Как и при других психоневрологических расстройствах, факторы риска развития ASD включают в себя значительный генетический компонент, который является очень сложным и многофакторным, включающим сотни генов риска^7,8. Тем не менее, несмотря на этиологическую гетерогенность, исследования молекулярного профилирования при ASD выявили последовательные паттерны транскриптомной и эпигенетической дисрегуляции, вовлекающие лобную и височную кору в большинстве случаев^1-5,9. Представляет ли это очаговую, региональную или более общую молекулярную патологию, неизвестно. Понимание природы и распределения этих молекулярных изменений необходимо для расшифровки нейробиологических основ ASD.

Здесь мы провели RNA-sequencing analysis (RNA-seq) для выявления изменений генов и транскриптов (альтернативно сплайсированных изоформ генов) в 725 образцах, охватывающих 11 отдельных областей мозга и все четыре доли коры (лобную, теменную, височную и затылочную), включая многочисленные ассоциации и первичные сенсорные области, у 49 человек с идиопатическим расстройством аутистического спектра и 54 соответствующих нейротипичных контрольных лиц (рис. 1a-c, расширенные данные рис. 1-3, дополнительные данные 1 и методы). По сравнению с предыдущими работами^4,5, это представляет собой более чем трехкратное увеличение количества образцов и профилированных областей. В соответствии с возросшей статистической мощностью, мы обнаружили 4 223 гена и 9 474 транскрипта (false discovery rate (FDR) менее 0.05), которые дифференциально экспрессировались по всей коре, что заметно больше по сравнению с предыдущими анализами^1,5 (рис. 1c, расширенные данные рис. 3 и 4 и дополнительные данные 3). Мы выявили различия в экспрессии транскриптов на уровне генов, причем изменения транскриптов оказывали больший эффект при ASD, чем соответствующие гены (рис. 1d, расширенные данные рис. 4 и дополнительные данные 2), что подтверждает существенную роль альтернативного сплайсинга и экспрессии изоформ при ASD, это согласуется с распределением наследования общих вариантов¹⁰ и предыдущими транскриптомными анализами¹.



Fig. 1: ASD-associated transcriptomic differences across 11 cortical regions.

a, Study experimental design. Eleven regions were profiled by bulk RNA-seq, and three regions were also profiled by single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) (Fig. 4). b, Human cortical Brodmann areas (BA) sequenced, with cortical lobules coloured consistently throughout this figure. c, The number of unique individuals by region and diagnosis (left), with the number of additional individuals with dup15q syndrome included in parentheses. Right, the number of differentially expressed (DE) (linear mixed model FDR < 0.05) features (genes and transcript isoforms) across the whole cortex (top) or within individual regions (below). d, Absolute value of effect-size changes are shown for differentially expressed genes and isoforms for whole-cortex analyses. Larger effect-size changes are observed at the transcript isoform level. e, Volcano plots show the top differentially expressed genes within regions and across the whole cortex. f, Differential expression effect size (log2FC) of individual regions compared with whole-cortex changes for the 4,223 cortex-wide differentially expressed genes. Slope (S) is calculated using principal components regression, with *P < 0.05 for S significantly different from unity by bootstrap (Methods). g, Top, Venn diagrams depicting the number of genes and isoforms that were differentially expressed across the whole cortex in dup15q samples compared with idiopathic ASD. Bottom, idiopathic ASD whole-cortex log2FC compared to the dup15q whole-cortex log2FC for the ASD whole-cortex differentially expressed genes (left) and isoforms (right). Slope is calculated using principal components regression.

Далее мы попытались определить региональную согласованность этих паттернов, рассчитав дифференциальную экспрессию отдельно в каждом корковом регионе и сравнив региональные изменения размера эффекта (log2 fold change (FC)) с соответствующей сигнатурой всего кортекса (рис. 1e,f, расширенные данные рис. 3, дополнительные данные 2 и методы). Хотя количество дифференциально экспрессирующихся генов значительно варьирует, что может отражать различия в размере выборки (рис. 1c), мы наблюдаем последовательные транскриптомные сигнатуры ASD во всех 11 профилированных областях коры головного мозга, с высоко согласованными изменениями размера эффекта в каждой области по сравнению с сигнатурой всей коры (рис. 1f). Наибольший сигнал мы наблюдали в первичной зрительной коре (BA17) - 3264 дифференциально экспрессированных генов, из которых 59% совпадают с глобальными (рис. 1c,e, расширенные данные рис. 4 и дополнительные данные 2). Кроме того, изменения размера эффекта были значительно больше в BA17 по сравнению с сигналом всей коры, чего не наблюдалось ни для одного из других регионов (рис. 1f и Методы). В совокупности эти результаты демонстрируют последовательную транскриптомную подпись ASD в коре головного мозга, которая наиболее выражена в задней части BA17.

Далее мы оценили дифференциальную экспрессию генов и транскриптов в дополнительных 83 пан-кортикальных образцах от 9 испытуемых с материнским синдромом dup15q, редким генетическим заболеванием, характеризующимся дупликацией в хромосомном регионе 15q11-q13. Синдром Dup15q является одной из наиболее распространенных форм синдромального расстройства аутизма, и ранее было показано, что изменения экспрессии генов у этих испытуемых в значительной степени совпадают с генетическими изменениями при идиопатическом расстройстве аутизма в лобной и височной коре, но с большей величиной эффекта⁵. Мы повторили эти предыдущие результаты в целом по исследованным областям коры, обнаружив значительное совпадение транскриптомных изменений между dup15q и идиопатическим ASD, причем dup15q демонстрирует большую величину нарушений экспрессии генов в целом (рис. 1g, расширенные данные рис. 4 и дополнительные данные 2). BA17 также продемонстрировал наибольшее количество дифференциально экспрессируемых генов при dup15q (расширенные данные рис. 4). Эти результаты показывают, что молекулярная патология, общая для этой редкой генетической формы ASD и идиопатического ASD, широко распространена в различных областях коры головного мозга, и что существуют некоторые общие черты в региональной дисперсии эффекта, при этом оба состояния затрагивают сенсорные области в дополнение к ассоциативным областям более высокого порядка.

В нейротипичном мозге корковые регионы можно различить на основе различий в экспрессии генов, которые в первую очередь отражают изменчивость цито-архитектуры, связности и функции каждого региона, при этом V1 является наиболее отличительным^11-14. Ранее мы наблюдали заметное ослабление этих типичных различий в экспрессии генов между двумя регионами - лобной и височной долей - при ASD^4,5, это мы называем ослаблением транскриптомной региональной идентичности (ARI). Такое значительное снижение величины различий в экспрессии генов между этими двумя ассоциативными областями коры головного мозга позволило предположить изменение в их развитии, связях и/или текущем функционировании при ASD. Здесь мы попытались понять степень этих молекулярных изменений, чтобы определить, являются ли они действительно фокальными или более распространенными, затрагивающими дополнительные ассоциативные или сенсорные области.

Сначала мы систематически сравнивали все уникальные пары из 11 областей коры (всего 55 сравнений), используя консервативный статистический подход, основанный на перестановке, чтобы учесть различия в размере выборки по регионам (рис. 2a и методы). Мы подтвердили надежность наблюдаемых транскриптомных моделей региональной идентичности в контроле, сравнив их с данными из Атласа головного мозга Аллена¹³ (расширенные данные рис. 5, дополнительные данные 4 и методы). Десять пар регионов продемонстрировали значительно более высокий уровень ARI при ASD по сравнению с контролем на основе перестановки, и еще 41 из 55 пар регионов продемонстрировали значительное ослабление в ASD с помощью другого дополнительного подхода, основанного на bootstrap (рис. 2b, расширенные данные рис. 5, дополнительные данные 4 и методы). Эти результаты показывают, что различия в экспрессии генов, которые дифференцируют области коры, значительно уменьшаются при ASD, в результате чего области коры становятся более однородными в молекулярном отношении (расширенные данные рис. 5).

Fig. 2: Cortex-wide transcriptomic regional-identity attenuation in ASD.

Мы заметили, что для девяти из десяти пар регионов, демонстрирующих значительное ослабление в ASD, один из задних регионов BA17 или BA39/40 был задействован (рис. 2c,d). Примечательно, что BA17 также был одним из регионов с наибольшими различиями в экспрессии генов между ASD и контролем. Чтобы определить, как изменения экспрессии генов распределены по регионам в этих парах, мы использовали консервативный процесс фильтрации для выявления отдельных репрезентативных генов, демонстрирующих ARI (Методы и дополнительные данные 4). Хотя эти гены были сильно разрегулированы, наибольшие изменения наблюдались в более задних регионах, BA17 и BA39/40 (рис. 2c,d и расширенные данные рис. 6). Гены ARI также были аналогичным образом нарушены в образцах dup15q (расширенные данные рис. 6), это позволяет предположить, что транскриптомное ослабление региональной идентичности в коре головного мозга является общим для гетерогенных форм ASD. В совокупности эти результаты показывают, что при ASD происходит значительное снижение типичных транскрипционных паттернов, которые дифференцируют регионы коры, причем некоторые задние регионы (BA17 и BA39/40) демонстрируют особенно сильное ослабление (сглаживание).

Чтобы исследовать биологические процессы, способствующие этой широкой дисрегуляции ARI генов с преобладанием задних областей в ASD, мы сгруппировали все гены, обнаруживающие ARI, которые обычно увеличивают экспрессию вдоль передней-задней оси в контроле, но не увеличивают при ASD (ARI downregulated: 1 881 ген; рис. 2c), или те, которые уменьшают экспрессию вдоль этой оси в контроле, но не при ASD (ARI upregulated: 1 695 генов; рис. 2d). Оба типа повышения и понижения регуляции были наиболее заметны в задней части при ASD, с наибольшим эффектом в BA17, а затем в теменной коре (BA39/40). Действительно, гены демонстрировавшие ARI, обнаржиывают значительное совпадение с дифференциально экспрессированными генами, обнаруженными в этих областях, гораздо большее, чем в лобных областях (BA17: P < 1.8 х10^-67; BA39/40: P < 1.7 х 10-¹⁶; BA4/6: P = 0.19; точный тест Фишера). Набор ARI для генов с повышенным уровнем регуляции содержал несколько транскрипционных факторов (TFs), участвующих в кортикальном формировании паттерна, включая SOX4, а также SOX11, который контролирует постнатальную меж-кортикальную связь проекционных нейронов у мыши посредством временного влияния на созревание проекционных нейронов¹⁵. Набор генов с ARI с пониженной регуляцией показал широкое обогащение маркерами, специфичными для типа клеток нейронов, и путями РНК-процессинга, а также генами с известными сайтами связывания ETV4 (рис. 2c). Примечательно, что ген ETV4, который, как известно, играет важную роль в развитии дендритов, связности и пластичности, и его экспрессия, которая обычно выше в задних отделах (BA17), чем в передних (BA4/6), значительно ослаблен, что уменьшает этот градиент при ASD¹⁶. Далее мы охарактеризовали дисрегуляцию генов с ARI с помощью последующего анализа сети ко-экспрессии, что еще больше уточняет топологию и пути, вовлеченные в процесс.

Далее мы использовали взвешенный анализ сети корреляции генов¹⁷ (WGCNA) по всем образцам для разделения генов на кластеры с высоким уровнем ко-экспрессии, называемые модулями. Модули организуют отдельные транскрипционные изменения в кластеры, имеющие общие биологические функции или совместную транскрипционную регуляцию^18-20 (Методы). Мы определили в общей сложности 35 модулей ко-экспрессии генов, которые могут быть обобщены по их eigengene-генам, представляющим первый главный компонент экспрессии генов в модуле. Девять модулей были понижены, а 15 - повышены при ASD (рис. 7 расширенных данных и дополнительные данные 5 и 6). Мы также создали сети, используя количественные показатели уровня транскриптов (изоформ) генов, которые отражают как альтернативный сплайсинг, так и альтернативное использование промоторов, выявив 61 модуль транскриптов (Методы). Из них 39 транскрипционных модулей не пересекались с генными модулями, среди которых 5 были снижены и 9 повышены при ASD по сравнению с контролем (расширенные данные рис. 8 и дополнительные данные 5 и 6). В целом, 38 модулей были повышены или понижены по крайней мере в одном регионе при ASD. Большинство из них разделились на две большие группы: (1) дисрегуляция по всей коре с сопоставимой величиной в разных регионах (18 модулей); или (2) с переменными изменениями в разных регионах (13 модулей). В соответствии с ранее полученными данными в лобной и височной долях изменения dup15q были похожи на те, которые наблюдались при ASD, но были более значительными по величине (рис. 7 и 8 расширенных данных и дополнительные данные 6).

18 модулей генов или транскриптов, демонстрирующих последовательную дисрегуляцию экспрессии при ASD во всех регионах (линейная смешанная модель, FDR < 0.05; рис. 3a, расширенные данные рис. 7 и 8 и дополнительные данные 6), включают: GeneM9, модуль нейронов с повышенным уровнем регуляции и значительным обогащением для небелковых кодирующих генов; GeneM32, сильно повышенный модуль, представляющий реактивные астроциты; и GeneM24, модуль с пониженным уровнем регуляции, обогащенный для эндотелиальных и перицитарных маркерных генов, вовлеченных в функции барьера кровь-мозг (рис. 3b, расширенные данные рис. 7 и дополнительные данные 6). Эти модули повторяют предыдущие данные об изменениях нейронов, реактивности астроцитов и нарушении функции гематоэнцефалического барьера при ASD^1,4-6, но расширяют эти данные, демонстрируя, что эти процессы широко распространены в коре головного мозга и не ограничиваются фронто-темпоральными ассоциативными областями.



Fig. 3: Co-expression network analysis characterizes cortex-wide dysregulation of ASD risk genes.

a, Hierarchical clustering of the top 5 most dysregulated gene and isoform co-expression module eigengenes (first principal component of the module) with regionally consistent patterns of ASD dysregulation. The module eigengene ASD effect is indicated for each cortical region examined (Methods). n indicates the number of genes or isoforms in each module. b, -log₁₀(FDR) for cell-type, genome-wide association study (GWAS), rare-variant and protein-protein interaction enrichment for the modules depicted in a. GWAS references (left margin): ASD.Grove.2019, ref. 21;ADHD.Demontis.2018, ref. 39; EduYears.Lee.2018, ref. 40; Intelligence.Savage.2018, ref. 41; BD.Ruderfer.2018, ref. 42; MDD.Wray.2018, ref. 43; SCZ.Pardinas.2018, ref. 44; IBD.Liu.2015, ref. 45. *Significant enrichment (FDR < 0.05 for cell-type, rare-variant and protein-protein interaction enrichment, and FDR < 0.1 for GWAS enrichment). c,d, For ASD GWAS-enriched modules, IsoformM37 (c) and GeneM5 (d), top gene ontology terms (left) and hub genes (module genes within the top 20 genes with the highest correlation with the module's eigengene) whose gene products participate in a protein-protein interaction with those of any other module gene are depicted along with their PPI partners (right). Node colour is the signed -log₁₀(FDR) of the whole-cortex ASD effect, edges denote direct PPIs, and hub genes are indicated with a black outline. SFARI database²² gene symbols are in bold.

Два из модулей, демонстрирующих дисрегуляцию в коре головного мозга - GeneM5 и изоформаМ37 - показали значительное обогащение для связанных с ASD общих генетических вариаций²¹ (рис. 3b-d). Модуль GeneM5 снижен при ASD, содержит много нейронных генов, вовлеченных в функцию синаптических везикул, цитоскелет и синаптическую пластичность, и значительно пересекается со сниженным синаптическим модулем CTX.M16, ранее идентифицированным Parikshak и др.⁵ в лобной и височной коре (рис. 3a,d и дополнительные данные 5 и 6). В дополнение к общим генетическим вариациям, GeneM5 также значительно обогащен генами, содержащих редкие de novo мутации, нарушающие белки, связанные с ASD, включая гены высокого риска GRIN2A, MYO5A и BTRC22 (Дополнительные данные 5 и 6 и Методы). Модуль GeneM5 обогащен маркерами клеточного типа возбуждающих и тормозящих нейронов коры головного мозга²³ (рис. 7 расширенных данных), что позволяет определить их как точку схождения редких и общих генетических рисков при ASD. Напротив, изоформаМ37 обогащена распространенными вариантами генетического риска ASD (но не редкими мутациями), повышена при ASD и содержит гены, вовлеченные в реакцию теплового шока и сворачивание белков (рис. 3a,c и дополнительные данные 6). Насколько нам известно, это первое сообщение о транскриптомной сигнатуре, связанной с известными вариантами риска ASD, и она указывает на дисрегуляцию белкового гомеостаза при ASD.

Мы обнаружили 13 модулей, которые демонстрировали регионально изменяющиеся паттерны дисрегуляции при ASD (рис. 4a-c, расширенные данные рис. 7, дополнительные данные 6 и методы), все из которых также показали передний-задний градиент экспрессии в нейротипичных образцах. Однако ни один из этих модулей не был значительно обогащен известными генетическими вариантами риска развития БАС. Наиболее выраженные изменения наблюдались в BA17, где четыре модуля показали значительные ассоциации с ASD, которые были обнаружены только в этом регионе. К ним относится GeneM30, модуль OPC с узловыми генами, включая SOX4 и SOX11. Другой модуль, GeneM4, представляет собой модуль тормозных нейронов, содержащий множество генов, важных для различных процессов внутриклеточной сигнализации и созревания, таких как SCN9A (рис. 4a-d и дополнительные данные 5 и 6). Модуль GeneM4 значительно обогащен длинными меж-генными не-кодирующими РНК (lincRNAs) и модулями генов, которые, как сообщалось ранее, ассоциируют с путями активации, связанными с развитием⁵ и передачей сигналов ^1,6 при ASD, хотя мы впервые наблюдаем этот эффект в BA17 (расширенные данные рис. 7).



Fig. 4: Functional characterization of regionally variable transcriptomic dysregulation in ASD.

a, The top 6 most dysregulated modules with regionally variable patterns of dysregulation. The median of the module eigengene (ME), stratified by diagnosis, is depicted for each cortical region examined. *Significant region-specific dysregulation in ASD; **regions with a significantly increased magnitude of effect compared to the whole-cortex effect (Methods). b, Median regressed gene expression for the top three hub genes for GeneM4 (top) and GeneM3 (bottom). c, The whole-cortex ASD effect for modules depicted in a (*FDR < 0.05). Bottom, regions with a significantly increased magnitude of effect compared to the whole-cortex effect in a are listed. d, Cell-type enrichment for regionally variable modules. e, Uniform manifold approximation and projection for dimension reduction (UMAP) plots of snRNA-seq data from around 250,000 cells containing matched ASD and neurotypical control samples across frontal, parietal and occipital cortices, coloured by diagnosis. f,g, UMAP plots coloured by specific cell type (f) and cortical region of origin (g). h, Broad neural cell-type proportions deconvolved from matching bulk methylation array data. No FDR-significant cell proportion shifts were observed in ASD. i, Region-specific effect-size changes for cell-type-specific differentially expressed genes (FDR < 0.001), with BA17 again showing the greatest transcriptomic changes. j, Differentially expressed genes are shown for broad cell classes. k, ETV4 shows posterior-predominant downregulation across multiple cell types in ASD. l, The immune module GeneM7 shows posterior-predominant enrichment among cell-type-specific differentially expressed genes in ASD.

Двенадцать регионально изменяемых модулей показали значительное обогащение для генов, включающих сигнал ARI, что указывает на то, что эти модули способствуют транскриптомной региональной идентичности, которая заключается в нейротипичном контроле, но ослаблена при ASD (расширенные данные рис. 7 и дополнительные данные 6). Шесть из этих модулей были более высоко экспрессированы в задних областях по сравнению с передними областями у нейротипичных испытуемых и были снижены при ASD по всей коре (рис. 4a-d, расширенные данные рис. 7 и дополнительные данные 6). К ним относится GeneM3, нейронный модуль, обогащенный для выработки энергии и нейронных процессов, которые сильно зависят от энергии, таких как транспорт и высвобождение везикул. Четыре модуля были более высоко экспрессированы в передних областях по сравнению с задними областями у нейротипичных испытуемых и демонстрировали повышение уровня регуляции в коре головного мозга при ASD, что ослабляло эту закономерность (рис. 4a-d, расширенные данные рис. 7 и дополнительные данные 6). К ним относятся GeneM8, микроглиальный модуль, содержащий гены, участвующие в иммунной сигнализации и фагоцитозе; и GeneM7, модуль иммунного ответа, содержащий гены, такие как NF-kB и пути ответа на интерферон. Хотя о снижении регуляции нейронов и олигодендроцитов наряду с повышением регуляции иммунитета и микроглии сообщалось ранее при ASD^1,4-6, данные результаты показывают, что эти нарушения регуляции широко распространены по всей коре головного мозга, с увеличением в задних областях, что наиболее выражено в BA17.

Далее мы попытались определить причину наблюдаемых изменений в величине эффекта ASD по регионам. Хорошо известно, что BA17 является наиболее нейронами насыщенной областью человеческого мозга, с заметным увеличением толщины слоя 3/4 (L3/4) по сравнению с другими областями коры¹⁸. Аналогичным образом, существует передний-задний градиент увеличения плотности нейронов, наблюдаемый у мышей и приматов^24-27. Мы предположили, что региональные различия в плотности нейронов или толщине ламинарного слоя могут способствовать региональным различиям в величине эффекта ASD. Региональная плотность нейронов в различных областях мозга не была количественно охарактеризована в мозге человека, но такие градиенты были установлены в некоторых областях у не-человекообразных приматов^25,26. Поэтому мы сравнили региональные изменения размера эффекта ASD в наших генных модулях с региональной плотностью ядер нейронов, измеренной у приматов²⁵ для шести соответствующих регионов у разных видов. Мы наблюдали значительную корреляцию между толщиной L3/4, плотностью нейронов и величиной эффекта для нескольких модулей, нарушаемых при ASD (Дополнительные данные 7).

Эти наблюдения побудили нас провести snRNA-seq в подгруппе испытуемых, чтобы помочь оценить, насколько изменения в экспрессии генов отражают изменения в пропорциях клеток при ASD и насколько различные типы нейронных клеток вносят вклад в региональные различия в транскриптомной дисрегуляции при ASD, выявленные с помощью объемного RNA-seq (рис. 4e-g, расширенные данные рис. 9, дополнительные данные 8 и методы). Мы провели секвенирование более 250 000 ядер у 6 человек с ASD, у которых были выявлены сильные дифференциальные сигнатуры экспрессии, и у 6 соответствующих контрольных субъектов в лобной, теменной и затылочной коре с помощью объемного РНК-секвенирования. Из этих данных мы выделили 26 отдельных клеточных кластеров, которые представляют все ожидаемые типы клеток коры и регионально специфические типы возбуждающих клеток в затылочной коре (рис. 4f, дополнительные данные 8 и методы). Как и ожидалось на основе данных по не-человекообразным приматам, мы наблюдали, что доля поверхностных возбуждающих нейронов (EX1 L3/4) увеличена более чем на 5% в затылочной области как в контрольной группе, так и у испытуемых с расстройством аутистического спектра по сравнению с лобной (префронтальная кора) и/или теменной областями (рис. 4f,g и Дополнительные данные 8). Эти результаты согласуются с известным увеличением толщины L3/4 в BA17 по сравнению с другими областями коры²⁸.

Далее мы провели анализ клеточного состава с использованием данных snRNA-seq, чтобы определить, смещаются ли пропорции клеточных типов при ASD и могут ли они объяснить наблюдаемые основные подписи RNA-seq. Несмотря на номинальное увеличение доли астроцитов (AST1) и уменьшение доли возбуждающих нейронов нижнего слоя (EX7 и EX8), связанное с ASD, изменения были незначительными и отражали номинально значимую тенденцию (P-значения с поправкой FDR > 0,18; рис. 9 расширенных данных и дополнительные данные 8). Чтобы подтвердить эти результаты в более крупной когорте (n = 36 на группу), мы далее провели деконволюцию клеточного типа (CTD), используя данные профилирования метилирования лобной и височной коры головного мозга с подписями, специфичными для клеточного типа, полученными из анализа метиломы одиночных клеток человеческого мозга²⁹. Анализ метилирования CTD выявил номинальное увеличение микроглии в префронтальной коре и уменьшение олигодендроцитов в височной доле при ASD, но никакие сдвиги клеточных пропорций не выдержали коррекции FDR (рис. 4h и дополнительные данные 7). Наконец, чтобы непосредственно оценить, какой вклад пропорции клеточных типов могли внести в наблюдаемые нами эффекты ASD в массовых данных РНК-секвенирования, мы сравнили log2FC ASD, рассчитанные по нашей исходной линейной модели с учетом и без учета пропорций клеточных типов метилирования CTD в качестве коварианс (рис. 9 расширенных данных, дополнительные данные 7 и методы). Корреляции Spearman между log₂FC ASD с метилированием CTD и без него были высокими (p > 0,7; расширенные данные рис. 9 и дополнительные данные 7), что указывает на то, что пропорции клеточных типов не оказывают существенного влияния на изменения, связанные с ASD, которые мы наблюдали с помощью объемных данных РНК-секвенирования. Хотя эти результаты могут указывать на несколько тонких изменений в пропорциях типов клеток коры при ASD, изменения в пропорциях клеток не могут объяснить широко распространенную транскриптомную подпись, наблюдаемую в объемном РНК-секвенировании.

Альтернативное объяснение заключается в том, что объемные транскриптомные сигнатуры и модули, связанные с ASD, в первую очередь отражают внутриклеточные изменения экспрессии генов, которые наиболее заметны в задних областях. Чтобы оценить это на основе данных snRNA-seq, мы рассчитали клеточно-специфические дифференциальные сигнатуры генной экспрессии при ASD в лобной, теменной и затылочной областях (Методы). Здесь мы снова наблюдали заметный региональный градиент: в три-четыре раза больше дифференциально экспрессированных генов наблюдалось в затылочных и теменных типах клеток, чем в префронтальной коре (n = 23,144, 17,042 и 5,235 генов, дифференциально экспрессированных в целом по 26 кластерам клеток при FDR<0.001, соответственно; рис. 4i, дополнительные данные 8 и методы). Эта картина сохранялась после уменьшения выборки для обеспечения одинакового количества клеток для сравнения. Большинство дифференциальных изменений экспрессии происходило от возбуждающих нейронов в разных регионах, при этом классы возбуждающих нейронов в затылочной доле демонстрировали наибольший дифференциальный сигнал экспрессии в целом, как по количеству дифференциально экспрессируемых генов, так и по величине эффекта (рис. 4i,j и Дополнительные данные 8). В качестве примера, мы наблюдаем, что транскрипционный фактор ETV4 - один из генов с ARI при объемном РНК-секвенировании - демонстрирует значительное снижение экспрессии в нескольких различных типах клеток затылочной доли, включая возбуждающие нейроны и олигодендроциты (рис. 4k и дополнительные данные 8). Наконец, мы обнаружили заметное совпадение с результатами ко-экспрессии РНК-сегмента: 90 из 96 модулей генов и изоформ демонстрируют значительное обогащение среди клеточно-специфических дифференциально экспрессированных генов (с поправкой FDR P < 0.05, точный тест Фишера; дополнительные данные 8 и методы). Например, модуль GeneM5, покрывающий гены риска ASD, был сильно обогащен сигналами дифференциальной экспрессии генов по клеточному типу в 21 классе клеток, в частности, включая пониженные гены, обнаруженные в нескольких подтипах олигодендроцитов и возбуждающих нейронов. Аналогичным образом, обогащенный ASD GWAS модуль изоформы теплового шока (IsoformM37) показал значительное совпадение с повышающимися генами почти во всех типах клеток. Подобные закономерности обогащения наблюдались и для регионально специфических модулей. Например, иммунный модуль GeneM7, имеющий заднее преобладание, обогащен для сигнала дифференциальной экспрессии ASD во всех основных типах глиальных клеток, с задним преобладанием паттерна обогащения (рис. 4k).

Таким образом, проведя мультирегиональный snRNA-seq и CTD, мы показали, что предсказанные пропорции клеточных типов, а также профили экспрессии генов, специфичные для клеточных типов, изменены в коре головного мозга при аутизме. Примечательно, что дисрегуляция транскриптома, специфичная для клеточного типа, вносит существенный вклад в изменения, наблюдаемые при объемном РНК-секвенировании, в то время как вклад пропорций клеточных типов малозаметен (рис. 9 расширенных данных и дополнительные данные 7 и 8). Хотя транскриптомные изменения, специфичные для клеточного типа, и изменения пропорции клеточных типов вносят свой вклад в паттерны экспрессии генов ASD, наблюдаемые с помощью объемного РНК-секвенирования, наш анализ показывает, что изменения экспрессии генов, специфичные для клеточного типа, объясняют большинство наблюдаемых изменений в экспрессии генов объемных тканей.

Представленные здесь результаты существенно уточняют наше понимание молекулярной патологии ASD, выходя за рамки ранее установленных функциональных категорий "подавление нейронов" и "повышение глии/иммунитета", наблюдаемых в лобных и височных долях^1,4,5,6,30. Мы выявили изменения экспрессии генов и транскриптов при ASD, которые происходят во всей коре головного мозга, затрагивая многие типы нейронов и специфические биологические процессы (расширенные данные рис. 10), выходя за пределы ассоциативных областей высшего порядка и включая первичные сенсорные области, особенно в BA17^1,4-6. Мы обнаружили, что недавно замеченные сигнатуры экспрессии генов, включающие повышение уровня реактивных астроцитов и снижение уровня транспорта через мембраны гематоэнцефалического барьера¹, присутствуют во всей коре головного мозга при ASD. Удивительно, но наиболее глубокие изменения экспрессии генов при ASD наблюдались в первичной зрительной коре (BA17). Интересно предположить, что существенные изменения, наблюдаемые в первичных сенсорных областях, могут быть связаны с широко распространенными различиями в сенсорной обработке при ASD, которые настолько распространены, что были включены в диагностические критерии DSM-531.

Мы обнаружили, что повышенные уровни генов иммунного ответа и реактивной микроглии, наряду с пониженными генами морфогенеза нейритов и энергетического пути нейронов, не только влияют на всю кору головного мозга при ASD, но и демонстрируют региональный градиент, который отражает фундаментальные элементы цито-архитектуры коры. Примечательно, что величина региональных дифференциальных изменений экспрессии при ASD параллельна наблюдаемым паттернам ARI, что согласуется с тем, что они представляют собой проявления общего базового биологического процесса. Учитывая эти результаты, а также наши наблюдения за повсеместной дисрегуляцией нейронов, присутствующей в коре головного мозга при ASD, будущая работа должна определить, как изменения в генах риска ASD влияют на структуру коры и связь. Это особенно важно, поскольку ARI при ASD может быть проявлением раннего изменения в развитии arealization коры, которая включает как внутренние факторы клетки (например, генетические или эпигенетические регуляторные программы), так и реакции на внешние сигналы, такие как градиенты морфогенов и таламические воздействия²⁷. Учитывая связь между региональной цито-архитектурой, локальными цепями и дальними связями мозга^32,33, можно предположить, что в дополнение к вкладу в формирование паттерна развития^5,20, уменьшение транскриптомной региональной идентичности отражает изменения в функции локальных нейронных цепей и изменения в синаптическом гомеостазе, которые широко распространяются³². Это подтверждается наблюдением, что модуль ко-экспрессии GeneM5, представляющий гены синаптической пластичности, при ASD снижен по всей коре головного мозга. Кроме того, GeneM5 обогащен генами, содержащими как распространенные, так и редкие варианты риска, связанные с ASD, что согласуется с тем, что подавление этого модуля играет причинную роль в ASD. Хотя единичный посмертный снимок не может различить вышеуказанные механизмы, наши результаты дают веские основания для их дальнейшего экспериментального изучения, например, с помощью геномного профилирования мозга человека на ранних стадиях развития³⁴ и разработки органоидных систем, воспроизводящих региональную идентичность.

При интерпретации этих результатов следует руководствоваться несколькими техническими и биологическими соображениями. Использованные образцы были получены из неоднородной посмертной ткани коры головного мозга, представляющей широкий спектр субъектов обоих полов в возрасте от 2 до 68 лет. Для учета биологической и технической вариабельности использовалась строгая методология, обеспечивающая консервативность и обобщаемость представленных здесь результатов. Для решения вопросов клеточного разрешения и вариабельности рассечения по регионам коры головного мозга мы провели snRNA-seq, что еще больше углубило наше понимание региональных вариаций в транскриптомной дисрегуляции ASD. Однако эксперименты с snRNA-seq обычно содержат меньше уникальных образцов, чем эксперименты с объемным РНК-seq, и сопоставимость пропорций клеточных типов snRNA-seq с истинными пропорциями клеточных типов в настоящее время неясна³⁵. Также сложно оценить транскрипты количественно с помощью одноклеточных РНК-секвенирований, тогда как это остается сильной стороной объемных тканевых РНК-секвенирований, особенно в сочетании с сетевым анализом³⁶. Используя это, мы впоследствии определили модуль коэкспрессии специфических транскриптов, обогащенный вариантами ASD GWAS, что впервые указывает на дисфункцию упаковки белков как на предполагаемый путь, способствующий причинно-следственным механизмам ASD. Примечательно, что повышенный протеостаз также связан с синдромом Дауна³⁷, а аналогичный механизм теплового шока был определен как потенциальная мишень для лекарств в комплексе туберозного склероза³⁸, что указывает на то, что это может быть затронутым биологическим процессом при многочисленных нарушениях нейрального развития. Использование методов с большим клеточным разрешением будет необходимо для дальнейшего уточнения представленных здесь результатов для конкретных типов клеток коры головного мозга. Поскольку мы стремимся получить полное понимание нейронной патологии ASD, будущие подходы, объединяющие различные источники биологических данных - включая этот транскриптомный ресурс для всей коры - будут использоваться для определения того, как гены риска ASD влияют на головной мозг, будут очень важны.