Глаукома, прогрессирующая нейропатия зрительного нерва, характеризующаяся дегенерацией ганглиолярных клеток сетчатки (RGC) и потерей зрения, поражает более 70 миллионов человек во всем мире (1). Хотя глаукома является многофакторным заболеванием (2), повышенное внутриглазное давление (IOP ) является основным фактором риска, а генетические отклонения могут влиять на возникновение и прогрессирование заболевания. Предыдущие исследования геномной ассоциации выявили однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) локуса ABCA1 как общий генетический фактор риска первичной открытоугольной глаукомы (3-6), но причинно-следственная связь между вариациями ABCA1 и глаукомой остается неясной.

ABCA1 - это мембранный белок, опосредующий множество функций, включая фосфолипидный scrambling (7), фагоцитоз (8), иммунно-клеточную регуляцию (9), контроль эндоцитоза/экзоцитоза (10), регуляцию внутриклеточной сигнализации (11), противовоспалительную функцию (12) и транспорт холестерина и фосфолипидов к внеклеточным аполипопротеинам без липидов (13). Предыдущее сообщение показало, что ABCA1 экспрессируется на высоком уровне в астроцитах головного мозга (8), но оставалось неясным, экспрессируют ли клетки астроцитарного ряда ABCA1 в глазной ткани. Астроциты - это не-нейрональный тип клеток в центральной нервной системе (ЦНС), которые контролируют гомеостаз ЦНС, образование синапсов и синаптическую функцию. В патологических условиях астроциты приобретают либо нейропротекторный (14), либо нейротоксический фенотип (15-17). Нейротоксичные астроциты с нарушенной регуляцией могут участвовать в патогенезе различных нейродегенеративных заболеваний (18). В дополнение к нейродегенеративным заболеваниям ЦНС, астроциты с нарушенной регуляцией могут вызывать дегенерацию RGC в модели хронической глазной гипертензии (19), широко используемой модели глаукомы.

Астроциты в нормальной сетчатке локализуются на самой внутренней поверхности, где они образуют сетчатую сеть у различных видов, включая грызунов (20), свиней (21), обезьян (22) и людей (23). Их торцевые поверхности плотно соприкасаются с кровеносными сосудами и аксонами RGC Помимо сетчатки, астроциты высоко обогащены в optic nerve head (ONH) у мышей (24), обезьян (25) и людей (26). ONH является одной из наиболее чувствительных и уязвимых частей глазной ткани в процессе патогенеза глаукомы (27). У различных видов, упомянутых выше, астроциты ONH образуют глиальную трубку в глиальной пластинке [lamina cribrosa-like glial structure without extracellular matrix plate (24)], через которую аксоны прокладывают пути и обеспечивают нейротрофическую и гомеостатическую поддержку. У пациентов с глаукомой астроциты ONH изменяют свою гипертрофию и морфологию (28) и вызывают ремоделирование ткани, которое снижает структурную поддержку для аксонов. Такие астроцитарные изменения являются одним из самых ранних событий, происходящих в животных моделях глаукомы, и часто наблюдаются до повреждения аксонов (29). Возможность того, что дисфункция астроцитов играет важную роль в развитии глаукомной нейропатии зрительного нерва, позволяет предложить ранее не идентифицированную терапевтическую стратегию для лечения глаукомы. Во-первых, до сих пор неизвестно, имеет ли значение в патогенезе глаукомы усиление нейротоксичности или потеря функции ABCA1. Во-вторых, предыдущие отчеты показали, что SNPs в локусе рядом с ABCA1 связаны с повышенным риском развития как normal-tension glaucoma (NTG), так и гипертонической глаукомы. Если ABCA1 действительно является причинным геном глаукомы, то остается неясным, требуется ли высокое IOP для прогрессирования глаукомы и вызывает ли потеря функции ABCA1 высокое IOP . В-третьих, хотя предыдущие данные показали пространственные закономерности экспрессии ABCA1, неясно, какие типы клеток экспрессируют ABCA1 в глазной ткани. Соответственно, тип клеток, вызывающий ABCA1-ассоциированную глаукому, неизвестен. В-четвертых, сетчатка имеет множество подтипов RGC (30, 31), и мало что известно о том, какие подтипы RGC чувствительны к глаукоме. Таким образом, выявление чувствительных к глаукоме RGC может способствовать разработке методов лечения глаукомы.

Наши данные показывают, что дисфункция астроцитов в результате дефицита Abca1 вызывает у мышей фенотипы, похожие на оптическую нейропатию, не влияя на IOP . Хотя в сетчатке грызунов отсутствуют некоторые анатомические структуры, наблюдаемые у людей, включая макулу и пластинки внеклеточного матрикса lamina cribrosa, мыши Glia-KO продемонстрировали несколько анатомических особенностей, потенциально относящихся к NTG: возраст-ассоциированную дегенерацию RGC, отек и потерю ON, истончение внутренних слоев сетчатки, потерю синапсов и снижение глазных реакций. Пока неясно, снижают ли SNPs, обнаруженные у пациентов с глаукомой, функцию ABCA1, но некоторые мышиные модели глаукомы обнаруживают снижение Abca1 в сетчатке на 15-50% (33, 49). Предыдущее исследование показало, что избыточная экспрессия человеческого ABCA1 защищает RGC от экспериментальной глаукомы у мышей (50). Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что потеря ABCA1 связана с повреждением RGC. Настоящее исследование показало, что потеря функции ABCA1, а не усиление токсической функции, особенно в астроцитах, имеет важное значение для запуска возраст-ассоциированной нейропатии зрительного нерва.

Мы определили, что типом клеток, высоко экспрессирующих ABCA1 в сетчатке, являются астроциты, в дополнение к более низким уровням экспрессии в ранее зарегистрированных типах клеток, таких как пигментный эпителий сетчатки, клетки моноцитарного ряда и фоторецепторы. Хотя база данных scRNA-seq, предоставленная Human Protein Atlas Project, также показывает обогащение мРНК ABCA1 в фоторецепторах (колбочковых клетках) и BCs сетчатки человека (51), она не содержит популяции астроцитов сетчатки. Другая база данных по человеку также показала, что колбочковые клетки и BCs являются типами клеток, наиболее обогащенными по экспрессии ABCA1, тогда как астроциты занимают третье место (52). Одно из возможных объяснений - различия в стабильности белка ABCA1 между типами клеток. Например, оксистерол-связывающий белок (OSBP) негативно регулирует стабильность белка ABCA1 (53). Экспрессия OSBP2 в фоторецепторах колбочках и BCs была в 6,7- и 17,7 раз выше, чем в астроцитах сетчатки человека (52). Кроме того, экспрессия OSBP-related protein 8, еще одного негативного регулятора экспрессии ABCA1 (54), была в пять раз выше в этих типах клеток по сравнению с астроцитами (52). Условное удаление Abca1 в фоторецепторах колбочек не вызвало нейродегенерации (55), что указывает на то, что эти типы клеток играют лишь незначительную роль (если вообще играют) в ABCA1-опосредованном повреждении RGC Клетки Müller человека и RGC также экспрессируют мРНК ABCA1 на незначительном уровне (52), что согласуется с нашими результатами. Кроме того, белок ABCA1 в сетчатке человека был обнаружен в виде волокнистого рисунка во внутреннем слое сетчатки и не перекрывался с сигналом 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) в GCL, который предположительно указывает на RGC (3). В другом исследовании на человеке также сообщалось о сильной экспрессии ABCA1 в глиальной трубке ON (4), что позволяет предположить, что астроциты, но не RGC , могут экспрессировать ABCA1 в глазной ткани человека. Поскольку астроциты плотно обхватывают аксоны RGC , дисфункция астроцитов могла бы непосредственно привести к нарушению аксона и повреждению RGC В соответствии с этими ожиданиями, у мышей Glia-KO наблюдался апоптоз RGC , но не других нейронов сетчатки. Мы также обнаружили, что белок и мРНК ABCA1 были высоко обогащены в ONH и ON (зрительном нерве), где нет колбочковых клеток, BCs или клеток Müller. На основании этих предыдущих исследований и наших данных мы пришли к выводу, что ABCA1 обогащен в астроцитах. Насколько нам известно, это первое сообщение, демонстрирующее, что ABCA1 высоко экспрессируется в глазных астроцитах.

Наши результаты показывают потерю ON и гибель RGC у мышей Glia-KO. Аналогично, топографическая потеря тел RGC и ON была зарегистрирована при глаукоме у человека (38, 56). В настоящем исследовании мы не изучали топографическую потерю тел RGC , но она будет оценена в будущем исследовании. Вместо этого мы наблюдали региональную потерю ON в горизонтальных срезах ON, а также региональное нарушение глазной функции при mfERG. Полученные результаты позволяют предположить, что у мышей Glia-KO имеется топологическое повреждение RGC В ONH у мышей Glia-KO наблюдалась потеря аксональных маркеров в задней части глиальной пластинки, что согласуется с предыдущими сообщениями о моделях глаукомы у животных (36, 37) и пациентов (28). Такое сходство в повреждении тканей позволяет предположить, что мыши Glia-KO демонстрируют фенотипы, потенциально имеющие отношение к глаукоме.

Дегенерация RGC не наблюдалась в молодом возрасте, хотя астроциты уже стали гипертрофированными. Поскольку астроциты играют важную роль в возникновении и/или прогрессировании нейродегенеративных заболеваний (57, 58), а чрезмерное повышение реактивности астроцитов ускоряет гибель нейронов (15), гипертрофированные астроциты у 3-месячных мышей Glia-KO могут отражать начало заболевания. Для повреждения RGC может потребоваться длительное накопление аномалий астроцитов. В 3 месяца астроциты после нокаута могут быть уже нейротоксичными, но защитная природа окружающих клеток и устойчивость RGC к дисфункции астроцитов предотвращает потерю RGC В таких случаях потеря защитных механизмов и устойчивости, связанная со старением, может вызвать повреждение RGCs. Другая возможность заключается в том, что молодые астроциты после нокаута менее травматичны и с возрастом становятся более нейротоксичными. В поддержку этой гипотезы астроциты после нокаутов показали различную гипертрофию в 3 и 12 месяцев. Поскольку в возрастных нокаутных астроцитах наблюдалось значительное повышение экспрессии хемокинов, воспаление может способствовать возрастному увеличению нейротоксичности астроцитов. Кроме того, возрастные нокаутные астроциты были менее гипертрофированы. Потеря гипертрофии астроцитов усугубляет вызванную глазной гипертензией потерю RGC (59). После травмы мозга гипертрофированные астроциты важны для ограничения воспаления и защиты нейронов (14). Соответственно, снижение гипертрофии астроцитов может быть связано с потерей ими нейропротекторных и противовоспалительных функций. В сочетании с потерей защитных функций и усилением нейротоксичности астроцитов, RGC и другие типы клеток могут вызвать дегенерацию RGC

В настоящем исследовании скорость потери RGC была относительно небольшой, что сходно с геном белка-предшественника амилоида (APP) со шведской мутацией и геном presenilin 1 (PS1) с делецией экзона 9 у мышей (15) в том, что обе модели демонстрируют тяжелые патологические фенотипы и измененную гипертрофию астроцитов. У мышей Glia-KO уже в 3 месяца наблюдалась гипертрофия астроцитов сетчатки, за которой следовала гибель RGC , что позволяет предположить, что фенотипические изменения астроцитов сетчатки важны для начала неклеточной автономной гибели RGC и индукции глаукома-подобного фенотипа. В мышиной модели болезни Альцгеймера APP/PS1 выраженность астроглиоза хорошо связана с выраженностью симптомов болезни (15). Для этого астроцитарный MAOB-опосредованное появление H₂O₂ играет критическую роль. В модели болезни Хантингтона (HD) избыточная экспрессия мутантного гена huntingtin в астроцитах вызывает патологию, подобную HD (57). Мутантный huntingtin снижает уровень астроцитарного транспортера глутамата и вызывает excitotoxicity в соседних нейронах, тем самым приводя к фенотипу HD. В модели amyotrophic lateral sclerosis (ALS) астроциты с мутантным SOD1 усиливали прогрессирование ALS путем активации микроглиальной индуцибельной синтазы оксида азота (58). Таким образом, хотя способ астроцитарного вклада варьируется от заболевания к заболеванию, внеклеточные автономные механизмы, осуществляемые астроцитами, по-видимому, являются общими для многих заболеваний ЦНС, что подтверждается и в настоящем исследовании.

Воспалительный ответ астроцитов, вызванный дефицитом ABCA1, может быть частично опосредован накоплением холестерина, основного субстрата ABCA1. Предыдущее исследование показало, что накопление холестерина усиливает опосредованный Toll-подобным рецептором (TLR) воспалительный сигнал (60). Поскольку TLR локализуется в богатых холестерином липидных микродоменах (также называемых липидными плотиками ) в плазматической мембране, избыток холестерина усиливает TLR-опосредованную сигнализацию. В соответствии с этим представлением, наши данные РНК-секвенирования показали повышенную регуляцию PRR и NF-κB, двух основных мишеней TLR-сигнализации. Дефицит ABCA1 в астроцитах также может быть причиной недостаточного снабжения нейронов холестерином. Нарушение доставки холестерина от астроцитов к нейронам вызывает нейродегенеративные заболевания (61), а недостаток холестерина в нейронах опосредует excitotoxicity и гибель нейронов (62). Поскольку холестерин, выделяемый астроцитами, может быть необходим для синаптогенеза в RGC (63), дефицит ABCA1 в астроцитах также может вызвать потерю синапсов в RGC В соответствии с этим представлением, у мышей Glia-KO наблюдалось уменьшенное количество синапсов в IPL. В целом, предыдущие сообщения и наши результаты позволяют предположить, что воспаление, потеря синапсов и дегенерация RGC , вызванные дефицитом ABCA1, могут быть частично опосредованы холестерином.

Накопленные данные свидетельствует о том, что воспаление является ключевым процессом в патогенезе глаукомы. Повышенные воспалительные сигналы можно обнаружить в сетчатке пациентов с глаукомой (64). Астроциты играют центральную роль в воспалении глаза человека при глаукоме (64). Проведенный нами анализ scRNA-seq показал, что в астроцитах и RGC наблюдается повышенная регуляция воспалительных путей (например, HMGB1, PRRs и NF-κB) и хемокиновых путей (например, CXCR4, CCR3 и CCR5). Более того, Abca1-дефицитные астроциты обнаруживали более высокие уровни CXCL12 и CCL5, агонистов этих рецепторов. И CCL5, и CXCL12 экспрессируются в глазной ткани пациентов с глаукомой (65, 66). Поскольку наши результаты и данные scRNA-seq человека (52) показали экспрессию CXCR4 и CCR5 в RGC, хемокины, полученные из астроцитов, вероятно, направлены на RGC. Хотя CXCL12 также проявляет нейропротекторный эффект, CXCL12, укороченный матриксной металлопротеиназой, обладает высокой нейротоксичностью (67). Примечательно, что поскольку матричная металлопротеиназа часто связана с воспалением, сигналы таких хемокинов могут быть преобразованы в нейротоксические сигналы. Дефицит ABCA1 также может снижать противовоспалительные реакции путем снижения регуляции передачи сигналов JAK2/STAT3 (Janus kinase 2/signal transducer and activator of transcription 3) (68).

Хотя предыдущие анализы scRNA-seq выявили гетерогенность RGC (30), включая различия в устойчивости или чувствительности к раздавливанию ON (ONC) (31), было неизвестно, является ли какой-либо конкретный подтип RGC чувствительным к глаукоме, особенно к NTG. Мы выявили новый подкласс RGC, который чувствителен к удалению Abca1 и высоко экспрессирует Grin3a (который кодирует NR3A). NR3A функционирует как "доминантно-отрицательная" субъединица в NMDA-рецепторах для снижения проницаемости Ca²⁺ (46). Потеря Grin3a в клетках RGC-1 может привести к Ca²⁺ excitotoxicity (цитотоксичности от внешнего воздействия) (46, 48), что является общим нейродегенеративным механизмом при различных неврологических заболеваниях. Тот факт, что дисрегуляция GRIN3A/NR3A связана с нейродегенеративными заболеваниями человека (69), дополнительно подтверждает наши DFA результаты. Кроме того, наши результаты показали снижение GABAergic передачи сигналов в RGC-1. В дополнение к клеточно-автономному механизму мы наблюдали снижение пути деградации putrescine и пути MAOB-опосредованного производства GABA, который важен для тонического торможения, опосредованного астроцитами (15). Таким образом, возможно, что снижение торможения, обеспечиваемого астроцитами, усиливает excitotoxicity RGC Более того, поскольку культивируемые астроциты после нокаута показали значительное увеличение внеклеточного уровня глутамата, потеря ABCA1 может усиливать высвобождение глутамата или уменьшать его поглощение астроцитами. Нарушение баланса между тормозными и возбуждающими сигналами астроцитов может также опосредовать внеклеточный автономный механизм повреждения excitotoxicity RGC , способствуя тем самым развитию ретинопатии у мышей Glia-KO. Предыдущие исследования scRNA-seq выявили 45 подклассов RGC (30, 31), из которых Grin3a экспрессировался в 16 подклассах, занимающих ~25% от общей популяции RGC [как рассчитано с помощью Subtype Gene Browser (30, 31)]. Четыре подкласса RGC экспрессировали Grin3a в контрольных условиях, но демонстрировали значительно сниженную экспрессию по сравнению с ONC: C4, C28, C31 и C43. Эти подклассы RGC включали α-RGC , F-RGC и ip-RGC Среди этих классов только F-RGC (RGC , выбирающие направление (70)) были чувствительны как к ONC, так и к глазной гипертензии (31, 71). В соответствии с уязвимостью избирательно направляемых RGC в мышиных моделях глаукомы, у пациентов с глаукомой чувствительность к движению нарушалась ещё до потери поля зрения (72). Исходя из этих данных, наиболее вероятным кандидатом для RGC-1, по-видимому, являются селективно направляемые RGCs.

Многие исследования, включая модели глаукомы у не-человекообразных приматов, продемонстрировали excitotoxicity в RGC (73). Наши результаты выявляют возможную связь между хемокиновой сигнализацией и excitotoxicity в RGC Известно, что CXCR4 и CCR5 способствуют гибели нейронов (74). CCL5 способствует высвобождению глутамата из нейронов (75), а CXCL12 связан с глутаматергической сигнализацией и NMDAR-опосредованной нейротоксичностью (76). Кроме того, снижение уровня холестерина в нейронах опосредует excitotoxicity (62). В совокупности эти данные позволяют предположить, что ассоциация между хемокинами, вырабатываемыми астроцитами, и снижением поступления холестерина усиливает excitotoxicity в РГЦ. Тот факт, что RGC мышей Glia-KO демонстрируют более высокую уязвимость к excitotoxicity, подтверждает эту возможность. Однако трудно защитить RGC только путем ингибирования глутаматергической сигнализации у пациентов (77), поскольку глаукома является многофакторным заболеванием, и другие факторы, такие как окислительный стресс, могут способствовать гибели RGC Мы также наблюдали повышение регуляции путей окислительного стресса в RGC нокаутных мышей, что позволяет предположить, что избыток возбуждающей сигнализации сопровождался другими патологическими изменениями, вызывающими дегенерацию RGC , такими как окислительный стресс. Соответственно, для лечения глаукомы может потребоваться ингибирование нескольких мишеней. Как показано на рис. 8, наши результаты демонстрируют, что дефицит Abca1, особенно в астроцитах, вызывает возраст-ассоциированные фенотипы, похожие на оптическую нейропатию, без изменений IOP . Астроцитарный ABCA1 может быть важным патогенным фактором нейропатии зрительного нерва и потенциальной молекулярной мишенью для лечения глаукомы, особенно NTG.



Fig. 8. Astrocytic ABCA1-triggered pathogenesis of optic

neuropathy.

In summary, loss of astrocytic ABCA1 caused optic neuropathy-like phenotypes. (A) Glia-KO mice showed age-associated optic neuropathy-like phenotypes such as RGC degeneration, retinal thinning, axonal damage, and visual dysfunction without IOP changes. (B) At the cellular level, ABCA1-deficient astrocytes showed impaired efflux and intracellular accumulation of cholesterol. Aged astrocytes reduced their hypertrophy and triggered inflammation by producing chemokines such as CXCL12 and CCL5, which would target CXCR4 and CCR5 expressed on RGCs. A subclass of RGCs (i.e., RGC-1) was sensitive to Abca1 deletion. RGC-1 expressed high levels of the NR3A subunit gene (Grin3a), which reduces Ca2+ permeability of the NMDA receptor channel. In Glia-KO mice, RGC-1 reduced Grin3a expression, and RGCs exhibited higher sensitivity to NMDA-evoked excitotoxicity. Thus, astrocyte-derived chemokines may enhance NMDA receptor-mediated excitotoxicity of RGC-1.