Опухоли представлены гетерогенной смесью клеток, которые различаются по своему генетическому эпигенетическому состоянию. Разрастание соотв. генетических субклонов хорошо известный механизм устойчивости к лекарствам [1] , а недавние работы подчеркнули, что генетические субклоны могут быстро адаптироваться за счет динамических альтераций с участием внехромосомной ДНК [2, 3]. Более того, преходящие эпигенетические изменения или переходы между клеточными состояниями, позволяющие персистировать опухолевым клеткам во время воздействия лекарств описан на нескольких моделях рака [4-7]. Относительные вклады этих соотв. моделей и то, как они кооперируются, чтобы обеспечить устойчивость к лекарствам при раке, остается критическим вопросом (Fig. 1a).

Fig. 1 Barcode lineage tracing identifies alternative modes of drug resistance in patient-derived gliomaspheres. a Schematic depicts models of drug resistance involving outgrowth of fit genetic subclones or broadly induced cell state transitions that confer tolerance. b Schematic depicts lineage barcoding strategy wherein cells are lentivirally transduced with a unique barcode that is transcribed, enabling its identification by gDNA sequencing or scRNA-seq. c Experiment #1 design notates four replicates of GSC8 cells treated with the PDGFRA inhibitor dasatinib and the timepoints at which barcode abundances were analyzed by gDNA sequencing. d Barplots depict relative abundances of the top 20 lineages in each Experiment #1 replicate after 70 days of dasatinib treatment, per gDNA sequencing. The barcode ID of the dominant lineage in each replicate is indicated. e Dotplots depict relative abundances of indicated barcode lineages at successive timepoints in the different Experiment #1 replicates. Each plot shows data for a different lineage barcode that corresponds to the top lineage identified at day 70 in one of the replicates (see panel d). The data show that each jackpot lineage was specific to one replicate. f-h Similar representation as in panels c-e for six replicates of Experiment #2. The data indicate that a single "jackpot" lineage (e86vac) outgrew in all replicates in Experiment #2, including at earlier timepoints

Генетические субклоны и гетерогенный паттерн метилирования ДНК внутри опухоли были охарактеризованы с помощью методов секвенирования [8-10]. Избыточный рост предшествует возникновению субпопуляций с резистентностью к лекарствам подтверждается использованием ДНК штрих-кодов на моделях опухолей [11]. Эпигенетические способы воздействия на резистентность также были установлены [12, 13]. Однако, целостная оценка предсуществующих и динамических эпигенетических и генетических механизмов лекарственной устойчивости, остаются важной целью, нуждающейся в новых методах.

Воздействие на резистентность является первостепенной задачей в случае GBM, которая неизбежно возникает вновь после воздействия [14, 15]. Хотя эти опухоли часто обладают RTK амплификациями, терапия, нацеленная на RTKs, не удается в клинике [16]. GBMs поддерживаются субпопуляциями клеток, подобных стволовым клеткам, которые обнаруживают тенденцию быть довольно устойчивыми к терапии [18]. Поэтому мы пытаемся разработать стратегию для оценки взаимодействия между генетическими и эпигенетическими механизмами резистентности к RTK ингибитору в глиомасферах (gliomaspheres). Мы сфокусировались на модели PDGFRA-амплифицируемых глиомасфер, в которых субнабор клеток способен противостоять подавлению PDGFR с помощью принятия состояния медленных делений, которое зависит от Notch и является обратимым [7]. Мы полагаем, что более продолжительное по времени состояние резистентности к dasatinib клеточных популяций может зависеть от как от эпигенетических сохраняющихся фенотипов, так и от благоприобретенных генетических событий. Мы разработали, оптимизировали использование комбинации подходов single-cell RNA-seq (scRNA-seq) и отслеживания клонов.

Здесь мы комбинировали высокой сложности систему клонального штрих-кодирования (barcoding) с scRNA-seq, чтобы исследовать механизмы, с помощью которых PDGFRA-зависимые подобные стволовым GBM клетки приобретают устойчивость к подавлению PDGFRA. Данные выявляют замещающие др. др. механизмы резистентности, участвующие в генетических и эпигенетических альтерациях (Fig. 5i). Устойчивая амплификация локуса IRS2, который обеспечивает быстрый рост в присутствии dasatinib, может уже предсуществовать в глиомасферах, полученных от пациентов, и она выявляется в первичных GBMs и др. опухолях ещё до лечения [35] (Fig. 4a). Более изменчивые альтерации количества копий с локуса IRS1 также облегчает быстрый рост и способствует возникновению de novo устойчивости во время воздействия лекарств. Наконец, быстрое обратимое persister состояние поддерживает жизнеспособность субнабора клеток с помощью эпигенетических механизмов. Notch-позитивные persister-подобные клетки уже присутствуют в первичных опухолях [7] и могут формировать связи между GBM клетками в ходе раннего воздействия вплть до возникновения генетических альтераций, вызывающих полную резистентность к лекарствам.

Эти результаты являются важным основанием для проверки гипотезы, что сохранение эпигенетических характеристик и генетических амплификаций совместно могут вносить вклад в возникновение резистентности к ингибиторам RTK или др. целенаправленным терапиям. Сохраняемые эпигенетические характеристики были охарактеризованы как гибкая, обратимая фаза реакции на терапию [4-7]. Далее следует отметить, что генетически отличающиеся субклоны, несущие амплификации IRS1, также обладают определенной степенью обратимости резистентности к dasatinib, которая может зависеть от количества копий и пока не установленных факторов. Т.о., определенные генетические альтерации м. составлять др. слой динамической адаптивности при раке, как отмечено в недавней работе профилирование быстрой адаптации посредством внехромосомной ДНК [2, 3, 46]. Дальнейшая характеристика множественных слоев эпигенетической и генетической гибкости у моделей относительно реакции на воздействия может помочь рациональной разработке терапевтических подходов, которые адресованы как обратимой, так и необратимой фазам реакции на терапию.

Оценка клинических примеров завершенных и продолжающихся клинических испытаний [47,48,49] д. быть приоритетной, чтобы определить вклад экспрессии IRS1/2 в чувствительность к терапии. Кроме того, ожидаемая оценка вклада избыточной экспрессии IRS1/2 в исходы у пациентов и в агрессивность опухолей в отсутствие воздействия RTK поможет в дальнейшем выявить механистическую специфичность этих амплификаций в опухолях пациентов.

Комбинация высокой сложности штрих-кодирования вместе с single-cell RNA-seq позволяет идентифицировать амплификации количества копий IRS2 и IRS1 в качестве новых генетических медиаторов резистентности к dasatinib в модели PDGFRA-амплифицированных глиомасферах в дополнение к транскрипционной характеристике промежуточной Notch-high эпигенетической популяции persister. Получена важная информация о том, как эти чередующиеся режимы толерантности к лекарствам и резистентности к лекарствам могут действовать, чтобы преодолеть терапию и вызывать неизбежный рецидив болезни.

Плазмида pBA439 получена от Jonathan Weissman (Addgene plasmid # 85967) [51] и была модифицирована, чтобы удалить промотор mU6 с помощью NotI т HpaI рестрикционного переваривания и self-ligation после воздействия Klenow (NEB M0210S). Получившаяся модифицированная pBA439HN плазмида была использована в качестве остова для генерации библиотеки штрих-кодов (barcode).

Чтобы генерировать полу-случайные штрих-кодовые вставки, были закуплены синтетические oligos oligoF (ATGCCGTCTCCCTAGGACTGACTGCAGTCTGAGTCTGACAGWSWSWSWSWSWSWSWSWSWSWSWSWSWSWSAGCTACGCACTCTATGCTAGTGCTAG; W = adenine or thymine and S = guanine or cytosine) и oligoR (gcatcgtctcGAATTCCTAGCACTAGCATAGAGTGCGTAGCT) в IDT. Эта WSx15 полу-случайная последовательность, обозначена как "lineage barcode." OligoF и oligoR были annealed и двунитчатые олигонуклеотиды были сгенерированы с помощью extension реакции с Phusion High-Fidelity DNA полимеразы (NEB). Сочетаемые концы были сгенерированы путем воздействия объединенной дуплексной barcoded вставки и вектора с AvrII и EcoR1. Библиотека объединенных вставок была затем субклонирована в рестрикционно переваренные векторы pBA439HN. Обработанные рестрикционными энзимами pBA439HN и штрих-коды двунитчатых oligos были смешаны в соотношении 1:4 вектор:вставка с ~4 х 10¹¹ переваренными молекулами вектора, связанного с T4 DNA ligase (NEB) при 16 C , а связанные с лигандами продукты были очищены с помощью DNA clean & concentrator 5 kit (Zymo research). Примерно 25% очищенных связанных с лигандами продуктов было трансформировано в ElectroMAX Stbl4 клетки (Thermo Fisher Scientific), и клетки были помещены на пластинки ampicillin/LB agar. Все помещенные на пластинки колонии были pooled и собраны, а полученная в результате библиотека плазмид была очищена с помощью HiSpeed Plasmid Maxi Kit (Qiagen). Очищенная библиотека плазмид была секвенирована и результаты отфильтрованы, как описано ниже, обнаруживая разнообразие штрих-кодов в 1.056 миллион с 2 или большим количеством reads/barcode.

Для стабильного включения конструкций, штрих-кодирующих клоны, объединенная pBA439 библиотека плазмид трансфицировалась совместно с psPAX2 (Gift of Didier Trono, Addgene plasmid # 12260) и VSV. G плазмиды (Gift of Tannishtha Reya, Addgene plasmid # 14888) в соотношении 3:2:1 вводили в 293T клетки, используя FuGENE HD (Promega) посредством manufacturer's instructions. Среда изменялась спустя 6 ч и клетки культивировали в течение 3-х дней. Затем вирусный supernatant был собран и для концентрации использовался Lenti-X concentrator (Clontech) согласно инструкциям изготовителя и был подсчитан MOI для вирусных препаратов с помощью серии разбавляющих воздействий GSCs и оценивалась экспрессия tagBFP с помощью проточной цитометрии. Для каждой реплики приблизительно 1 х 10⁶ GSCs помещали в подходящую для стволовых клеток монослойную культуру с laminin (5 µg/mL Engelbreth-Holm-Swarm laminin, Sigma) и были инфицированы концентрированным вирусом при MOI из 10% в течение 24 ч перед отбором GSCs с инкорпорированным штрих-кодом с использованием puromycin (0.5 µg/mL, Life Technologies) в течение 72 ч.

Эквивалентные количества (1 х 10⁶) стабильно трансдуцированных barcoded клеток помещали на пластинки в виде реплик и обрабатывали 1 µM dasatinib. каждую пластинку пассировали и обрабатывали независимо без перекрестных загрязнений между репликами.

Согласно ранее описанному протоколу [11], обработанные dasatinib клетки, содержащие библиотеку клональных штрих-кодов, были собраны и подсчитаны в определенные промежутки времени. Genomic DNA (gDNA) была подготовлена с помощью QIAmp DNA blood mini Kit (Qiagen). Клональные штрих-коды были амплифицированы для multiplexed next-generation sequencing (NGS) секвенирования с использованием праймеров, несущих Illumina adaptor и index последовательности. PCR амплификация штрих-кодов была осуществлена для половины gDNA, выделенной из каждой реплики и в определенный момент времени. PCR амплификация осуществлялась с помощью одной или нескольких реакций, чтобы обеспечить равную амплификацию штрих-кодов; вплоть до 2 µg геномной ДНК было использовано в качестве матрицы для каждой PCR реакции с Titanium Taq DNA polymerase (Clontech) согласно инструкциям производителя. Амплифицированные ДНК объединяли, если осуществлялись множественные PCRs для данной выборки, а выборки очищали с помощью QIAquick PCR purification columns (Qiagen). Tapestation HS D5000 (Agilent) анализ был использован, чтобы верифицировать частоту и размер индексированных PCR продуктов и определяли количества с помощью Qubit dsDNA HS (Thermo Fisher) перед использованием multiplexed NGS Illumina секвенирования на базе NextSeq500 instrument (Illumina). Read 1 was sequenced 38 bp (or longer) with a custom spike-in primer (CACTGACTGCAGTCTGAGTCTGACAG) with 8 bp i7 sequencing read. PhiX was added as about 10% of the total reads. Between 2.8 and 10.2 million reads were generated for each library (Supplementary Table S1). Амплификация и секвенирование библиотеки плазмид со штрих-кодами осуществлялось сходным образом.

Fastq файлы от секвенирования библиотеки штрих-кодов оценивали с помощью высоко-качественного считывания штрих-кодов с помощью фильтрации, чтобы учитывать только те считывания, которые соответствовали ожидаемому паттерну WSx15 (see "Barcode Plasmid Library Construction" for details on semi-random barcode design). Такой паттерн последовательностей был идентифицирован, по крайней мере, в 86.4% считываний в каждой выборке. Большинство считываний, содержащих ошибочные последовательности (включая инсерции или делеции одиночных оснований), отфильтровывались на этой ступени, т.к. не соответствовали ожидаемому паттерну. Эта первоначальная ступень фильтрация осуществлялась с использованием grep unix команд. Дальнейший анализ суммированных последовательностей штрих-кодов был проделан с использованием R языка программирования [52]. Мы применили в вычислительном отношении эффективный метод фильтрации добавленных извне последовательностей, которые, скорее всего, содержат ошибки. Для каждой последовательности мы идентифицировали все 30 возможные последовательности с совпадением одиночных оснований (i.e., a Hamming distance of 1). Если одна из этих 30 последовательностей наблюдалась чаще, чем оригинальная последовательность, то оригинальная последовательность отфильтровывалась как, скорее всего, отражающая ошибочную последовательность. Такой подход не только удалял ошибки секвенирования одиночных оснований, но и также множественные ошибки секвенирования оснований, которые в свою очередь менее часты, чем ошибки одиночных оснований (illustrated in Supplementary Fig. 1d). После фильтрации, около 2766 и 88469 уникальных штрих-кодов было выявлено для разных выборок (более 10 sequencing reads), что существенно варьировало в избытке (top lineage изобилие между 0.1 и 88.5%; детальная информация по каждой выборке представлена в Supplementary Table S1). Определение лежащей в основе сложности штрих-кода в библиотеке плазмид осуществлялось сходным образом с использованием двух секвенирований считываний на каждый штрих-код.

Nanowell-based выделение, индексация и секвенирование транскриптома отдельных клеток осуществлялось, как это уже было описано [27, 53]. Короче, Accutase-диссоциированные и отфильтрованные GSCs были подсчитаны и 10000 одиноных клеток было помещено в Seq-Well nanowell array из ~ 90000 колодцев с предварительно загруженными кусочками, несущими олигонуклеотиды, содержащими primer-связывающие последовательности, идентификатор клеточного штрих-кода, UMI и oligo-dT последовательность (Chemgenes). Множество (array) было запечатано частично проницаемой поликарбоновой мембраной (Sterlitech Custom Order), клетки были лизированы в закупоренных колодцах, а мРНК были гибридизированы с олигонуклеотидами-сконъюгированными кусочками (beads). После высвобождения и объединения всех кусочков из множества, была осуществлена обратная транскрипция с помощью Maxima H-RT (Thermo) и матрицы, переключающей oligo (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATrGrG+G, Exiqon). Воздействие с помощью exonuclease I (NEB) было осуществлено до амплификации всего транскриптома (WTA), используя 2x KAPA HiFi Hotstart Readymix (KAPA) и SMART PCR праймер (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT, IDT). Проводились AMPure SPRI bead cleanup (0.6X, Beckman Coulter) и был использован Nextera XT tagmentation kit (Illumina), чтобы подготовить секвенирование индексированных библиотек с P5-SMART-Hybrid primer (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACGCCTGTCCGCGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT*A*C) и barcoded N70X primer для идентификации выборок (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXXXGTCTCGTGGGCTCGGAGATGT) из IDT. Библиотеки были затем секвенированы с использованием изготовленного на заказ Read1 праймера (GCCTGTCCGCGGAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC) на NextSeq500 instrument (Illumina). Затем спецификации были использованы для секвенирования paired-end: 20 bp для read 1 (containing 12 bp cell barcode information и 8 bp UMI), 8 bp для i7 index и 64 bp для read 2 (содержащего часть транскрипта). Fastq файлы были сгенерированы для каждой библиотеки, используя bcl2fastq для учета даже одного совпадения с ожидаемыми штрих-кодами библиотеки. Идентификация клеточных штрих-кодов, genome alignment, и количественное определение уровней генной экспрессии для каждой одиночной клетки осуществлялось так, как это было описано ранее [53], используя splice-aware aligner STAR version 2.6.0c [54] и версию R языка программирования 3.3.0 [52]. Для последующего анализа мы сохраняли клетки высокого качества с, по крайней мере, с 2500 UMIs и нормализованной экспрессией значений по отношению к целому до 10000 на клетку до log-transformation (after addition of 1).

Часть (20%) WTA материала была использована для обогащения PCR клональный штрих-код-содержащих транскриптов, чтобы эффективно связать клеточные штрих-коды, как это было описано ранее [53]. PCR осуществлялось с использованием Titanium Taq Polymerase (Clontech) и P5-SMART PCR Hybrid PCR и Biotin-R18 Oligo (/5Biosg/GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCATAGAGTGCGTAGCT) из IDT. Cycling parameters were as follows: ... После секвенирования спаренных концов, считывания были преобразованы с использованием клеточных штрих-кодов, идентифицированных в соотв. Seq-Well библиотеке, как было описано ранее [53].

Подобно происходящим из генома библиотекам штрих-кодов, секвенирование считываний библиотек штрих-кодов, происходящих из транскриптома оценивали по высокого качества клональным штрих-кодам. Считывания сначала отфильтровывали, чтобы включать только те считывания, которые начинаются с последовательности мишени из biotinylated primer (CATAGAGTGCGTAGCT), это сопровождалось определением WSx15 паттерна. Эта инициальная ступень фильтрации осуществлялась с использованием grep unix command. Дальнейший анализ суммарных клональных штрих-кодов (аннотированных с помощью клеточного штрих-кода и UMI) осуществлялся с использованием R языка программирования версии 3.3.0 [52]. Мы отфильтровывали последовательности в соответствии со следующими 5 критериями: (1) Комбинация клеточного штрих-кода, UMI и клонального штрих-кода определялась, по крайней мере, в 20 reads. (2) Клональный штрих-код был идентифицирован в происходящих из генома библиотеках любой из 4-х реплик в день 0 в соотв. эксперименте. (3) Клеточный штрих-код совпадал в клетках высокого качества с соотв. Seq-Well библиотекой. (4) Для данной клетки комбинация штрих-кода и UMI, по крайней мере, в 95% считываний представляет одиночный клональный штрих-код. (5) Сходным образом, для данного клеточного штрих-кода, по крайней мере, 95% считываний представляет собой single клональный штрих-код. Используя эти критерии, 1268 из 3012 высокого качества одиночных клеток (42.1%) совпадали с определенным клональным штрих-кодом....