-индуцированные повреждения печени у рыбок данио могут быть прекрасной моделью для изучения гепатотоксичности и связанных с ней осложнений.
3.4.2. Diethylnitrosamine (DENA)
Diethylnitrosamine (DENA), органическое соединение, относится к группе 2A канцерогенов. Обнаружен в 1937, когда было замечен в качестве причины печеночных повреждений у людей (Freund, 1937), в дальнейшем был подтвержден его эффект на модели in vivo. Barnes и Magee (1954) установили, что даже одиночная оральная доза в 20-40 mg/kg веса тела DENA достаточна для его действия на печень как яда, в результате возникают тяжелые повреждения печени у крыс, мышей, собак, морских свинок и кроликов (Barnes & Magee, 1954).
Kang (2019) создали модель канцерогенеза печени в результате индукции с помощью DENA у личинок рыбок данио. Личинки рыбок данио (72 hpf) подвергались воздействию разных концентраций DENA в 25, 50 и 100 µg/mL. спустя 22 h после воздействия, личинки подвергали воздействию ApoFlamma H 675 (флуоресцентная краска) в течение 2 h и исследовали интенсивность флюоресцении. Воздействие DENA достоверно увеличивало её интенсивность в печени при 100 µg/mL благодаря клеточным повреждениям. Гистологически, гибель клеток, наблюдаемая в печеночном регионе, и некроз клеток в той же области обнаруживались с помощью мечения terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick-end. Флюоресценция in vivo и гистопатологические изменения подтвердили, что рыбки данио являются подходящей моделью для изучения канцерогенеза печени (Kang, 2019).
3.5. Heavy metal-induced and pesticide-induced liver injury
3.5.1. Arsenic
Мышьяк канцероген группы A, является прозрачным металовидным и двадцатым из наиболее распространенных элементов земной коры, находится на 12th месте по концентрации в теле человека. Это мощный внешне-средовой загрязнитель, представляющий большую угрозу для внешней среды и человечества (Smedley & Kinniburgh, 2002). Хроническое воздействие мышьяка хорошо известно своими гепатотоксическими эффектами, такими как жировое перерождение, патологическое увеличение печени, цирроз, первичные неоплазии и т. д. (Kumar et al., 2019).
Взрослые рыбки данио подвергались воздействию разных концентраций мышьяка (20-100 mg/L) в течение 96 h, это приводило к LC50 (конц., вызывающая летальность у 50% обработанных животных) в 256-320 µM. Это первоначальное изучение токсичности показало, что воздействие 192 µM мышьяка дает наилучшую долю жизнеспособности. Увеличивается повреждаемость печени при разном времени воздействия 8, 24, 48, 72 и 96 h после воздействия в 192 µM, демонстрируя быстрые повреждения ткани. Токсичность вызывает набухание клеток, аномальные формы клеток, истощение резервов гликогена и аномалии ядер, такие как karyomegaly, karyorrhexis и karyolysis в гепатоцитах. На молекулярном уровне гены, ответственные за белки, индуцируемые гипоксией, метаболизм мышьяка, антиоксидантную активность, повреждения ДНК, экспрессируются дифференциально. Вызываемые мышьяком повреждения печеночной ткани проявляются главным образом в виде повреждений ДНК и белков (Lam et al., 2006). Последствия мышьяковой токсичности на клеточную структуру, систему цитоскелета и т.д., плохо изучены у млекопитающих в отношении разных органов, т.е. головного мозга, печени, мочевого пузыря и кожи (Singh, Goel, & Kaur, 2011).
3.5.2. Tricyclazole Tricyclazole, популярный сельско-хозяйственный пестицид класса thiazoles, обычно используется для уничтожения грибковой инфекции во время плодоношения. Активное использование tricyclazole в качестве фунгицида связано с его био-накоплением в пищевой цепочке (Kong, Yu, Song, & Ren, 2018). Было проведено исследование на эмбрионах и взрослых трансгенных рыбках данио линии Tg (fabp10a:DsRed), чтобы оценить токсические эффекты tricyclazole. Эмбрионы подвергались воздействию разных конц. в 6.25, 12.5 и 25 mg/L в течение 3 дней, тnuта как взрослые получали 2.5, 5 и 10 mg/L tricyclazole в течение 28 дней. При наивысшей конц. (25 mg/L), эмбрионы рыбок данио обнаруживали скачкообразное развитие печеночного региона, уменьшение размера печени и подавление абсорбции желточного мешка. Печень формировала аберрантной формы гепатоциты с потерей контактов и с макро-вакуолями в противоположность плотным межклеточным контактам, хорошо удерживающими цитоплазму и хорошо известный ядерный регион в нормальной печени. Воздействие подавляло анти-апоптический ген (bcl2) и маркер дифференцировки холангиоцитов (sox9b); тогда как способствующие апоптозу гены обнаруживали повышенную экспрессию (bax, caspase-3, tumor necrosis factor alpha [tnfa] и p53). Взрослые рыбки данио (при 10 mg/L) также имели обрывистую и нерегулярную морфологию печени вместе с полным истощением резервов гликогена, снижением триглицеридов и повышением общего холестерина и уровней глюкозы в крови. Гены, ответственные за продукцию инсулина (insulin-degrading enzyme [ide], prolactin [prl]) и fatty acid synthesis (dgat1b) обнаруживали повышенную активность в противоположность снижению активности генов, ответственных транспортировку жирных кислот (acyl-CoA synthetase long chain family member 4 [acsl4] и lipoprotein lipase [lpl]) и метаболизм углеводов (calmodulin 3a [calm3a], pyruvate dehydrogenase [pdhxp], phosphogluconate 2-dehydrogenase [pgd] и malate dehydrogenase 1b [mdh1b]) (Qiu et al., 2019). Сходным образом, исследование на мышах с воздействием tricyclazole (50 mg/kg, внутрибрюшинно [i.p.]) описываются увеличенные уровни сывороточных (aminotransferase, alkaline phosphatase and total bilirubin) и пониженные уровни в сыворотке альбумина, указывающие на гепатотоксичность (Fattahi & Hemayatkhah Jahromi, 2016). Все результаты и наблюдения вместе подтверждают, что tricyclazole оказывает гепатотоксические эффекты, сходные с результатами гепатотоксичности у мышей.
3.6. Mycotoxins-induced liver injury Aflatoxin (AFB1) является вторичным грибковым метаболитом с хорошо известными гепатотоксическими и канцерогенными эффектами (Zuberi, Eeza, Matysik, Berry, & Alia, 2019). При использовании двух трансгенных линий рыбок данио [Tg(1-fabp: GFP-mCherry) и Tg(1-fabp: HBx-Cherry)] изучали гепатотоксические эффекты AFB1 у рыбок данио. Финальная конц. 0.15 µg/µL, с тотальным инъекционным объемом 10 µL, вводилась 2.75-мес. трансгенным рыбкам данио. Каждая рыбка весила ~0.5 g и получала 1.5 µg/10 µL раствора aflatoxin. Ткани печени забирали в разные интервалы (1, 3, 6, 9 и 12 недель после инъекции). По сравнению с контрольными рыбками данио Tg(1-fabp: GFP-mCherry), рыбки данио Tg(1-fabp: HBx-Cherry) , подвергшиеся воздействию AFB1, предоставили доказательства неуправляемой дегенерации и стеатоза с 3.0 по 5.75 мес. Mycotoxin приводил к фиброзу внеклеточного матрикса, усиленному накоплению гликогена и индукции апоптоза в печеночной ткани. Экспрессия липогенных факторов (pparγ, carbohydrate-responsive element-binding protein [chrebp] и srebp1) и факторов цикла деления клеток (cyclin A1 [ccna1], ccnab1, proliferating cell nuclear antigen [pcna], cyclin-dependent kinase 1 [cdk1] and cdk2) повышена на 9 и 12 неделе после инъекции (Lu et al., 2013). Сходным образом, результаты наблюдались при изучении мышей на 22 неделе, когда HBx трансгенные мыши обнаруживали гепатоцеллюлярные аденомы и повышенные уровни гликогена после воздействия AFB1 (Zhu, Wang, Chen, Cheng, & Xue, 2004).
3.6.2. Ochratoxin Ochratoxins, из категории mycotoxins, продуцируются различными видами грибов, напр., Aspergillus и Penicillin. Ochratoxin A (OTA) является ниболее подходящим, токсичный и активно исследуемый токсин из ochratoxins. Это известный загрязнитель злаковых, зерновых и др. сельско-хозяйственных продуктов (Csenki et al., 2019; Haq et al., 2016). Согласно некоторым исследованиям, OTA может вызывать тератогенные эффекты благодаря совй2 способности проходит через плаценту, создавая большие количества DNA-adducts в печени мышей, чьи матери были подвергнуты действию OTA (Hallen, Breitholtz-Emanuelsson, Hult, Olsen, & Oskarsson, 1998).
Исследование было проведено на дикого типа (WT)и трансгенных линиях рыбок данио [Tg (LFABP:EGFP)] с характерными флуоресцентными печеночными клетками, чтоабы определить токсичность OTA. Эмбрионы рыбок данио подверглись воздействию ряда концентраций 0.1, 0.25 и 0.5 µM OTA в течение 96 hpf. При конц. 0.25 µM OTA эмбрионы обнаруживали отек перикарда с непрозрачным желточным мешком. При наивысшей конц. (0.5 µM), наблюдалось двухкратное снижение транскрипционный реакции генов, ответственных за каскад каогуляции, напр., fibrinogen alpha chain (fga), fibrinogen beta chain (fgb), coagulation factor II, thrombin (f2), f7, f7i, f9b, f10, filaggrin (flg) и anticoagulant protein C (proc). Маркерные гены печени (vitronectin a [vtna], ceruloplasmin [cp]) mammalian hepatotoxic marker, т.е. miR-22, f7 и cp транскрипты обнаруживали пониженную экспрессию. Уменьшение размера печени с гепатоцитами, обнаруживающими крупноразмерные светлые вакуоли и ядра не периферии, с запавшими цитоплазматическими пространствами и увеличенным ядром по отношению к цитоплазме - это основные изменения, связанные с токсичностью OTA. Это ответственно за гепатотоксичность на ранних стадиях развития рыбок данио (Wu et al., 2018). Эти находки более или менее сходны с исследованиями, осуществленными на модельных грызунах, при этом оксидативные стрессы и некрозы в печени обнаруживались как результат вакуолизированной дегенерации, вызванной OTA (Aydm, Ozзelik, Cicek, & Soyцz, 2003; Nussbaum et al., 2013).
3.7. Ethanol-induced liver injury Алкогольная печень, нарушение, вызываемое избыточным потреблением алкоголя, это наиболее распространенная причина чувствительности к тяжелому печеночному стеатозу (Mann, Smart, & Govoni, 2003). При неконтролируемых условиях, стадия стеатоза будет в конечном счете прогрессировать в гепатоцеллюлярную карциному, приводящей к риску для здоровья по всему миру (Passeri, Cinaroglu, Gao, & Sadler, 2009).
Трансгенная линия Tg (lfabp10a:eGFP) рыбок данио была использована для понимания роли этанола, вызывающего жировое перерождение печени. Личинки в возрасте 96 hpf получали воздействие 2% этанола в течение 32 h. Гепатомегалический лордоз и тяжелое изнyрение в изгибе личинок было обычным у большинства личинок рыбок данио. Печеночная ткань также обнаруживала тяжелые накопления липидов и альтерации на уровне транскрипции генов, генов, связанных с метаболизмом жирных кислот (fabp10a) и гомеостазом (cyp2y3). Уровни cyp2y3 в печени являются индикатором ускоренного метаболизма алкоголя и повреждений печни, приводящих в результате к снижению метаболизма токсических веществ в теле. Воздействие этанола приводит также к митохондриальным оксидативным стрессам путем увеличения количества superoxide анионов из-за нарушений метаболизма липидов. Алкоголь также вызывает повреждения ДНК и апоптоз в ткани печени (Zhou et al., 2019).
У взрослых самцов рыбок данио воздействие 0.2% этанола вызывает печеночные повреждения после воздействия на рыбок в течение 4 недель. Ballooning печеночных клеток, умеренный фиброз и накопление липидов в гепатоцитах бли типичными изменениями в печени. Этанол повышает уровни алкоголя в крови на 0.175%, уровни глюкозы в крови в 1.3 раза и уровни triglycerol в 2.2-раза на 4 неделе. Уровни липогенных транскрипционных факторов (srebp1, srebp2 и cebpa) и др. генов, целиком связанных с липогенезом, а также с потреблением липидов, т.е. dgat2, fasn, low-density lipoprotein receptor (ldlr), lpl и carnitine palmitoyltransferase 1 (cpt1), заметно увеличиваются при воздействии этанола. Увеличение реактивных видов кислорода (ROS), оксидативные и митохондриальные стрессы являются критическими факторами при повреждениях печени, вызываемых этанолом. Все эти результаты подтверждают роль этанола в жироваом перерождении печени и гепатотоксичности (Park & Kim, 2019).
3.8. NAFLD
FIGURE 3 Schematic representation of the mechanism of high-calorie diet-induced liver damage. The various calorie-rich dietary factors escalate the formation of free fatty acids (FFAs) and activate de novo lipogenesis. The excess formation of FFAs leads to hepatic steatosis and lipo-toxicity. This alters the vital functioning of mitochondria resulting in augmented endoplasmic reticular stress, secretion of cytokines and oxidative stress. All these events activate stellate cells and the development of liver fibrosis. SREBP1c, sterol regulatory element binding transcription factor 1; ACC, acetyl-CoA carboxylase; ATP, adenosine triphosphate; CPT1a, carnitine palmitoyltransferase 1A; ddit3, DNA damage inducible transcript 3; FAS, fatty acid synthase; gpx1, glutathione peroxidase 1; grp78, glucose-regulated protein 78; IL-1Я, interleukin 1Я; IL-6, interleukin 6; keap1, Kelch ECH-associating protein 1; trxR2, thioredoxin reductase 2; TNF-alpha, tumor necrosis factor- alpha; TGF-Я, transforming growth factor-beta
3.8.1. High-fructose diet
Фруктоза или фруктовый сахар является простым кетонным моносахаридом, обнаруживаемым в основном в растениях. Высокое потребление фруктозы ассоциирует с появлением печеночного стеатоза (Hebbard & George, 2011). Изучение животных моделей с повышенным содержанием фруктозы в пище показало, что это способствует липогенезу, формированию ROS, тяжелому фиброзу и увеличению сердечно-сосудистых заболеваний (Koteish & Diehl, 2002). Капельки жира можно видеть у прозрачных личинок рыбок данио при использовании окраски oil Red O (Figure 4).
FIGURE 4 Showing fructose-induced in situ fat accumulation in the liver of zebrafish larva stained with Oil Red O. (A) Normal liver of larva; (B) Liver with Oil Red O stained fat droplets
Sapp et al. (2014) установили пищевую модель NAFLD у рыбок данио. Личинки рыбок данио на 5-dpf подвергались воздействию 4% фруктозы и 4% глюкозы вплоть до 7 dpf. Личинки на 7 dpf обнаруживали накопление в печени липидов в при воздействии фруктозы. Наблюдался фенотип, идентичный неалкогольному стеатозу печени (NASH) у 4% в группе воздействия фруктозой, заметные изменения в экспрессии генов, что согласуется с запуском воспаления, оксидативных и ER стрессов. Воздействие фруктозы также увеличивает экспрессию мишеней антител pS6 у обработанных личинок. Эти сообщения подтверждают роль фруктозы в возникновении вызываемого диетой NASH (Sapp et al., 2014). В сходном исследовании взрослых рыбок данио, подвергнутых действию 6% фруктозы ежедневно, выявлено образование тяжелых отложений печеночных липидов (Ferrari et al., 2018). Фруктоза также была описана как участник возникновения кишечного бактериального избыточного роста, что в дальнейшем приводит к активации Kupffer клеток и воспалению в печени (Hebbard & George, 2011). Исследование также предоставило новую информацию по использованию рыбок данио в разработке определенных параметров, таких как молекулярные исследования, гликемия, высокой плотности липопротеины и др. биохимических маркеров. Эта модель может предоставить выгоды в будущем для высокопроизводительного скрининга, чтобы прицельно воздействовать на разные гены модификаторы и многие потенциальные воздействия.
3.8.2. High-cholesterol (HC) diet Диета с HC обычно используется, чтобы индуцировать NAFLD у грызунов. Личинок 8-dpf кормили диетой, содержащей 5% w/w HC. В первую неделю не обнаружено заметных различий в смертности и морфологии, однако, в последующие периоды на второй и третьей неделе величина смертности повышается и толщина живота становится шире, чем в норме. Метаболический профиль личинок выявил повышенные уровни холестерина и триглицеридов во время 2-й и 3-й недели и повышенное накопление липидов в абдоминальной области. Диета с HC также, по-видимому, индуцирует образование ROS, метаболических оксидативных стрессов и изменения в активности malondialdehyde (MDA) и superoxide dismutase (SOD). В ткани печени, 50% macro-везикулярный стеатоз с образованием четких липидных капель в печеночных клетках, подтверждая развитие NAFLD (Ma et al., 2019).
Сходным образом, личинки рыбок данио, питаемые диетой, богатой 5% w/w холестеролом, образуют аномальные отложения липидов в печени и сосудах хвоста с повышенным уровнем холестерина после 7 дней. Повышение экспрессии липогенеза (srebf1 и fasn), воспаления (tnfa, interleukin 1 β [il1 β] и il6), фиброза (matrix metalloproteinase [mmp9]) и генов, связанных с оксидативными стрессами (Kelch-like ECH-associated protein 1 [keap1]) и снижение экспрессии генов, понижающих липиды (pparab, cpt1a and pparγ) также подтверждают развитие болезни. Потребление HC, как было установлено, оказывает выраженное влияние на регуляторы метаболизма глюкозы и чувствительность к инсулину. Все эти факторы имеют отношение к возникновению NAFLD. Тяжесть печеночного стеатоза после кормления HC-диетой подтверждается тем фактом, что избыточное потребление с пищей холестерина приводит к тяжелым печеночным повреждениям или углублению печеночной недостаточности (Ahmad et al., 2019).
3.8.3. Overfeeding induced
Избыточное кормление вызывает избыточное потребление пищи, связанное с энергией, необходимой телу. Это приводит к ожирению и родственным нарушениям печени, таким как NAFLD. Состав пищи играет критическую роль в прогрессировании этой болезни. Избыточное питание 5-dpf личинок рыбок данио (180 mg/day) в течение 10 дней приводит к развитию жирового перерождения печени. Увеличение веса тела, некроз гепатоцитов, накопление печеночного жира с образованием малых и больших липидных вакуолей и выраженного сосудистого стеатоза, были самыми крупными изменениями. Избыточное кормление повышает уровни триглицеридов, общего холестерина и глюкозы. Уровни экспрессии мРНК изменены для некоторых генов, сцепленых с жировым метаболизмом (srebf1, lipin1, lipin2, chrebp, cell death-inducing DFFA-like effector C [cidec]), метаболизмом глюкозы (glucose transporter 1 [glut1], glut2, insulin receptor substrate 1 [irs1], irs2, phosphoenolpyruvate carboxykinase [pepck]), окислением липидов (ppara, cpt1a), воспалением (tnfa, interferon regulatory factor 2a [irf2a], nuclear factor Κ-light-chain-enhancer of activated B cells [nfkb]), оксидативными (glutathione peroxidase 1a [gpx1a], gpx1b, thioredoxin reductase 2 [trxr2]) и ER стрессами (DNA damage inducible transcript 3 [ddit3], glucose-regulated protein 78 [grp78]). Пониженные уровни факторов, сцепленных с липидами (srebf1, lipin1) и метаболизмом глюкозы (irs2a), отстаивают тот факт, что перекармливание может подавлять образование эндогенных липидов. Перекармливание было также описано как влияющее на жирные кислоты и метаболизм α-linolenic кислоты и передачу сигналов PPAR (Ma et al., 2019). Перекармливание вызывает тяжелый печеночный стеатоз, указывающий на высоко-калорийную диету, повышающей накопление жира в печени. Эта модель может вносить вклад в дальнейшее понимание корреляции между перееданием и ожирением с повреждением печени и открывает важную возможность для поиска соотв. терапевтических продуктов.
3.8.4. High-fat diet
Диета с высоким содержанием жира была использована для индукции NAFLD у грызунов. Диета с высоким содержанием жира (30 mg/day) для 5-dpf личинок рыбок данио 7 или 10 дней приводила к возникновению липидных капель в гепатоцитах, указывая на жировое перерождение печени. Спустя 10 дней диета с высоким содержанием жира увеличивала триглицериды, свободный холестерин и уровень общего холестерина. Далее, гены, сцепленные с ER стрессами (activating transcription factor 6 [atf6], heat shock protein Family A member 5 [hspa5] and hsp90b1), липолизисом (pparab, cpt1a и peroxisomal acyl-coenzyme A oxidase 3 [acox3]) и воспалением (il6) имели повышенные уровни. Однако, гены, ассоциированные с липогенезом (acetyl-CoA carboxylase alpha [acaca], fasn, srebf2, 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA synthase 1 [hmgcs1] и 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase a [hmgcra]) были подавлены в обеих временных точках. Показатели печеночных повреждений были значительно более тяжелые при повышенном потреблении пищи с высоким содержанием жира. Исследование показало, что постоянное потребление пищи с высоким содержанием жира вызывает печеночный стеатоз за счет нарушения липидного метаболизма и нарушений регуляции в ER (Dai et al., 2015). Эта модель обладает высоким потенциалом скрининга лекарств для NAFLD.
4 GENETIC MODELS OF ZEBRAFISH FOR LIVER DISEASES
Многие исследователи сообщали о разных генетических моделях рыбок данио с естественными или искусственно созданными мутациями генов, связанных с болезнями печени. Эмбрионы рыбок данио и взрослые были успешно использованы для разных генетических скринингов, таких как инъекции microRNA, Morpholino технологии и т.д. (Hyde, Godwin, & Thummel, 2012; Thummel et al., 2006). Детали трансгенных и мутантных модельных рыбок данио приведены в Table 2.
< a href="https://analyticalsciencejournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jat.4031#jat4031-tbl-0002">
TABLE 2. List of various mutant and transgenic zebrafish models of liver diseases
4.1. Transgenic models
Рыбки данио с преднамеренной инсерцией чужеродного гена в свой геном наз. трансгенными. Много трансгенных линий рыбок данио описано, пригодных для изучения развития печени, болезней желчных протоков, стеатоза, NAFLD и гепатоцеллюлярной карциномы. L-FABP и liver-specific red fluorescent protein (DsRed RFP) трансгены были использованы для изучения развития печени, васкулогенеза и трафика и метаболизма внутриклеточных жирных кислот во время развития печни у рыбок данио (Her et al., 2003; Korzh et al., 2008). Исследование, описавшее развитие печеночных звездчатых клеток и роли клеток синусоидального эпителия и их расположение у трансгенных рыбок данио (Yin et al., 2012). Исследование также описало роль трансгенных рыбок данио в понимании молекулярных механизмов билатерального развития, атрезии желчного пузыря, холестаза (Lorent et al., 2010). Shieh et al. (2010) сообщили, что белок hepatitis B virus X (HBx) , преобразованный у рыбок данио приводит к жировому перерождению печени путем усиления активности адипогенных генов (srebp1, c/ebp-a, and chrebp). Исследование, проведенное на взрослых рыбках данио с использованием трансгенной конструкции pLF2.8-GK для получения gankyrin трансгенных рыбок данио. Молекулы gankyrin это маленькие с ankyrin-повторами онкобелки с избыточной экспрессией в гепатоцеллюлярной карциноме. Жизнеспособные взрослые трансгенные рыбки данио обнаруживали изнурение, повышенное содержание печеночных липидов и стеатоз. Избыточная экспрессия gankyrin у трансгенных рыбок данио усиливает активность генов, ответственных за липидный метаболизм (srebp-1c, pparγ и c/ebpa), мембранных транспортеров жирных кислот (slc25a10 and slc35b4), белков, связывающих жирные кислоты (fabp6) и транслоказы жирных кислот (FAT)/CD36. Печеночные microRNAs (miR-16, miR-27b, miR122 и miR126) также были обнаружены разрегулированными в печени трансгенных рыб. Эти находки подтвердили, что избыточная экспрессия белка gankyrin также ответственна за печеночные повреждения, которые в дальнейшем могут прогрессировать в гепатоцеллюлярную карциному (Her et al., 2011). Та же самая группа сообщила о двух др. модельных трансгенных рыбках данио, обнаруживающих печеночный стеатоз в результате усиления активности специфичного для печени cannabinoid receptor 1 (CB1R) и yin yang 1 (YY1) (Her et al., 2013; Pai et al., 2013). CB1R индуцирует экспрессию srebp-1c, тогда как YY1 усиливает активность главных липогенных генов (c/ebp-a, pparγ и srebp-1c), приводя к отложению жира в гепатоцитах. Др. трансгенные рыбки данио, полученные благодаря экспрессии мутации рецептора fibroblast growth factor (Fgf) в гепатоцитах, были использованы для изучения печеночного стеатоза. Репрессия передачи сигналов Fgf ведет к нарушениям печеночного гомеостаза и приводит к возникновению ожирения печени (Tsai et al., 2013). Многие сообщения подтвердили роль модельных трансгенных рыбок данио в понимании различных молекулярных путей возникновения гепатоцеллюлярной карциномы и для поиска противоопухолевых лекарств. Трансгенные рыбки данио, постоянно экспрессирующие kras(V12) обнаруживают 100% развитие опухолей в печени после индукции с помощью mifepristone спустя 4 недели после воздействия и обнаруживают роль передачи сигналов Ras (Nguyen et al., 2012). TET-контролируемая система активация транскрипции (Tet-on) была использована для индукции печень-специфического онкогена xiphophorus melanoma receptor kinase (xmrk), a hyperactivated epidermal growth factor receptor (Li et al., 2012), liver-specific expression of mouse Myc (Li et al., 2013) и liver-specific oncogene krasg12v для индукции рака печени у рыбок данио (Chew et al., 2014). Экспрессия активированной формы эффектора Yap1 (also known as YAP) effectorin пути Hippo у рыбок данио приводило к гепатомегалии и развитию печеночных опухолей (Cox, Hwang, et al., 2016).
4.2. Mutant models
Разные мутантные модельные рыбки данио представлены в Table 2. Первые рыбки данио моделировали печеночный стеатоз были foie gras (fgr) мутантными рыбками данио. Печень таких мутантов обнаруживала дегенерацию ядер, поврежденные клетки и накопление жира в гепатоцитах. Белок Fgr у рыбок данио сцеплен с трафиком из ER в Golgi и любая мутация ведет к ER стрессу, приводя к печеночному стеатозу. Более того, та же самая группа сообщила о neurofibromin 2 (nf2) и vacuolar protein sorting protein 18 (vps18) мутантах с choledochal кистами и гепатомегалией, соотв. (Asaoka, Hata, Namae, Furutani-Seiki, & Nishina, 2014; Sadler et al., 2005). Мутантное перемещение через канальцы (ducttrip (dtp)) возникает в результате химического мутагенеза, характеризуется дисфункций митохондрий, печеночным стеатозом и усилением активности генов tnfa и pparγ genes (Matthews et al., 2009). Инактивация CDP diacylglycerol-inositol 3-phosphatidyltransferase (cdipt) инсерции гена устраняет синтез phosphatidylinositol, приводя к ER стрессам, стеатозу, раздуванию и дегенерации гепатоцитов у hi559 мутантов (Thakur et al., 2011). Существует множество др. мутантных модельных рыбок данио, используемых для изучения печеночного стеатоза (Table 2) (Gu et al., 2014; Hugo et al., 2012; Kim et al., 2015; Liu et al., 2016; Matthews et al., 2009; Monk et al., 2013; Nussbaum et al., 2013; van der Velden et al., 2011). Ген adenomatous polyposis coli (APC) участвует в развитии и регенерации, а venантные по APC рыбки данио используются для изучения путей развития печени и регенерации (Goessling et al., 2008). Мутантные рыбки данио использованы для изучения гепатоцеллюлярной карциномы (Cox, Tsomides, et al., 2016; Evason et al., 2015; Mudbhary et al., 2014) и желчных болезней (Pham & Yin, 2019).
5 SCREENING OF HEPATOPROTECTIVE COMPOUNDS ON ZEBRAFISH Этиология печеночных повреждений обширна и детально обсуждена в этом обзоре; однако, разные соединения были проверены в отношении их активности по защите печени у модельных рыбок данио. Список соединений у рыбок данио обнаруживающих достоверную защитную функцию для печени представлен в Table 3. North et al. (2010) описали усиление гепатотоксичности acetaminophen с помощью NAC у взрослых рыбок данио. Воздействие acetaminophen (10 mM) вызывает истощение резервов GSH, повышение уровней aminotransferase, увеличение гибели печеночных клеток и индуцированное синусоидальное расширение с воспалением печени. Воздействие NAC конц. 10 µM elexiftn печеночный фенотип за счет сужения синусов и уменьшения воспалительной реакции. Heptametoxyflavone (HMF) выделенный из сорняка ( Sphaeranthus amaranthoides) был протестирован на эффект защиты печени при индуцируемых acetaminophen повреждениях печени у эмбрионов и взрослых рыбок данио. Параметры такие как задержка скорости роста, низкая скорости вылупления, изгибы очертаний тела, плохое развитие печени, поведение быстрого плавания и смертность, индуцируемые acetaminophen, эффективно ослаблялись с помощью воздействия HMF в конц. 20 µg/L. Это ещё больше улучшало уровни маркеров повреждения печени, анти-оксидативных энзимов, снижало печеночный некроз и подавляло экспрессию разных способствующих апоптозу и апоптических генов (bcl2, bax, caspase-3 and tnfa) (Swarnalatha, 2017). В др. исследовании классический гепатоцеллюлярная омолаживающая Siddha медицинская система (Sanjeevni Theener), была протестирована в отношении защитного потенциала (150 and 300 mg/L) при индуцированных с помощью paracetamol повреждениях печени у взрослых рыбок данио. Воздействие Sanjeevni Theener при обеих дозах снижало вакуолизацию цитоплазмы и повреждения печени, индуцированные paracetamol (Vinayak et al., 2018).
TABLE 3. Various compounds screened in zebrafish model for hepatoprotective potential
Исследования сообщают об эффектах caffeine при повреждениях печени от переедания у личинок рыбок данио. Личинок кормили разными количествами (20, 30, 60, 80, 120 и 180 mg/day) и затем подвергали воздействию caffeine (2.5%, 5% и 8%). Воздействие Caffeine заметно снижало большой вес тел, уровни триглицеридов и экспрессию генов, связанных с накоплением печеночного жира, супрессируя развитие печеночного стеатоза (Zheng et al., 2015). В недавнем исследовании биоактивное соединение gastrodin, извлеченный из Gastrodia elata оценивали как защиту от возникновения индуцированной с помощью HC NAFLD. Скармливание HC диеты (5% w/w) вызывало NASH-подобный фенотип у личинок рыбок данио. Воздействие gastrodin treatmen (10, 25 и 50 mg/L) нормализовало регуляцию липидов, модулировало экспрессию генов, ответственных за гомеостаз липидов и снижало оксидативные повреждения (Ahmad et al., 2019).
Phlorotannins (phloroglucinol, eckol and dieckol) из Ecklonia cava бы оценен в отношении индуцируемых этанолом (4%) повреждений печни у рыбок данио (Kang et al., 2013). Из них, dieckol (10 и 20 µM) обнаруживал наиболее существенную защиту путем улучшения изгиба рыб и величины выживаемости. Эффект был в основном обусловлен предупреждением генерации ROS , переокисления липидов и клеточного апоптоза (Kang et al., 2013). Недавно, naringin, присутствующий в грейпфруте flavanone был исследован в отношении терапевтического потенциала против индуцируемого этанолом печеночного стеатоза у личинок рыбок данио. Личинки подвергались воздействию 2% этанола, а затем их лечили восходящими дозами naringin (6.25, 12.5 и 25 mg/L). Воздействие naringin в принципе улучшало искривление личинок и снижало индуцируемый этанолом печеночный стеатоз. Терапевтический эффект был наивысшим и вызывал почти полное восстановление (Zhou et al., 2019).
Была исследована защитная роль silymarin при вызываемых curcumin печеночных повреждениях у эмбрионов рыбок данио. Воздействие curcumin в конц. 7.5 и 12.5 µM снижало долю выживших эмбрионов. Однако, воздействие silymarin снижало накопление curcumin внутри тела личинок (Shiau et al., 2011).
6 POTENTIAL ADVANTAGES AND COMPLICATIONS OF ZEBRAFISH За и против модельных организмов рыбок данио приведены в Table 4. Рыбки данио это позвоночные, хорошо изучены как средство для изучения болезней людей, т.к. обладают физиологическими и анатомическими аспектами высших организмов. Преимуществами являются непродолжительное время развития и созревания, хорошо разводятся, содержание довольно дешево, прозрачность личинок, и отсутствие этических ограничений. Развитие эмбрионов быстрое, спустя 5 dpf почти все органы развиты. Эмбрионы прозрачны и прекрасно подходят для изучения действия токсинов, определенных химических соединений, печеночных канцерогенов и т.д. (Goessling & Sadler, 2015). У личинок рыбок данио можно снимать клеточные и цитоплазматические перемещения (Goldsmith & Jobin, 2012). Возможны детальные исследования развития органов, клеточных взаимодействий и определенных реакций в ответ на воздействие токсина. Полностью картированный геном рыбок данио подтверждает участие разных генов в болезнях людей (Shin et al., 2005). Возможна количественная оценка энзимов сыворотки, визуальная и экспериментальная оценка биомаркеров сыворки, а также оценка гистопатологии. Ограниченность геномных дупликаций делает модельных рыбок данио неподходящими для генетического скрининга и исследований генотоксичности. Отсутствие разработанных культур эмбриональных стволовых клеток создает критические состояния для их исследований in vitro. Отличающаяся клеточная архитектура и микроанатомия печеночной системы значительно ослабляет по сравнению с модельными грызунами. Менее законсервированная физиология и морфогенез рыбок данио по сравнению с модельными грызунами и млекопитающими являются основными препятствиями их использования для биомедицинских исследований. Все за и против создают вместе вполне пригодную модель для мониторинга результатов действия токсинов или химических соединений в реальном времени в лабораторных условиях (Engeszer, Patterson, Rao, & Parichy, 2007; Gerhard, 2003).
< a href="https://analyticalsciencejournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/jat.4031#jat4031-tbl-0004">
TABLE 4. Pros and cons of zebrafish as a model in biomedical research
Существуют и др. небольшие модельные рыбки, напр., medaka ( Oryzias latipes) и fathead minnow fish ( Pimephales promelas), которые используются для биомедицинских исследований в качестве модельных организмов. Medaka является довольно хорошо разработанной моделью для генетического скрининга или генетики развития и др. биомед. исследований. Она обладает определенными сходствами с такого же размера рыбками данио; короткое время жизни поколения, легкость содержания, низкие затраты и оптическая прозрачность на на эмбриональных стадиях. Пол medaka хорошо различим в противовес рыбкам данио, однако, рыбки данио обладают высокой плодовитостью (100-200 eggs/spawning) по сравнению с medaka (10-30 eggs), которые также нуждаются в специфическом субстрате для нереста (Wittbrodt, Shima, & Schartl, 2002; Polacik, Blaћek, & Reichard, 2016). The fathead minnow являются умеренными пресноводными рыбками (7-10 cm длиной), они в основном используются для тестирования токсичности водных соединений, разработки количественных моделей взаимоотношений структура-активность и т.д. (Ankley & Villeneuve, 2006; Saari, Schroeder, Ankley, & Villeneuve, 2017). Основной причиной отставания этой модели является задержка с определением генома fathead minnow (Burns et al., 2016).
7 FUTURE PROSPECTIVE OF USING ZEBRAFISH The increased demand for animal models for drug screening is reported worldwide (Farghali, Kemelo, Wojnarovб, & Canova, 2016). The main animals employed for such studies are rats, mice, rabbits etc., which are far larger than some other small models. Still, due to some limitations principally with respect to cost, time expended, sample size and moral constraints, these models become disadvantageous. However, in vitro cell models used to determine bio-safety and drug toxicity lack the efficacy and translational attributes of a whole animal model. Zebrafish being an amenable model for the evaluation of drug toxicity presents a strong in vivo preclinical tool for analyzing the harmful effects and potency of a wide range of drugs. The relevance of zebrafish model for biomedical research is relatively impactful rather than the other rodent models because it has less ethical constraints, high fecundity, transparent embryos and very well-defined developmental stages (Vargas, Sarmiento, & Vбsquez, 2015). This animal model allows rapid detection, with adequate and reliable monitoring of the toxic effects. Also, the homology of its molecular pathways with the human makes it an excellent alternative model for preclinical studies. The evolving role of zebrafish as a model to compute neuro-, geno-, cardio-, and hepatotoxicity of drugs reflects its potential advantage over the other animal models corresponding to the concept of the ‘3Rs’ (replacement, reduction and refinement). Another asset for considering the zebrafish model as an useful tool is the ease it provides in genome editing, operating new mutagenesis techniques such as Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas9, which will make it feasible in future studies to pair human genetic mutations with their molecular roles (Yuan, Bai, Luo, Wang, & Zhang, 2015). In the upcoming era of biomedical research, it is expected that the scientific community will encourage the use of zebrafish for further experimental studies of development and drug screening. All the above features in conjunction with each other will advance the use of zebrafish as an innovative, comprehensive and cost-effective experimental model for liver-related studies as well as genetic screening.
|