В наших предыдущих исследованиях мы показали, что острый нокдаун TSC22D4 способствует инсулин-индуцированному фосфорилированию Akt как в культивируемых первичных гепатоцитах, так и в печени мыши (7). Чтобы понять молекулярные механизмы действия TSC22D4 на сигнальный путь инсулина, мы подробно изучили функциональные домены белка TSC22D4. TSC22D4 не содержит никаких доменов с известной функцией, кроме TSC-бокса, который содержит лейциновую застежку-молнию (рис. 1А). TSC-бокс является общим для всех членов семейства TSC22 и играет роль в гомодимеризации или гетеродимеризации членов семейства TSC22 друг с другом (8, 16). Проведя анализ Clustal Omega, мы идентифицировали две другие области 1 и 2 (R1 и R2) на N-конце TSC22D4, которые высоко консервативны от рыб до млекопитающих (рис. 1A и рис. S1) (17). Основная последовательность, фланкирующая R2 и TSC-бокс (от 105 до 308 аминокислот), также высоко консервативна между людьми и мышами, но не содержит какой-либо определенной трехмерной структуры и относится к категории внутренне неупорядоченных областей (рис. 1A и рис. S1). До недавнего времени внутренне неупорядоченные области в основном игнорировались из-за отсутствия определенной трехмерной структуры, однако эти области содержат множество различных сайтов пост-трансляционной модификации (PTM) (18). Такое разнообразие и множественность PTM в пределах внутренне неупорядоченных областей позволяет белкам выступать в качестве критических сенсоров сигналов окружающей среды, что позволяет им действовать в качестве концентраторов для перекрестных связей между сигнальными путями.



Fig. 1. TSC22D4 interacts with Akt1.

(A) Illustration of TSC22D4 protein with evolutionarily conserved domains. (B) Endogenous TSC22D4 from the wild-type (WT) mouse liver lysates was immunoprecipitated (IP) with TSC22D4 antibody, and the IPs and liver lysates (input) were immunoblotted (IB) with indicated antibodies. Normal rabbit IgG antibody was used as a negative control to TSC22D4 antibody. (C) Flag-TSC22D4 was IP from the liver lysates of mice that were injected with adenoviruses (AVs) containing empty vector control or Flag-TSC22D4 cDNA. The mice were starved for 16 hours and refed the next day before euthanasia. The IPs and WCLs were immunoblotted with indicated antibodies. Right: Quantification of Akt1 signal intensity in the IPs normalized to Akt1 signal intensity in the whole liver lysates. F, fasted; R, refed. Statistical analysis: One-way analysis of variance (ANOVA) followed by Sidak's multiple comparison test. *P < 0.05. (D) Hepa 1-6 cells were transiently transfected with vector control or cotransfected with Flag-TSC22D4 (2.5 µg) and HA-Akt1 (2.5 µg) plasmids. Thirty hours after transfection, cells were serum- and glucose-starved overnight. Cells were pretreated without or with glucose (20 mM) for 30 min and incubated in the absence or presence of insulin (100 nM) for an additional 30 min and then lysed. Flag-TSC22D4 was immunoprecipitated with anti-Flag affinity gel, and the IPs and whole cell lysates (WCLs) were immunoblotted with indicated antibodies. Right: Quantification of HA-Akt1 signal intensity in the IPs normalized to HA-Akt1 signal intensity in the WCLs. Statistical analysis: One-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons test. *P < 0.05 and **P < 0.001. (E) Flag-TSC22D4 was immunoprecipitated with Flag affinity gel from liver lysates of 6-hour starved and insulin-injected mice (1.3 U/kg for 10 min). IPs and whole liver lysates (input) were immunoblotted with indicated antibodies.

...

Нарушения сигнального пути инсулин/Акт играет ключевую роль в патогенезе инсулинорезистентности и диабета 2 типа. Здесь мы обнаружили, что фактор TSC22D4 является новым Akt1-связывающим белком. Взаимодействие TSC22D4-Akt1 отвечает на метаболические сигналы и регулирует функцию Akt как в культивируемых клетках, так и у мышей. Поскольку нокдаун TSC22D4 усиливает гипергликемию и инсулинорезистентность у мышей-диабетиков (7), мы первоначально предположили, что взаимодействие TSC22D4-Akt1 является вредным и нарушает метаболический гомеостаз. Однако, к нашему удивлению, мы обнаружили, что взаимодействие TSC22D4-Akt1 на самом деле играет положительную роль и улучшает метаболизм глюкозы при диете HF/HS. На основании наших предыдущих и последних результатов мы постулируем следующую рабочую модель (рис. 6): В нормальных условиях голодание способствует развитию взаимодействия TSC22D4-Akt1, которое ослабевает при высоком уровне глюкозы и инсулина во время питания. В условиях хронической гипергликемии и гиперинсулинемии, однако, TSC22D4 не может взаимодействовать с Akt1 и способствует развитию инсулинорезистентности и гипергликемии. Поэтому, когда мы вырубаем TSC22D4 в мышиных моделях инсулинорезистентности и диабета 2 типа, мы наблюдаем улучшение метаболического профиля (7). Однако когда мы усиливаем взаимодействие TSC22D4-Akt1, экспрессируя аллель D2 + TSC, мы больше не наблюдаем его негативного влияния на метаболизм глюкозы. В целом, установление более сильного взаимодействия TSC22D4-Akt1 улучшает метаболизм глюкозы и ослабляет инсулинорезистентность. Аналогичным образом, энергетическая депривация и окислительный стресс также усиливают взаимодействие TSC22D4-Akt1, что может быть механизмом того, как физическая активность и умеренные уровни ROS улучшают метаболизм глюкозы и чувствительность к инсулину (28, 29). Возможно, сильное взаимодействие между D2 + TSC и Akt1 улучшает метаболические параметры, создавая псевдоусловия для голодания и физической нагрузки.



Fig. 6. Working model.

TSC22D4 and Akt1 interact indirectly via protein(s) yet to be identified, which is arbitrarily depicted as an orange ellipse. TSC22D4 interacts with Akt most strongly under conditions of energy deprivation. Elevated glucose and insulin levels weaken the TSC22D4-Akt1 interaction. Under conditions of chronic hyperglycemia and hyperinsulinemia, TSC22D4 fails to interact with Akt1 strongly and promotes insulin resistance and impairs glucose handling. Hence, TSC22D4 knockdown in mouse models of type 2 diabetes successfully improves insulin sensitivity and hyperglycemia (7). D2 + TSC allele, on the other hand, can still interact with Akt effectively, and unlike WT TSC22D4, it does not exacerbate metabolic parameters.

Чтобы понять точную функцию взаимодействия TSC22D4-Akt1, нам пришлось избыточно экспрессировать мутанты TSC22D4 для проведения функциональных анализов в первичных гепатоцитах и в печени мыши. Уровни белка избыточно экспрессированного TSC22D4 действительно превышали эндогенные уровни (рис. 4E и 5I). Тем не менее, уровни эктопически экспрессированных аллелей WT-TSC22D4 и D2 + TSC всегда оставались одинаковыми во всех экспериментальных условиях (рис. S4D и S6, A и E), что делает наши интерпретации обоснованными.

Еще один интригующий аспект нашего исследования возник при использовании ингибитора Akti 1/2 в экспериментах с первичными гепатоцитами. Во всех различных популяциях клеток инсулин был способен подавлять выработку глюкозы, за исключением D2 + TSC-экспрессирующих клеток, которые уже секретировали гораздо меньше глюкозы. Только в контрольных клетках TSC22D4^flox/flox, но не в клетках нокаута, Akti 1/2 был способен отменить инсулин-опосредованное подавление глюконеогенеза (рис. 4C). Эти данные указывают на то, что в гепатоцитах TSC22D4-KO, вероятно, развились альтернативные механизмы, при которых инсулин подавляет глюконеогенез независимо от функции Akt. Это явление также наблюдалось ранее другими коллегами, когда инсулин по-прежнему подавлял глюконеогенез в отсутствие Akt и Foxo1 у мышей (26).

Более того, первичные гепатоциты TSC22D4-KO экспрессировали глюконеогенные гены PGC1α, G6P и PCK1 на гораздо более низких уровнях по сравнению с контрольными клетками TSC22D4^flox/flox, что подтверждает результаты нашего предыдущего исследования (7). Тем не менее, клетки TSC22D4-KO не генерировали меньше глюкозы по сравнению с контрольными клетками TSC22D4^flox/flox в тесте на глюконеогенез (рис. 4C). Это может быть связано с присутствием дополнительного глюкагона в среде анализа, который инициирует дополнительные сигнальные события, способствующие глюконеогенезу.

Примечательно, что в нашей предыдущей работе мы показали, что аденовирусная избыточная экспрессия TSC22D4 у мышей WT на диете "чау-чау" снижает фосфорилирование печеночного Akt как в условиях голодания, так и в условиях питания (7). В настоящем исследовании, однако, AAV-опосредованная избыточная экспрессия WT-TSC22D4 у мышей TSC22D4^hep-/-, находящихся на HF/HS, не только не снижала фосфорилирование Akt, но, скорее, повышала уровень p-Akt во время голодания. Одно из объяснений этого парадоксального наблюдения может быть связано со избыточной экспрессией TSC22D4 у разных штаммов мышей, находящихся на разных диетах: WT против TSC22D4^hep-/- мышей на диете чау и HF/HS, соответственно. Гипергликемическая/гиперинсулинемическая среда, вызванная диетой HF/HS, могла также препятствовать достаточно сильному взаимодействию между WT-TSC22D4 и Akt1 для подавления фосфорилирования Akt1. Метод, который мы использовали для введения аллелей TSC22D4, также может объяснить расхождение в этих экспериментах на мышах; в предыдущем исследовании мы использовали аденовирусы (AVs) для специфической избыточной экспрессии TSC22D4 в печени. В настоящем исследовании, однако, мы использовали AAVs для избыточной экспрессии аллелей TSC22D4 именно в гепатоцитах внутри печени. Аналогично, мы также наблюдали увеличение уровня p-Akt в первичных гепатоцитах TSC22D4-KO, экспрессирующих Flag-WT-TSC22D4 (рис. 4A), которые смогли пережить только однодневное голодание в присутствии среды с низким содержанием глюкозы и фетальной бычьей сыворотки (FBS). Мы подозреваем, что присутствие глюкозы и FBS даже на минимальных уровнях предотвращает сильное взаимодействие WT-TSC22D4-Akt и не вызывает снижения уровня фосфорилирования (p)-Akt. TSC22D4 также может иметь двойные функции для контроля фосфорилирования Akt, такие как взаимодействие mTOR-Raptor в рамках mTORC1. Как и в случае взаимодействия TSC22D4-Akt, взаимодействие mTOR-Raptor также ослабевает в ответ на питательные вещества (30). Хотя очень сильное взаимодействие mTOR-Raptor нарушает функцию mTORC1, mTOR по-прежнему нуждается в Raptor для фосфорилирования своих нижележащих мишеней (30). Следовательно, повторное введение TSC22D4 в первичные гепатоциты или печень TSC22D4-KO может также способствовать фосфорилированию Akt аналогичным образом. Кроме того, хроническая потеря TSC22D4 в гепатоцитах могла привести к развитию компенсаторных механизмов, которые могут вызвать дополнительные расхождения. Тем не менее, в обоих исследованиях печеночная сверхэкспрессия WT-TSC22D4 ухудшала метаболизм глюкозы и усугубляла инсулинорезистентность (рис. 5 и рис. S6) (7).

В отличие от изменений в инсулинорезистентности и метаболизме глюкозы, мы не наблюдали каких-либо серьезных различий в накоплении липидов в печени в наших экспериментах на мышах. Наши функциональные анализы in vivo зависят от эктопической экспрессии аллелей TSC22D4 в печени. AAV-опосредованная экспрессия генов имеет тенденцию к снижению в течение 12-14 недель после инъекции, что ограничивает продолжительность режима питания HF/HS относительно коротким периодом времени по сравнению с другими исследованиями HF/HS в данной области. Следовательно, 12 недель диеты HF/HS могут быть слишком короткими, чтобы увидеть достоверную разницу в накоплении липидов в печени.

Akt2 - это другая форма Akt, повсеместно экспрессируемая в печени. В наших экспериментах по ко-IP мы не наблюдали специфического взаимодействия между TSC22D4 и Akt2. Предыдущие исследования показывают, что Akt2 регулирует метаболизм глюкозы, а Akt1 - выживаемость и пролиферацию клеток (31-33). Эти выводы, однако, основаны в основном на экспериментах с нокаутом всего тела, что может ввести в заблуждение в плане определения органоспецифических функций изоформ Akt. Кроме того, данные лаборатории Бирнбаума опровергают эту концепцию, показывая, что удаление печеночного Akt1 также приводит к инсулинорезистентности и гипергликемии, что подтверждает физиологическую значимость наших результатов (26).

Один из открытых вопросов, остающихся в нашем исследовании, заключается в следующем: Как именно TSC22D4 нарушает фосфорилирование Akt? Одна из возможных гипотез заключается в том, что TSC22D4 непосредственно связывается с Akt, предотвращая доступ к нему mTORC2 или PDK1. Однако мы не смогли обнаружить прямого взаимодействия TSC22D4-Akt1 в наших анализах in vitro. (рис. S4A). TSC22D4 содержит длинный участок внутренне неупорядоченной области с множеством сайтов PTM (9), что может позволить ему также взаимодействовать с другими регуляторами Akt, такими как PDK1 и mTORC2 или PP2A для контроля фосфорилирования Akt.

В целом, наше исследование способствует лучшему пониманию молекулярных механизмов, определяющих патогенез инсулинорезистентности, что имеет ключевое значение для разработки новых методов лечения диабета 2 типа и его долгосрочных осложнений. В будущем может быть интересно выяснить, вносит ли взаимодействие TSC22D4-Akt1 вклад в патогенез других заболеваний, таких как рак, в котором центральную роль играет нврушение функции Akt1.