Посещений:
ВИЛЬСОНА БОЛЕЗНЬ



Роль дисбаланса oxysterol в патогенезе

Oxysterol misbalance critically contributes to Wilson disease pathogenesis
SOM DEV, ABIGAEL MUCHENDITSI, ALINE GOTTLIEB, et al.
SCIENCE ADVANCES 19 Oct 2022 Vol 8, Issue 42 DOI: 10.1126/sciadv.adc9022

Wilson disease (WD) is a metabolic disorder caused by inactivation of the copper-transporting ATPase 2 (ATP7B) and copper (Cu) overload in tissues. Excess Cu causes oxidative stress and pathologic changes with poorly understood mechanistic connections. In Atp7b-/- mice with established liver disease, Cu overload activates the stress-sensitive transcription factor Nrf2 (nuclear factor erythroid-derived 2-like 2). Nrf2 targets, especially sulfotransferase 1e1 (Sult1e1), are strongly induced and cause elevation of sulfated sterols, whereas oxysterols are decreased. This sterol misbalance results in inhibition of the liver X receptor (LXR) and up-regulation of LXR targets associated with inflammatory responses. Pharmacological inhibition of Sult1e1 partially reverses oxysterol misbalance and LXR inhibition. Contribution of this pathway to advanced hepatic WD was demonstrated by treating mice with an LXR agonist. Treatment decreased inflammation by reducing expression of proinflammatory molecules, diminished fibrosis by down-regulating the noncanonical transforming growth factor-β signaling pathway, and improved liver morphology and function. Thus, the identified pathway is an important driver of WD.
Болезнь Вильсона (WD) - это потенциально смертельное нарушение метаболизма меди. WD вызывается инактивирующими мутациями в аденозин-5-трифосфатом (АТФ)-управляемом транспортере Cu(I) ATP7B, которые нарушают гомеостаз Cu в печени и других органах. В гепатоцитах потеря активности ATP7B предотвращает выведение Cu в желчь и доставку кофактора Cu для ферроксидазы - церулоплазмина (1). Печеночные проявления WD варьируются от бессимптомного повышения уровня печеночных ферментов до цирроза или острой печеночной недостаточности. Возраст и пол оказывают модифицирующее влияние на течение заболевания: Цирроз чаще встречается у взрослых, чем у педиатрических пациентов, а острая печеночная недостаточность чаще встречается у женщин (2). Из-за различных клинических проявлений диагностика и лечение WD могут быть сложными.
В настоящее время лечение WD включает хелатирование Cu, соли цинка и трансплантацию печени. Хелатирование меди является стандартной терапией при WD , и она приносит пользу большинству пациентов, особенно если начата на ранней стадии (3). Несмотря на доказанные преимущества, все существующие методы лечения имеют свои недостатки, включая побочные эффекты, низкую пластичность (compliance), высокую стоимость и возможность неврологической декомпенсации (4, 5). Необходимы альтернативные и/или дополнительные подходы, основанные на глубоком понимании патогенеза WD . В настоящее время молекулярные механизмы, с помощью которых повышенное содержание Cu вызывает фиброзно-воспалительное заболевание печени, остаются неясными.
WD у людей и у животных моделей прогрессирует от бессимптомной стадии, когда печеночная медь повышена, но морфология и функция печени не нарушены, до прогрессирующей WD с воспалением печени, фиброзом, повреждением гепатоцитов и значительными функциональными нарушениями. У пациентов с WD и у мышей Atp7b-/- содержание Cu в печени быстро увеличивается после рождения и затем остается довольно постоянным по мере прогрессирования заболевания. Это наблюдение позволяет предположить, что развитие патологии при WD представляет собой последовательность метаболических и транскрипционных изменений, которые усиливают и далее изменяют первоначальный ответ печени на избыток Cu. Как происходит этот процесс, пока неясно. Дисфункция митохондрий (6), эпигенетические модификации (7) и изменения в передаче сигналов ядерных рецепторов (NR) (8, 9) были описаны как важные отличительные признаки заболевания, но индивидуальный вклад этих путей в воспаление и фиброз при WD не определен.
NR являются лиганд-зависимыми транскрипционными факторами, которые регулируют многочисленные клеточные пути. Дефекты в сигнализации NR [LXR, FXR (farnesoid X receptor) и peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα)] были выявлены у пациентов с WD и у мышей Atp7b-/- (10-12). Было показано, что NR печени, LXR, подавляется на ранней стадии WD . На этой стадии до появления симптомов ингибирование LXR в первую очередь нарушает липидный обмен, а активация LXR корректирует эти изменения и задерживает развитие повреждений печени у молодых Atp7b-/- мышей (11). Роль LXR при прогрессирующей WD , которая характеризуется воспалением и фиброзом печени, остается неясной, поскольку при прогрессирующей WD другие NR, такие как FXR, также становятся существенно разрегулированными, и многие клеточные пути изменяются (8-10). Взаимосвязь между активностью NR и окислительным стрессом, еще одной хорошо известной особенностью прогрессирующей WD, также остается неясной. Чтобы ответить на эти вопросы, мы изучили старых мышей Atp7b-/- с установленной печеночной WD . Мы обнаружили, что клеточный ответ на повышенный уровень Cu включает транскрипционные изменения, которые влияют на ферменты, участвующие в производстве и модификации стеролов. Стероловый дисбаланс вызывает ингибирование LXR, что вносит значительный вклад в развитие воспаления и фиброза. Кроме того, мы показали, что фармакологическая активация LXR, даже после появления клинических симптомов, уменьшает воспаление и фиброз и улучшает функцию печени. Мы пришли к выводу, что стериновый дисбаланс является важной движущей силой развития патологии на фоне повышенного содержания Cu.
RESULTS
Cu accumulation causes activation of stress-sensitive NRF2 in Atp7b-/- mice and up-regulation of NRF2 targets


При WD накопление Cu в тканях снижает восстановительную способность клеток, вызывая окислительный стресс (13). Сообщалось о различных показателях окислительного стресса при WD [повреждение ДНК, peroxidation липидов и повышенное окисление глутатиона (14, 15)], однако данные об изменениях белков/РНК, которые определяют ответ на окислительный стресс при WD , очень ограничены. Чтобы лучше охарактеризовать этот ответ у мышей Atp7b-/- с установленным заболеванием печени (20 недель после рождения), мы исследовали состояние чувствительного к окислительному стрессу транскрипционного фактора, ядерного фактора эритроидного происхождения 2-подобного 2 (NRF2). Иммуноокрашивание срезов ткани печени показало, что сигнал NRF2 в печени Atp7b-/- значительно сильнее по сравнению с контролем, соответствующим возрасту, что свидетельствует о повышенном содержании NRF2 (рис. 1A). Иммуноблот-анализ гомогенатов печени подтвердил повышенный уровень белка NRF2 в образцах Atp7b-/- (как в цитозольной, так и в ядерной фракциях) (рис. 1, B - E).



Fig. 1. Stress-sensitive NRF2 and NRF2 targets are up-regulated in Atp7b-/- mice.

(A) Immunostaining of NRF2 (red) in tissue sections revealed stronger signal in Atp7b-/- [knockout (KO)] liver compared to control [heterozygous (Het)]. DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole; blue) marks nuclei. Scale bars, 20 µm. (B and C) Western blot analysis of cellular fractions shows enrichment of elevated NRF2 protein in nuclei. GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) (cytosol) and lamin A (nucleus) are loading controls. (D and E) Densitometry of NRF2 signal normalized to GAPDH and lamin A, respectively. (F) Diagram showing Nrf2 along with Mafs binding to antioxidant response element (ARE) and activating expression of their target genes. (G) Heatmap analysis of Nrf2-dependent transcripts was generated using R with row scaling and clustering of transcript abundances (positive value in red denotes up-regulation, whereas negative value in blue denotes down-regulation). (H) Most significantly changed Nrf2 targets; values represent relative fold change, n = 4 male mice per group. (I) Immunohistochemistry demonstrates up-regulation of Sult1e1 protein expression in Atp7b-/- hepatocytes (indicated by arrow in the high-magnification image). Scale bars, 1 mm and 20 µm; n = 3 male mice per group. (J) Immunohistochemistry of SULT1E1 in the WD patient liver sections shows strong SULT1E1 signal in hepatocytes as compared to healthy control (indicated by arrow in the high-magnification image). Representative image of SULT1E1 staining from the control and WD patient section that we have demonstrated here. Scale bars, 1 mm and 20 µm. n = 3 per group.

...
DISCUSSION


WD вызвана накоплением Cu, которое вызывает морфологические и функциональные патологии в тканях, особенно в печени. Инактивирующие мутации в транспортере меди ATP7B представляют собой хорошо установленную генетическую причину WD , а избыток меди всегда обнаруживается в печени при WD . Исследования последних лет делают все более очевидным, что широкий спектр фенотипов WD и различное время начала WD не могут быть объяснены одним единственным фактором, таким как специфический уровень Cu в тканях или генотип мутации ATP7B. Перегрузка Cu вызывает окислительный стресс, повреждение и дисфункцию митохондрий, ингибирование NRs, эпигенетические и метаболические изменения (6, 7, 14, 15). Относительный вклад этих нарушений в патологию WD неясен и требует выяснения для более точного прогнозирования фенотипов заболевания и лечения. В данном исследовании мы выявили несколько молекулярных связей, лежащих в основе прогрессирующей печеночной WD у мышей, и представили доказательства нетоксичности и благоприятного эффекта воздействия LXR на стадию после начала патологии печени. Хотя описанная механистическая картина отнюдь не является полной, наши результаты убедительно свидетельствуют о том, что пути, вызывающие истощение запасов оксистерола и ингибирование LXR, должны быть тщательно изучены при WD человека как потенциальные терапевтические мишени.
Мы показали, что у мышей Atp7b-/- повышение активности стресс-чувствительного фактора NRF2 приводит к увеличению экспрессии молекул, участвующих в защите/адаптации к окислительному стрессу. Мы определили подмножество наиболее значительно измененных транскриптов, которые можно рассматривать как молекулярную подпись печеночного ответа на окислительный стресс при мышиной WD (рис. 1H). Наши исследования также выявили сильную повышенную активность сульфотрансфераз в печени мыши Atp7b-/- и человека, и привели к открытию стеринового дисбаланса при мышиной WD . Повышенный уровень Sult1e1 был также обнаружен у мышей и Atp7b-/- на другом генетическом фоне B6 [см. дополнительную таблицу 1 микрочипов в (9)]. Мы показали, что снижение уровня OHCs, эндогенных активаторов LXR, и повышение уровня сульфатированных OHCs, ингибиторов LXR, приводит к подавлению передачи сигналов LXR. Восстановление стеринового баланса путем снижения активности Sult1e1 уменьшило ингибирование LXR (рис. 7).

В отличие от антагонистов LXR 24-OHCS и 25-OHCS, уровни 4-OHCS и 7-OHCS ниже у мышей Atp7b-/-. Это, вероятно, связано со сниженной экспрессией Sult2a8 и предшественников желчных кислот 4-OHC и 7-OHC, что, в свою очередь, может объяснить ранее сообщавшуюся (и подтвержденную здесь) дисрегуляцию передачи сигналов FXR (8). Хотя наши данные предсказывают наибольшее влияние лечения препаратом на LXR-зависимые пути, мы не можем исключить положительное влияние препарата на некоторые мишени FXR (и, следовательно, дополнительный полезный эффект), поскольку длительное применение T0901317 может повысить внутриклеточную концентрацию до уровня, который будет модулирующим для FXR, Retimoid-related orphan receptor gamma (RORγ) и pregnane X receptor (PXR) (23). Является ли этот возможный плеотропный эффект преимуществом или вредом для препарата, еще предстоит выяснить. В настоящее время наши данные свидетельствуют о том, что T0901317-подобные соединения могут оказывать значительное благоприятное воздействие на развившуюся печеночную WD . Препарат обращает вспять многие транскрипционные и метаболические изменения у Atp7b-/- мышей. Приблизительно 90% генов, которые индуцировались в нелеченных нокаутах, были подавлены в ответ на препарат, при этом большое влияние оказывалось на транскрипты, отвечающие за липидный обмен и воспалительный ответ (основные компоненты фенотипических проявлений заболевания).
Современная пожизненная хелатная терапия Cu улучшает функцию печени, но часто имеет заметные побочные эффекты (4, 5). Лечение агонистами LXR стимулирует липогенез, однако в наших экспериментах не наблюдалось стеатоза печени. Мы обнаружили увеличение веса печени у обработанных препаратами мышей Het и KO, что не повлияло на вес тела (рис. S8, A и B). Увеличение веса печени может быть связано с повышенным содержанием TG. Кроме того, PXR вызывает увеличение печени путем активации передачи сигналов yes-associated pathway (YAP) (24). Уровни PXR и YAP1/TAZ (транскрипционный ко-активатор с PDZ-связывающим мотивом) повышены в печени Atp7b-/- мыши, но лечение препаратом T0901317 не изменило их экспрессию (рис. S8, C и D).
Наши данные секвенирования РНК выявили ~2-кратное увеличение экспрессии мРНК супрессора гомолога zeste 12 (SUZ12) и энхансера гомолога zeste 2 (EZH2) у мышей Atp7b-/- , а лечение препаратом снизило их уровень до контрольного (рис. S9). SUZ12 вместе с EZH2 образует polycomb group repressive complex (PRC2/3), участвующий в транскрипционном замалчивании путем метилирования гистонов (25). В фибробластах человека истощение компонентов PRC2/3 выявило более 1000 подавленных генов, относящихся к сигнальным путям TGFβ, Wnt, фактора роста фибробластов, Notch и Hedgehog (25). EZH2 также был идентифицирован как важный фактор в TGFβ-опосредованной активации звездчатых клеток и фиброза (26). Эти данные позволяют предположить, что активация LXR может вызывать транскрипционную репрессию TGFβ и других сигнальных путей через polycomb репрессивный комплекс. Будущие исследования должны оценить, вызывает ли активация LXR транскрипционную репрессию TGFβ и других сигнальных путей через репрессивный комплекс polycomb.
Агонист LXR частично улучшил функцию печени; однако сывороточные трансаминазы существенно не изменились. Возможное объяснение заключается в том, что сывороточные трансаминазы более чувствительны к острому повреждению/токсичности печени, чем к хроническому повреждению печени (27), или необходимо более длительное лечение. Обзор гистологических срезов показал, что агонизм LXR эффективен в улучшении патологических изменений, наблюдаемых в печени нокаутных мышей в возрасте 20 недель, хотя наблюдалась некоторая индивидуальная вариабельность образцов. У леченных животных не было обнаружено признаков лекарственно-индуцированного повреждения печени.
Воспаление печени, в конечном итоге приводящее к фиброзу, обычно наблюдается при WD . Наши данные о снижении экспрессии фиброзных генов у мышей с Atp7b-/- в ответ на действие агониста согласуются с результатами предыдущих исследований у мышей с LXRα/β-/- (28). Atp7b экспрессируется не только в гепатоцитах, но и в HSCs (www.proteinatlas.org/ENSG00000123191-ATP7B/single+cell+type/liver). В Atp7b-/- печени как паренхимные, так и не паренхимные клетки накапливают Cu (29), а иммуногистохимия TGFβ выявляет повышенный сигнал TGFβ как в гепатоцитах, так и в не-паренхимной печени. В то же время, Sult1e1 был повышен преимущественно в гепатоцитах, что, возможно, отражает повышенную концентрацию Cu в этих клетках. Эти данные позволяют предположить, что молекулярные события внутри различных клеток печени и паракринная коммуникация между клетками могут способствовать активации HSCs и воспалительной реакции.
Несмотря на повышенную экспрессию TGFβ, мы не обнаружили существенных различий в классическом сигнальном пути SMAD в ответ на препарат, поскольку уровень белка SMAD2 оставался высоким у нокаутных мышей. С другой стороны, агонист LXR значительно снижал не связанные с SMAD сигнальные молекулы (ERK1/2, p38 и JNK), которые повышены в печени нокаутных мышей. Ранее было показано, что сигнальный путь RAS/MAPK стимулируется ионами меди (30). Недавно было показано, что лечение Cu вызывает печеночную дисфункцию через активацию передачи сигналов MAPK у мыши (31). Наши данные свидетельствуют о том, что в печени у мышей Atp7b-/- повышенное содержание Cu стимулирует сигнальные пути MAPK, а увеличение LXR снижает сигнальные пути MAPK.
В заключение, мы определили Cu-опосредованную стресс-индуцированную активацию сульфотрансфераз и значительные изменения в составе стеролов как молекулярную основу ингибирования печеночного NR LXR. Наше исследование также показывает, что ингибирование передачи сигналов LXR в результате дисбаланса стеролов существенно способствует воспалению и фиброзу при мышиной WD , а активация LXR/RXR обращает вспять воспаление и фиброз печени через ингибирование неканонического сигнального пути TGFβ (рис. 8). Эти результаты еще раз доказывают, что нарушения регуляции LXR-сигнализации вносит значительный вклад в патогенез WD , и дают убедительное обоснование для разработки и тестирования агонистов NR в качестве потенциального нового метода лечения WD .



Fig. 8. Proposed model of LXR inhibition by oxysterol misbalance contributes to inflammation and fibrosis in murine WD.

Under normal conditions, functional ATP7B maintains Cu homeostasis. Inactivating mutations of ATP7B cause Cu accumulation. Cu-induced oxidative stress causes sterol misbalance by down-regulating OHC (via Cyps) enzymes and up-regulating sulfotransferases (Sult1e1, Sult1a1, and Sult1b1), which inhibit LXR in murine WD. Activation of LXR/RXR using T0901317 reverses liver inflammation and fibrosis and partially improves liver function in advanced WD. In addition, lipid functions are improved despite Cu overload. Significant decreases in inflammation and fibrosis are primarily mediated by changes in the abundance of the protein components of the noncanonical TGF? signaling pathway. Red arrows indicate the disease state, and green arrows indicate the effect of the LXR agonist.