Врожденные дефекты или врожденные аномалии являются серьезной угрозой здоровью во всем мире. Они остаются одной из основных причин младенческой смертности и несут значительные медицинские, хирургические или пожизненные потери трудоспособности (Mai et al., 2019). В целом, врожденные аномалии затрагивают ~3-5% живорожденных (Bower, Rudy, Callaghan, Quick, & Nassar, 2010; Centers for Disease Control and Prevention, 2008; Harris et al., 2017; Texas Birth Defects Registry, 2016). В широком смысле существуют две основные категории врожденных пороков развития: (а) структурные врожденные пороки, которые влияют на структуры тела (например, расщелина губы/нёба, пороки сердца, косолапость, дефекты нервной трубки, spina bifida), и (б) функциональные или врожденные пороки развития, которые связаны с изменениями в работе органов и включают дефекты нервной системы (например, синдром Дауна, синдром Прадер-Вилли, синдром Хрупкой Х), а также сенсорные (слепота, глухота), метаболические (фенилкетонурия, гипотиреоз) и дегенеративные (мышечная дистрофия, Х-сцепленная адренолейкодистрофия) нарушения (https://www.nichd.nih.gov/). Врожденные пороки развития связаны с множеством модифицируемых и не-модифицируемых факторов риска. Помимо выявления новых генетических вариантов и хромосомных аномалий, исследователи обнаружили тесную связь между дефицитом фолиевой кислоты у матери, ожирением, сахарным диабетом до беременности, фенилкетонурией и злоупотреблением алкоголем/наркотиками с повышенным риском врожденных дефектов (Basu & Garg, 2018; Nora et al., 1969; Oyen et al., 2016). Двадцать восемь процентов всех основных врожденных аномалий составляют пороки сердца (Dolk, Loane, Garne, & European Surveillance of Congenital Anomalies Working, 2011; van der Linde et al., 2011). Имеющиеся данные подтверждают, что животные модели представляют собой отличную систему для воспроизведения клинического фенотипа и изучения причин, лежащих в основе пороков сердца. Эти модели не только позволяют идентифицировать гены, необходимые для нормального кардиогенеза, но и представляют собой легкодоступные системы для раскрытия развивающих, патофизиологических и молекулярных механизмов, лежащих в основе таких неблагоприятных исходов при рождении. Однако современные исследования врожденных пороков развития ограничены исследованиями на иммортализованных клеточных линиях и/или экспериментальных моделях. За последнее десятилетие мы стали свидетелями всплеска исследований, направленных на изучение тканей, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSCs), способных к производству специализированных клеток сердца. Эти исследования активно мобилизуются для скрининга лекарственных препаратов с целью обеспечения прямой пользы для пациентов. В этом обзоре мы делаем акцент на современном моделировании CHD и сердечно-сосудистых заболеваний на основе hiPSC, которые обладают огромным потенциалом для раскрытия патологии заболевания и разработки терапии. Мы рассмотрим состояние моделирования CHD с использованием hiPSCs, поскольку они являются важным инструментом для изучения механизмов возникновения этих дефектов и способствуют разработке новых подходов к профилактике.

CHD - самый частый врожденный порок, поражающий ~2-3% новорожденных, включая изолированный двухстворчатый аортальный клапан (BAV) (Houyel & Meilhac, 2021; Nees & Chung, 2020; Pierpont et al., 2018; van der Linde et al., 2011), и является основной причиной детской заболеваемости и смертности. CHD состоят из дефектов сердечной архитектуры, которые нарушают венозный дренаж, образование перегородок между сердечными сегментами и их последовательности, а также регулярную функцию клапанных аппаратов (Thiene & Frescura, 2010). Исходя из этой анатомической и патофизиологической классификации, наиболее распространенные типы CHD можно разделить на: (а) дефекты формирования перегородки, включая ventricular septal defects (VSD), atrioventricular septal defects (ASD) и дефекты атриовентрикулярной перегородки (AVSD), (б) conotruncal defects (CTD), к которым относятся тетрада Фалло (ТФ), персистирующий артериальный ствол (PTA), двойной выход правого желудочка (DORV), двойной выход левого желудочка, прерывание дуги аорты (IAA) transposition of the great arteries (TGA) (в) лево- и правосторонние обструктивные дефекты отводящих путей (LVOTO, RVOTO), и (г) дефекты латеральности, также известные как дефекты эмбрионального формирования лево-правосторонней оси , которые варьируют от изолированной декстрокардии или situs inversus abdominis до situs inversus totalis или гетеротаксии (HTX). (Anderson, Tretter, Spicer, & Mori, 2019; Bruneau, 2008; Garg, 2006; Lin et al., 2014; Lin, McBride, Garg, & Zhao, 2021; Neeb, Lajiness, Bolanis, & Conway, 2013; Sanders & Geva, 2018; Shapiro et al., 2014; Stefanovic, Etchevers, & Zaffran, 2021).

CHD фенотипически неоднородны, ~30% из них включают аномалии, влияющие на развитие outflow tract (OFT), таким образом, составляя большой класс конотрункальных CHD. Большинство этих пороков OFT требуют хирургического вмешательства в течение первого года жизни и обычно имеют плохой прогноз (Erikssen et al., 2015). Среди левосторонних CHD выделяют пороки LVOTO, к которым относятся синдром гипопластического левого сердца (HLHS), комплекс Шоне, врожденный стеноз аортального клапана (AS), коарктация аорты (CoA) и BAV (Parker & Landstrom, 2021). Эти пороки могут проявляться изолированно или как часть определенного синдрома; однако не-синдромальные пороки часто наблюдаются у нескольких членов семьи, что связано с высоким риском повторения у братьев и сестер. Хотя некоторые известные тератогенные воздействия, цитогенетические аномалии и нарушения одиночных генов составляют небольшую часть случаев LVOTO, точная этиология этой редкой и тяжелой формы CHD неизвестна. Синдромы, проявляющиеся CHD, могут быть обусловлены нарушениями дозирования хромосом (трисомия 21, синдром Тернера), крупными хромосомными делециями (делеция 22q11 или синдром Ди Джорджа, приводящий к отсутствию TBX1), мелкими микроделециями (синдром Вильямса-Бюрена, приводящий к мутациям в гене ELN), или дефекты одиночных генов (синдромы Марфана (FBN1), Холта-Орама (TBX5), Алагиля (JAG1 или NOTCH1), Нунан (PTPN11, SOS1, RAF1, KRAS, BRAF, MEK1, MEK2 и HRAS), синдром CHARGE (CHD7 и SEMA3E)) (Fahed & Nemer, 2012). Помимо описанной выше классификации структурных CHD, еще одно состояние, приводящее к внезапной сердечной смерти, известно как синдром удлиненного интервала QT (LQTS). Это часто фатальный наследственный синдром аритмии, вызванный либо генетическими мутациями (врожденный LQTS), либо воздействием лекарств (приобретенный LQTS) (Wu et al., 2019). Врожденный LQTS поражает ~1 из 2000 живорожденных. LQTS в первую очередь характеризуется удлинением интервала QT на электрокардиограмме, аномальной морфологией волны Т, предрасположенностью к обморокам, остановке сердца и внезапной смерти. Генетическое происхождение синдромных CHD, большинства кардиомиопатий и сложных не-синдромных структурных CHD установлено и рассмотрено в других работах (Fahed & Nemer, 2012; Pierpont et al., 2018; Saliba et al., 2020; Ware & Jefferies, 2012; Wu et al., 2019; Yotti, Seidman, & Seidman, 2019).

Развитие платформ секвенирования нового поколения позволило выявить многочисленные генетические варианты и хромосомные делеции, но во многих случаях патогенность или ген(ы), лежащие в основе фенотипического разнообразия, остаются неясными. В одном из последних отчетов говорится о том, что анализ секвенирования всего генома позволяет выявить не-кодирующие варианты, которые влияют на экспрессию генов, ассоциированных с CHD, и которые способствуют возникновению ~55% необъяснимых случаев CHD (Morton, Quiat, Seidman, & Seidman, 2022). Несмотря на наличие сильной генетической основы CHD, факторы риска окружающей среды (например, воздействие предсуществующего диабетического состояния матери, загрязнители воздуха, жара, метаболический синдром, инфекции) все чаще признаются важными факторами, способствующими развитию CHD (Basu et al., 2017; Basu & Garg, 2018; Bekkar, Pacheco, Basu, & DeNicola, 2020; Oyen et al., 2016; Ramlakhan, Johnson, & Roos-Hesselink, 2020; Wu et al., 2020; Xia et al., 2019). Недавний прогресс в генной инженерии с помощью CRISPR/Cas9, в методах визуализации сердца с высоким разрешением и одноклеточная или пространственная транскриптомика раскрыли механизмы развития сердца и происхождения некоторых CHD. Параллельно обширные исследования генотип-фенотипа, генов окружения с использованием моделей животных и hiPSCs расширили наше понимание молекулярных путей и генов-кандидатов, вовлеченных в развитие и заболевание сердца.

Системы моделей заболеваний in vivo и in vitro являются важными инструментами для понимания патогенеза CHD, прогрессирования, основных молекулярных механизмов, а также для тестирования доклинических терапевтических вмешательств (Рисунок 1). Некоторые из лучших моделей, повторяющих фенотип заболевания человека, являются экономически эффективными, легко создаваемыми и поддающимися генетическим или фармакологическим манипуляциям. Для изучения этапов развития сердца и происхождения подтипов CHD были созданы многочисленные животные модели наряду с использованием систем первичных и иммортализованных клеточных культур. Эти модели варьируют от Drosophila melanogaster (плодовая мушка), Danio rerio (зебрафиш) и Gallus gallus (цыпленок) до мелких (мыши и крысы) и крупных млекопитающих (овцы, собаки и свиньи). Модели in vivo, хотя и полезны, но ограничены для изучения генетики развития CHD, и иногда трансгенные мыши, несущие человеческие варианты, не воспроизводят аналогичные клинические фенотипы CHD (Majumdar, Yasuhara, & Garg, 2021). Вероятно, это связано с межвидовыми различиями в содержании их генома и физиологии сердечно-сосудистой системы. Например, между кардиомиоцитами из моделей мелких животных и кардиомиоцитами человека существуют значительные различия, включая скорость биения, энергетику, состав миофиламент, экспрессию ключевых ионных каналов, электрофизиологию и циклические изменения Ca2+. Эти различия в физиологии существенно минимизированы между человеком и крупными животными моделями, такими как не-человекообразные приматы (Dixon & Spinale, 2009; Karakikes, Ameen, Termglinchan, & Wu, 2015); однако эти модели менее идеальны из-за стоимости содержания, продолжительности необходимого времени и этических проблем, связанных с их использованием. Последнее десятилетие показало, что полученные от пациента hiPSC представляют собой уникальную платформу для изучения генетических механизмов CHD и сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку они сохраняют всю генетическую информацию больного человека. Модели заболеваний были и будут играть важную роль в изучении молекулярных основ развития и заболеваний сердца (Houser et al., 2012). Знания, полученные при изучении трансгенных животных и трансформированных клеточных линий, уже были успешно применены для понимания нескольких врожденных пороков развития человека, включая CHD, модели in vitro, таких как hiPSCs.



FIGURE 1 In vivo and in vitro model systems and approaches to study human CHD: Schematics (left panel) describe the well-characterized model organisms used to study cardiac development and origin of human heart defects. They range from nematode worm (Caenorhabditis elegans), fruit fly (Drosophila Melanogaster), zebrafish (Danio rerio), frog (Xenopus laevis), mouse (Mus Musculus) to human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Genetically engineering model organisms were mostly used to study the genetic and environmental risk factors underlying human CHD. Schematics (right panel) show how coalition of next-generation genome/exome sequencing, epigenomic, single-cell transcriptomics, proteomics, and metabolomic approaches identify causal genes and their cell-type-specific function underlying human CHD (Created in BioRender)

Важной научной вехой стало получение iPSCs мыши и человека путем генетического перепрограммирования соматических клеток посредством эктопической экспрессии четырех транскрипционных факторов, известных как OSKM (OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC) (Takahashi et al., 2007; Takahashi & Yamanaka, 2006). hiPSC обычно генерируются из соматических клеток пациента или донора, то есть из дермальных фибробластов, адипоцитов, мононуклеарных клеток периферической крови и зубной ткани (Churko, Burridge, & Wu, 2013; Loh et al., 2009; Sugii et al., 2010; Takahashi et al., 2007; Yan et al., 2010). Исследования лаборатории Yamanaka и других ученых показали, что, хотя культуры iPSC мыши, зависящие от лейкемического ингибирующего фактора (LIF), и hiPSC, основанные на basic fibroblast growth factor (bFGF), отличаются друг от друга, их основа для трансформации с помощью OSKM оказалась идентичной. С тех пор для создания hiPSCs было разработано несколько методов доставки факторов перепрограммирования, включая, в частности, индуцибельные лентивирусы, мРНК, эписомы ДНК, пептиды и не-интегрирующие вирусы (например, Sendai) (Hu, 2014). Различные методы перепрограммирования, их преимущества и ограничения были подробно рассмотрены в других источниках. (Hu, 2014; Liu, David, Trawczynski, & Fessler, 2020).

С тех пор как доктора Takahashi и Yamanaka в своих фундаментальных исследованиях сообщили о создании hiPSC, сообщество биомедицинских исследователей быстро использовало эту бесценную технологию для получения новых знаний о молекулярных механизмах редких сложных заболеваний - от спинальной мышечной атрофии, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона и сердечно-сосудистых заболеваний (Davis, van den Berg, Casini, Braam, & Mummery, 2011; Ebert и др, 2009; Israel et al., 2012; Itzhaki et al., 2011; Musunuru, Domian, & Chien, 2010; Shi, Inoue, Wu, & Yamanaka, 2017; Soldner et al., 2009; Theodoris et al., 2021; Zanella, Lyon, & Sheikh, 2014). Ключевым моментом в этом прорыве стал поиск осуществимого пути получения типов клеток, специфичных для пациентов и заболеваний человека, которые надежно моделируют и воспроизводят заболевания человека в условиях in vitro (рис. 2). Несмотря на важные достижения последнего десятилетия, болезни сердца остаются основной причиной смерти в развитых странах. Исследовательские усилия были направлены на использование hiPSCs для моделирования CHD человека in vitro, а также для изучения развития и регенерации сердца для его восстановления. На сегодняшний день технология hiPSC была использована для моделирования нескольких генетически обусловленных семейных и спорадических случаев CHD у человека, а также системных заболеваний, сопровождающихся пороками сердца (Таблица 1 и Таблица S1). Были созданы модели заболеваний ASD, VSD, AVSD, стеноза легочной артерии (Ang et al., 2016; Kathiriya et al., 2021; Ye et al., 2021), HLHS (Miao et al., 2020; Paige et al., 2020), ToF (Grunert et al., 2020), LQTS (Itzhaki et al., 2011; Moretti et al., 2010), синдром Барта (Wang, McCain, et al., 2014), кальцифицированная болезнь аортального клапана или CAVD (Theodoris et al., 2015; Theodoris et al., 2021), синдром LEOPARD (Carvajal-Vergara et al., 2010), синдром Тимоти (Yazawa et al., 2011), катехоламинергическая полиморфная желудочковая тахикардия (Sleiman et al., 2020), семейная дилатационная кардиомиопатия, некомпактность левого желудочка или LVNC (Gifford et al., 2019; Hinson et al., 2015; Kodo et al., 2016), аритмогенная кардиомиопатия правого желудочка или ARVC (Caspi et al., 2013; Kim et al., 2013; Zhou et al., 2020) и заболевание Na+ каналов сердца (Davis et al., 2012). Результаты этих исследований подчеркивают важность комплексного профилирования линий hiPSC для выявления генетического, экологического и метаболического вклада в развитие CHD и последующего биомедицинского применения.

FIGURE 2 Workflow for hiPSC generation and differentiation from patients' somatic cells and major applications to human cardiovascular disease: The schematic represents the complete workflow of generating human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from patients/donors with heart defects and downstream applications. Clinically relevant and patient-specific somatic cells are obtained (with consent) and dedifferentiated to a pluripotent state by overexpressing four reprogramming factors, OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC (OSKM). The hiPSCs are expanded and differentiated into cardiac progenitor cells such as first and second heart field (FHF and SHF) by progressive induction of primitive streak mesoderm and cardiac committed mesodermal cells. These cells then generate beating cardiomyocytes (CM), endothelial/endocardial cells (ECs), vascular smooth muscle cells (SMCs) and fibroblasts (FB) based on a cocktail of chemical stimulation. The hiPSC-derived cardiac cell types play an important role in clinical care of patients with CHD and hereditary cardiac disorders. These iPSC-CMs, ECs, SMCs can be profiled using molecular phenotyping techniques, electrical and mechanical measures, and response to different therapeutic agents. Upon functional characterization of the disease variants (cell type specific) and environmental exposures, this data can assist in clinical decision-making, such as providing inputs on predicting severity of disease, family screening, associated risks, and response to targeted therapy. CHD = congenital heart disease, CVD = cardiovascular disease, CRISPR = clustered regularly interspaced short palindromic repeats (Created in BioRender)



TABLE 1. Current hiPSC models for studying mechanisms of heart defects

Сердце - один из первых органов, развивающихся у эмбрионов позвоночных. Во время гаструляции эмбрион дифференцируется на три слоя: эктодерму, мезодерму и эндодерму. Передние мигрирующие мезодермальные клетки добавляются между слоями клеток эктодермы и эндодермы в примитивном полоске, где в основном располагаются клетки-предшественники сердца (Meilhac & Buckingham, 2018). Сигналы от соседних клеточных популяций способствуют дальнейшей индукции сердечной мезодермы, а эндодерма, по-видимому, выполняет высоко-консервативную инструктивную функцию в процессе кардиогенеза (Brand, 2003; Meilhac & Buckingham, 2018; Mummery et al., 2012; Olson, 2006). Чтобы воспользоваться этими предварительными знаниями и перспективами одноклеточного транскриптомного ландшафта органогенеза млекопитающих и атласов экспрессии генов плода (Cao et al., 2019; Cao et al., 2020; Nomaru et al., 2021), важно создать надежные и эффективные протоколы дифференцировки для получения различных типов кардиологических клеток, представляющих интерес. Чтобы иметь возможность получать различные субпопуляции сердечных клеток из hiPSCs, необходимо понять, как они развиваются в раннем эмбрионе. Картирование судьбы клеток и исследования нацеливания генов в грызунах и птичьих моделях позволили получить важные сведения о происхождении различных областей сердца и показали, что многие сердечные клетки происходят из различных популяций предшественников (первое и второе поле сердца, FHF и SHF, соответственно), которые определяются на ранних стадиях развития (Francou & Kelly, 2016; Kelly, Buckingham, & Moorman, 2014; Meilhac & Buckingham, 2018; Waardenberg, Ramialison, Bouveret, & Harvey, 2014). Были описаны протоколы получения различных клеточных линий из hiPSCs с переменным успехом. В большинстве случаев дифференцировка hiPSCs in vitro повторяет поэтапные стадии развития сердца. В данном обзоре мы уделяем особое внимание дифференцировке hiPSCs в кардиомиоциты (CMs), фибробласты (ФБ), эндокардиальные/эндотелиальные клетки (ЭК) и гладкомышечные клетки (ГМК). Кроме того, мы обсуждаем исследования по моделированию заболеваний с использованием hiPSCs и то, как спасение вызывающих заболевания мутаций было достигнуто с помощью надежных методов редактирования генома (рис. 2 и 3).



FIGURE 3 Schematic of cardiac lineage differentiation from hiPSCs: The key stages of in vitro hiPSC differentiation are indicated: induction of cardiac mesoderm, specification of cardiac progenitor cells (first and second heart field, FHF, SHF) and differentiation of cardiomyocytes (CMs), endothelial cells (ECs), smooth muscle cells (SMCs) and fibroblasts (FB). Several transcription factors, growth factors, and signaling pathways involved in directing differentiation of hiPSCs to mesodermal progenitor cells and subsequent cardiac cell lineages are indicated. (Created in BioRender)

(a) Генерация hiPSC в кардиомиоциты (CMs): Дифференцировка в CMs из hiPSCs была достигнута путем модуляции сигнальных путей, которые участвуют в развитии сердца во время эмбриогенеза, например, bone morphogenetic proteins (BMPs), nodal/activin А, факторов роста фибробластов (FGFs) и репрессоров канонических сигнальных путей Wnt/β-катенин и сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF) (Evans, Yelon, Conlon, & Kirby, 2010; Noseda, Peterkin, Simoes, Patient, & Schneider, 2011; Olson, 2006). За последнее десятилетие в исследованиях с различными модельными организмами имитировались эндогенные сигнальные пути развития для генерации hiPSC-CMs. Наиболее воспроизводимые и эффективные методы дифференцировки hiPSC в кардиогенный путь основаны на определенной и временной манипуляции сигнальными путями Wnt (Wnt3a, Dickkopf-related protein [DKK-1]) и трансформирующего фактора роста (TGF-β), активина А и BMP2/4 (Kattman et al., 2011; Lian et al., 2012; Zhang et al., 2012). Сообщалось о нескольких комбинациях этих факторов роста и малых молекул для улучшения воспроизводимости и эффективности протоколов дифференцировки iPSC->CMs, а также созревания CMs (Breckwoldt et al., 2017; Burridge et al., 2014; Galdos, Darsha, Paige, & Wu, 2021; Garbern et al., 2020; Karakikes et al., 2015; Parikh et al., 2017; Zhao, Ye, Su, & Garg, 2020). В большинстве исследований были получены hiPSC-производные CMs со структурными и биохимическими характеристиками, напоминающими ранние, "незрелые" CMs человека. Незрелые CMs демонстрируют менее организованные саркомерные структуры и механизмы обработки кальция (Ca2+), характеризующиеся низкой экспрессией связанных с созреванием саркомерных генов (например, MYL2, MYH7, TCAP, MYOM2) и генов, связанных с транспортом ионов (например, KCNJ2, RYR2) (Funakoshi et al., 2016; Ivashchenko et al., 2013). В отличие от них, "зрелые" CMs переходят в вытянутую и анизотропную форму, развивают хорошо организованную саркомерную структуру и подвергаются переключению изоформ (TNNI1 ->TNNI3 и MYH6 -> MYH7). Считается, что эта незрелость CMs ограничивает возможность моделирования некоторых аспектов генетических сердечных заболеваний позднего возраста, таких как каналопатии при LQTS, синдроме LEOPARD и кардиомиопатии при ARVC, где нарушены зрелые и соединенные между собой CMs. Впоследствии были предприняты многочисленные попытки изменить стандартные протоколы и вызвать созревание CMs (Yoshida & Yamanaka, 2017). Например, Feyen et al. разработали среду с низким содержанием глюкозы и высоким содержанием окислительных субстратов, в которой наблюдалось усиленное созревание вентрикулоподобных hiPSC-CMs в двух- и трехмерных (2D и 3D, соответственно) культурах (Feyen et al., 2020). Эти данные свидетельствуют о том, что эти метаболические субстраты играют ключевую роль в улучшении созревания CMs и должны повысить достоверность hiPSC-CMs для моделирования сердечных заболеваний типа LQTS и ARVC. Для моделирования CHD в фундаментальных исследованиях было описано, как hiPSC-произведенные CMs, полученные от пациентов с вызывающими заболевание вариантами факторов транскрипции сердца (например, GATA4, GATA6, TBX5), нарушают транскрипционную кооперативность и регуляторную сеть генов (GRN), что приводит к аберрантному состоянию хроматина и клеточной дисфункции (Ang et al., 2016; Kathiriya et al., 2021; Nieto-Marin et al., 2021; Sharma et al., 2020). Например, человеческая миссенс-мутация GATA4-G296S, ранее связанная с ASD, VSD, AVSD и стенозом легочной артерии (PS), позже была обнаружена у пациентов с кардиомиопатией замедленного типа (Garg et al., 2003; Misra et al., hiPSC-произведенные CMs, полученные от пациентов с этим гетерозиготным вариантом, продемонстрировали нарушение сократимости CMs, обработки Ca2+ и метаболической активности (Ang et al., 2016). (Table 1). Объединение анализов РНК-последовательности и доступности хроматина (ATAC-seq) в контрольных (без заболевания) и мутантных (с заболеванием) hiPSC-CMs выявило нарушения в экспрессии и дисрегуляции генов хроматина, необходимых для развития атриовентрикулярного канала, формирования эндокардиальных подушек и морфогенеза перегородки в GATA4 G296S hiPSC-CMs. Аналогичным образом, используя аллельную серию линий hiPSC-клеток с потерей функции TBX5, Kathiriya и др. продемонстрировали дискретные изменения экспрессии генов c разрешением в одну клетку, которые реагируют на снижение дозы TBX5 в субпопуляциях CMs. Модель гаплонедостаточности TBX5 в hiPSC показала чувствительную от дозы потребность в этом гене для дифференцировки и функционирования CMs желудочков человека (Kathiriya et al., 2021). Кроме того, анализ одиночных клеток с помощью РНК-секвенирования выявил предполагаемые сердечные GRNs, генетическое взаимодействие Tbx5 и Mef2c которые были подтверждены у мышей, воспроизводящих фенотип мышечного VSD. Эти исследования показывают, что hiPSCs могут быть надежно использованы в качестве модели in vitro для понимания клеточных инцидентов, приводящих к CHD человека.

HiPSCs были разработаны для моделирования генетически обусловленных сердечных заболеваний человека, включая синдром Нунан, семейную дилатационную кардиомиопатию, LVNC, катехоламинергическую полиморфную желудочковую тахикардию ARVC, LQTS, LEOPARD и синдром болезни Na+ каналов (Zanella et al., 2014). Эти заболевания проявляются пороками развития определенных структурных компонентов сердца, сигнальных путей и/или электрофизиологических свойств. Например, синдром Нунан является одним из наиболее распространенных генетических заболеваний, связанных с CHD и гипертрофической кардиомиопатией (HCM) с ранним началом (Roberts, Allanson, Tartaglia, & Gelb, 2013). Аутосомно-доминантные мутации в генах, кодирующих регуляторы пути RAS-MAPK, составляют более 90% всех случаев синдрома Нунан. К ним относятся PTPN11, SOS1, RAF1, RIT1, KRAS, NRAS, RRAS, SHOC2, PPP1CB и CBL (Hanses et al., 2020). Моделирование RAS-патий с помощью hiPSCs позволило частично изучить эти генетические врожденные нарушения, однако молекулярный патогенез, лежащий в основе ассоциированной кардиомиопатии, остается неясным (Jaffre et al., 2019). В недавнем исследовании сообщалось о семье с двумя братьями и сестрами, в которой наблюдалась аутосомно-рецессивная форма синдрома Нунан с тяжелой формой HCM с обструкцией OFT, вызванной сложной гетерозиготной мутацией в leucine zipper-like transcription regulator 1 (LZTR1) (Hanses et al., 2020). iPSC->CMs, специфичные для пациента, воспроизвели фенотип HCM и выявили причинно-следственную связь между дисфункцией LZTR1, накоплением RAS, гиперактивностью передачи сигналов RAS-MAPK, гипертрофическим ответом генов и клеточной гипертрофией. Фармакологическое лечение блокаторами кальциевых каналов или ингибиторами MEK не смогло значительно ослабить клеточную гипертрофию в LZTR1-дефицитных iPSC-CMs. Однако CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование интронного донорского сплайс-сайта, как было показано, устраняет фенотип HCM у iPSC-CMs пациентов, тем самым открывая персонализированную и переводимую терапевтическую стратегию (Hanses et al., 2020). Приблизительно у 85% пациентов с синдромом LEOPARD наблюдается наиболее распространенное угрожающее жизни сердечное проявление, приводящее к HCM (Gelb & Tartaglia, 2007). hiPSC-произведенные CMs, полученные от пациента с синдромом LEOPARD с патологической мутацией PTPN11, продемонстрировали увеличение размера CMs и саркомерной организации, связанное с изменениями в кальциневрин-опосредованной гипертрофической передаче сигналов (Carvajal-Vergara et al., 2010). При врожденном LQTS нарушение обусловлено аберрантным удлинением времени реполяризации сердца, что приводит к повышенному риску развития полиморфной желудочковой тахикардии и внезапной сердечной смерти у молодых людей. Генетические исследования связывают LQTS с мутациями в калиевых (K+) и натриевых (Na+) каналах (KCNQ1, KCNH2, SCN5A), приводящими к потере их функции (Itzhaki et al., 2011; Moretti et al., 2010; Nieto-Marin et al., 2021). hiPSC-производные CMs пациентов с LQTS с мутациями KNCQ1 и KCNH2 были способны точно воспроизводить фенотипы LQTS и демонстрировали выраженную аритмию. Хотя блокаторы Na+ каналов, активаторы K+ каналов и блокаторы Ca2+ каналов продемонстрировали некоторый положительный эффект в более ранних исследованиях (Shah, 2010; Zanella et al., 2014), hiPSC-модель LQTS, специфичная для пациента, может способствовать дальнейшей адаптации терапевтических подходов перед более масштабными доклиническими испытаниями.

(b) iPSC-ECs: Эндокардиальные клетки - это специализированные эндотелиальные клетки (ECs), которые образуют самый внутренний слой стенки сердца. ECs играют несколько ключевых ролей в развитии и заболеваниях сердца. В многочисленных исследованиях опубликованы протоколы дифференцировки iPSC-ECs с использованием различных методов и клеточных линий с переменным успехом и функциональной неоднородностью (Gao, Yourick, & Sprando, 2021; Levenberg, Golub, Amit, Itskovitz-Eldor, & Langer, 2002; Orlova et al., 2014; Paik et al., 2018; Rufaihah et al., 2013; Theodoris et al., 2015). Разработка hiPSC-ECs основана на нашем предварительном понимании развития сосудов в эмбриологии, где сосудистые ECs происходят из ангиобластов, полученных из мезодермы, которые пролиферируют в ECs в присутствии VEGF, опосредованного miR-21 и TGF- β2 (Di Bernardini et al., 2014; Majewska, Wilkus, Brodaczewska, & Kieda, 2021). Среди этих протоколов Zhang et al. показали, что дифференцировка ECs более эффективна при выращивании в трехмерном фибриновом каркасе по сравнению с 2D культурой в монослое (Zhang, Dutton, Su, Zhang, & Ye, 2014). Структурно было показано, что из hiPSC-ECs ECs супрессируют соотв. эндотелиальные маркеры, такие как CD31, CD34 и VEGFR, и обычно выделяются на основе CD31 (PECAM-1) или CD144 (сосудистый эндотелий-кадхерин). Они демонстрируют cobblestone конгломерата морфологию, такие ECs активно супрессируют VE-кадхерин и PECAM-1 в местах межклеточных соединений, поглощают окисленные LDL, образуют трубки в Матригеле и сильно реагируют на ток жидкости (Helle et al., 2021; Helle, Ampuja, Antola, & Kivela, 2020). Однако имеющиеся данные свидетельствуют о том, что функциональность hiPSC-ECs пока не может быть такой же надежной, как у эндогенных ECs, о чем свидетельствует снижение прорастания капилляров, повышение ECs супрессии способствующего ангиогенезу регулятора Sox17, снижение ECs супрессии эндотелиального белка синтазы оксида азота (eNOS), снижение VEGF-индуцированной проницаемости и более медленный ответ на аналог cAMP (Bezenah, Kong, & Putnam, 2018; Halaidych et al., 2018). Учитывая неоднородность полученных из hiPSC ECs и протоколов дифференцировки, в настоящее время сложно обобщить эти результаты для всех линий hiPSC-EC.

Имеются данные, подтверждающие связь между ECs и CMs посредством кардиокиновой и ангиокринной передачи сигналов, и эта связь играет важную роль в развитии, росте и гомеостазе сердца (Giacomelli, Bellin, Orlova, & Mummery, 2017; Jambusaria et al., 2020; Yucel et al., 2020). Как и hiPSC-CMs, культура hiPSC-EC в изоляции также приводит к образованию популяции клеток, ECs супрессирующих маркеры незрелых ECs , что потенциально может привести к пластичности для дальнейшего развития или даже перехода между артериальным и венозным фенотипами. Генерация hiPSC-ECs, описанная Хелле и др., недавно продемонстрировала, что совместное культивирование с hiPSC-CMs улучшает зрелость и однородность hiPSC-произведенных ECs. Сравнение одноклеточных данных РНК-секвенирования между моно- и совместно культивированными hiPSC-CM/ECs выявило значительное влияние совместного культивирования на транскриптомы hiPSC-EC и менее выраженное влияние на уровни ECs супрессии генов hiPSC-CM. Эти данные свидетельствуют о пластичности сердечных ECs , аналогичной наблюдаемой in vivo, и отражают состояние развития hiPSC-ECs с высокой пластичностью в ответ на паракринные сигналы (Helle et al., 2021; Majewska et al., 2021; Tabula Muris et al., 2018). В совокупности эти исследования подчеркивают потенциал системы совместной культуры ECs -CMs в моделировании органотипических процессов развития и заболеваний сердца в чашках.

Учитывая, что большинство CHD представлены дефектами перегородки, аномалиями клапанов и/или недоразвитием желудочков, важно понять роль эндокарда в патогенезе этих состояний (Hoffman & Kaplan, 2002; Nees & Chung, 2020). Например, HLHS - клинически и анатомически тяжелая форма CHD, характеризующаяся серьезным недоразвитием левого желудочка (LV), митрального клапана, аортального клапана и восходящей аорты. Предыдущие работы с использованием hiPSCs от пациентов с HLHS и исследования по прямой генетике на мышах указали на врожденный дефект CMs в этиологии HLHS, со сниженной эффективностью дифференцировки сердца, дезорганизованными саркомерами, аномальными митохондриями и нарушенной сигнализацией NOTCH (Hrstka, Li, Nelson, & Wanek Program Genetics Pipeline, 2017; Liu et al., 2017; Theis et al., 2020; Yang et al., 2017). Однако ни одна из особенностей миокарда не объясняла в достаточной степени аномальное развитие сердечных клапанов, перегородки и сосудистой системы при HLHS. Гу и его коллеги представили прямые доказательства того, что в основе гипоплазии желудочков и клапанов при HLHS лежит эндокард с нарушением развития, и связали мутации de novo, о которых сообщалось в консорциуме Pediatric Cardiac Genomics Consortia, с патогенезом этого заболевания (Miao et al., 2020). Используя специфические для пациента hiPSC-ECs, фетальную сердечную ткань с недоразвитым LV и анализ РНК-секвенирования одиночных клеток, Miao и др. продемонстрировали нарушение перехода эндокарда в мезенхиму (EndoMT) и ангиогенеза в сердцах пациентов с HLHS (Miao et al., 2020). В настоящее время не существует опубликованных протоколов, точно повторяющих особенности эндокарда in vivo; однако в данном исследовании удалось обогатить популяцию эндокарда из гетерогенных iPSC-ECs путем проточной сортировки с использованием антител против маркеров поверхности эндокардиальных клеток, NPR3 и HAPLN1. Кроме того, анализ совместной культуры hiPSC-CMs с контрольными и HLHS hiPSC-ECs показал снижение ECs супрессии генов, связанных с пролиферацией и созреванием клеток. Эти данные еще раз подтверждают необходимость разработки модели заболевания HLHS для будущих терапевтических стратегий, направленных на восстановление желудочков и клапанов.

Помимо моделирования CHD со сложной генетической этиологией, такой как HLHS, предпринимаются усилия по созданию системы in vitro для изучения влияния нарушенной среды на hiPSC-ECs. Theodoris CV и др. охарактеризовали взаимодействие генов и окружающей среды, используя hiPSC-ECs, полученные от больных членов семьи с CAVD, несущих гетерозиготные нонсенс-мутации в NOTCH1, и подвергая их воздействию измененного гемодинамического потока (Theodoris et al., 2015). При воздействии статического или сдвигового (shear) стресса (потока) на дифференцированные контрольные и NOTCH1+/- hiPSC-произведенные ECs показали, что гемодинамический shear стресс способен активировать антиостеогенные и противовоспалительные сети в ECs дикого типа, но не при гаплонедостаточности NOTCH1 в hiPSC-ECs. Далее было показано, что гаплонедостаточность NOTCH1 изменяет метку(ы) ацетилирования гистона H3K27 в энхансерах, связанных с NOTCH1, что приводит к дисрегуляции ECs супрессии генов, вовлеченных в остеогенез, воспаление и реакцию на окислительный стресс. Кроме того, картирование GRNs, нарушения регуляции которых связаны с недостаточностью NOTCH1, позволило исследователям разработать корректирующую сеть терапию для пациентов с CAVD (Theodoris et al., 2021). Приведенные выше результаты подчеркивают ключевые изменения в дозировке генов, которые влияют на основные регуляторные элементы GRN, используя модель hiPSC, и то, как сетевой скрининг выявляет терапевтического кандидата для изнурительных сердечно-сосудистых заболеваний.

В других исследованиях iPSC-ECs изучались в контексте сахарного диабета - заболевания, характеризующегося дисфункцией эндотелия с разрушительным долгосрочным повреждением конечных органов. При диабете гипергликемия увеличивает количество реактивных форм кислорода, что приводит к снижению секреции NO (Basu et al., 2017; Basu & Garg, 2018; Carcamo-Orive, Huang, Quertermous, & Knowles, 2017), а гиперинсулинемия приводит к секреции эндотелина-1 (ET-1) и повышению ECs супрессии молекулы vascular cell adhesion molecule 1 and E-selectin, что способствует сужению сосудов и воспалительному состоянию. В мышиной модели iPSC-ECs, полученные от мышей с ожирением, вызванным диетой, показали сниженную способность к формированию капилляроподобных сетей, уменьшенную миграцию и низкую пролиферацию (Gu et al., 2015). Это было первое исследование, показавшее, что iPSC-ECs из мышей с ожирением демонстрируют признаки эндотелиальной дисфункции. Хотя последствия таких исследований имеют далеко идущие последствия, необходимо дальнейшее подтверждение в моделях на основе hiPSCs.

(c) iPSC-SMCs: Как ECs, так и сосудистые гладкомышечные клетки (SMCs) являются основными клеточными компонентами кровеносных сосудов и необходимы для функционирования сосудов, взаимодействия с иммунными клетками и поглощения питательных веществ (Patsch et al., 2015). Эти типы клеток вовлечены в различные патологические дисфункции, такие как не-заращение артериального протока, аневризма аорты и атеросклероз (Baeten, Jackson, McHugh, & Lilly, 2015; Bennett, Sinha, & Owens, 2016; Koenig, Bosse, Nadorlik, Lilly, & Garg, 2015). В ходе эмбриогенеза сосудистые предшественники развиваются из латеральной и задней мезодермы (Chen et al., 2016; Wang, Jacquet, Karamariti, & Xu, 2015; Yamashita et al., 2000). Набор SMCs из их предшественников является важным шагом в формировании эмбриональной сосудистой системы. СМК могут выполнять как сократительную, так и синтетическую функцию, что характеризуется изменениями в морфологии, скорости пролиферации и миграции, а также ECs супрессией различных маркерных белков (Rensen, Doevendans, & van Eys, 2007). После дисфункции или повреждения эндотелия сократительные SMCs переходят в секреторный тип, что облегчает их миграцию в интиму и пролиферацию, способствуя развитию неоинтимного поражения. Поэтому понимание регуляторных механизмов, контролирующих дифференцировку SMC из сосудистых предшественников, необходимо для изучения потенциальных клинических применений. Ранее было показано, что модуляция канонического Wnt-сигнала в hiPSCs индуцирует мезэнтодерму, кардиогенез и образование сосудистых клеток (Brade, Manner, & Kuhl, 2006; Sumi, Tsuneyoshi, Nakatsuji, & Suemori, 2008; Woll et al., 2008). Используя эти знания, был разработан быстрый и эффективный протокол дифференцировки для получения ECs и сосудистых SMCs из hiPSC. Посредством ингибирования GSK3 и обработки BMP4 hiPSC быстро переходят к мезодермальной судьбе, а последующее воздействие VEGF или тромбоцитарного фактора роста (PDGF-BB) приводит к дифференцировке ECs или SMCs, соответственно (Patsch et al., 2015). Однако интерпретация данных исследований in vivo и in vitro в отношении морфологического фенотипа и функциональных последствий ECs супрессии маркеров дифференцировки SMC остается открытой для дискуссий.

Развитие технологии hiPSC изменило наше понимание сердечно-сосудистых заболеваний и радикально изменило наши подходы к их лечению. hiPSC дают возможность создавать модели развития и заболеваний сердечно-сосудистой системы человека in vitro и возможность конструировать платформы на основе CMs человека для поиска лекарств и предиктивной токсикологии. Кроме того, они представляют собой неограниченный источник сердечных клеток (специфичных для пациента) для клеточной терапии, направленной на лечение наиболее изнурительных форм заболеваний сердца. Реализация этого замечательного потенциала на практике зависит от нашей способности направлять дифференциацию hiPSCs в желаемый тип (типы) клеток. Поскольку hiPSCs представляют собой раннюю, прегастральную стадию развития, дифференциация функциональных сердечных клеток включает в себя переход через стадии развития, сравнимые с теми, которые приводят к формированию сердечной ткани у эмбриона. Учитывая это, при разработке протоколов дифференцировки часто руководствуются нашим пониманием развития сердечно-сосудистой системы у модельных организмов.

Открытие моделей iPSC обеспечило молекулярную дорожную карту, позволяющую эффективно изменять идентичность любого типа клеток в любой другой тип клеток (Karagiannis, Nakauchi, & Yamanaka, 2018). Эта способность превращать дифференцированные клетки в плюрипотентные, а затем обратно в дифференцированные позволила по-новому взглянуть на происхождение патогенеза заболеваний и определить новые мишени для обращения процесса болезни вспять. Начались клинические исследования малых молекул/соединений, основанных на результатах скрининга лекарств в моделях заболеваний hiPSC (Gu et al., 2021; Liang et al., 2013; Mills et al., 2019; Theodoris et al., 2021). Благодаря способности hiPSC к пролиферации и дифференцировке, их также можно использовать для подготовки клеток к трансплантации, и такие клинические исследования с использованием клеточной терапии на основе hiPSC продолжаются. Поскольку сердце млекопитающих обладает ограниченной способностью к регенерации, клеточная терапия требует введения миллиардов CMs, полученных из стволовых клеток, или трансплантации инженерных заплаток из сердечной ткани (Liu et al., 2018). Поэтому создание терапевтически значимого количества hiPSC-CMs остается чрезвычайно трудоемким и длительным процессом, несмотря на надежные и высокоэффективные протоколы направленной дифференцировки. Для удовлетворения этой медицинской потребности несколько исследований сначала были направлены на использование малых молекул (модуляторов сигнальных путей) для стимулирования пролиферации дифференцированных hiPSC-CMs (Mills et al., 2019; Sharma et al., 2018). Однако эти молекулы могут индуцировать пролиферацию CMs лишь в три-пять раз, что ограничивает применение этих клеток в терапевтических целях. В недавнем исследовании была продемонстрирована способность к массовому увеличению функциональных hiPSC-CMs в 100-250 раз путем обработки ингибитором гликоген-синтазы киназы-3 β (GSK-3 β) CHIR99021 и одновременного устранения межклеточного контакта (Buikema et al., 2020). Дальнейшие механистические исследования раскрыли роль канонической передачи сигналов Wnt в задержке созревания hiPSC-CM и стимулирующую роль фосфорилирования AKT в усилении пролиферации hiPSC-CM путем увеличения активности клеточного цикла. Исследования Buikema JW и др. демонстрируют доказательство концепции трансляционного подхода для достижения массового расширения hiPSC-CM, необходимого для будущих стратегий регенерации сердца у пациентов с CHD и кардиомиопатиями. Ожидается, что сочетание модифицированных протоколов дифференцировки hiPSC и альтернативных терапевтических стратегий позволит расширить их медицинские преимущества.

С методической точки зрения эффективность преходящей трансфекции может представлять серьезные ограничения в зависимости от методов перепрограммирования, используемых для получения мышиных и человеческих iPSC. Каноническое перепрограммирование на основе вирусов создает множество проблем, включая инсерционный мутагенез, остаточную ECs супрессию и повторную активацию факторов перепрограммирования, неконтролируемое подавление трансгенов, апоптоз, клеточное старение и сильную иммуногенность (Hu, 2014). Хотя терминально дифференцированные клетки демонстрируют сопоставимые молекулярные и функциональные характеристики между изогенными iPSCs и эмбриональными стволовыми клетками, полученными путем ядерного переноса соматических клеток (Zhao et al., 2017), hiPSCs, созданные с использованием вирусных векторов, имеют повышенную частоту мутаций и аберрантный эпигеном по сравнению с эмбриональными стволовыми клетками или даже дифференцированными клетками, что свидетельствует о более низкой стабильности генома и, следовательно, более высоком риске развития рака. Использование онкогенных факторов транскрипции, таких как c-Myc, вирусных векторов и случайные вставки трансгенов в геном хозяина во время перепрограммирования также вызывает опасения в отношении канцерогенности hiPSCs и безопасности использования hiPSCs для клинического применения. Модификации оригинального метода трансфекции, включая удаление c-Myc (Li et al., 2010) и замену его на Lin28 и Nanog (Yu et al., 2007), позволили получить схожие результаты с преимуществом снижения онкогенного потенциала hiPSC.

Продолжаются споры о том, что технически невозможно создать чистые популяции окончательно дифференцированных клеток без следов предшественников/стволовых клеток. Эти примеси указывают на то, что методы перепрограммирования могут внести значительный вклад в безопасность продуктов iPSC для последующей терапии (Yoshihara, Hayashizaki, & Murakawa, 2017). Не менее важны протоколы дифференцировки, позволяющие получить более определенные и однородные популяции окончательно дифференцированных клеток, предназначенных для заместительной клеточной терапии. Это требует разработки надежных протоколов трансдифференцировки, исключающих необходимость и потенциальную онкогенность hiPSCs. Первые исследования протоколов дифференцировки hiPSC дали смешанные популяции незрелых CMs, состоящие из клеток желудочков, предсердий и кардиостимуляторов (Karakikes et al., 2015). Хотя такие смешанные популяции клеток могут не влиять на исследования кардиогенеза, они не подходят для моделирования заболеваний и тестирования лекарств, направленных на конкретные подтипы CMs. Чтобы преодолеть эти ограничения, необходимо разработать более совершенные протоколы, позволяющие генерировать более обогащенные популяции CMs.

И последнее, но не менее важное: знания, полученные на животных моделях, проложили путь к развитию hiPSCs в конкретные линии сердечных предшественников и их дифференцированных потомков. Кроме того, hiPSC, полученные из специфических для пациента источников, служат прекрасными моделями для изучения роли специфического генетического фона и моногенных заболеваний в кардиогенезе человека in vitro. Однако спорадическая встречаемость заболевания свидетельствует о том, что генетика CHD сложна, часто мультигенна и генетически неоднородна (Gelb & Chung, 2014; Liu et al., 2017). Экспериментальное подтверждение модели hiPSC, оценивающей олигогенное наследование и участие генетических и экологических модификаторов, способствующих развитию CHD и кардиомиопатий, до сих пор отсутствует. В одном из недавних исследований был описан сложный семейный случай кардиомиопатии, начавшейся в детстве (LVNC), в котором был выявлен редкий миссенс-вариант NKX2-5, действующий как генетический модификатор в сочетании с новыми миссенс-вариантами в транскрипционном факторе MKL2 и генах саркомерного белка MYH7 (Gifford et al., 2019). Используя CRISPR-Cas9 редактирование генов мышей, кодирующих ортологичные варианты, Gifford и др. показали, что для воспроизведения фенотипа LVNC человека требуется сложная гетерозиготность по всем трем вариантам. Кроме того, CMs, полученные из hiPSC, предоставили гистологические и молекулярные доказательства вклада варианта NKX2-5 в качестве модификатора. Подобные исследования потребуются для оценки олигогенного наследования и ген-средовых взаимодействий, лежащих в основе возникновения CHD и других редких врожденных пороков развития.