Для нашего исследования был привлечен 28-летний мужчина из кровнородственной семьи, у которого в течение 7 лет наблюдалось первичное бесплодие. Кариотип соматических клеток (46, XY), двусторонний размер яичек, вторичные половые признаки и уровень гормонов были в норме. Анализ спермы этого пациента выявил крайне низкое количество и подвижность сперматозоидов, а также аномальную морфологию сперматозоидов (таблица S1). Помимо пробанда, заболевание было выявлено еще у двух мужчин в этой семье - его брата (IV-8) и двоюродного дяди (II-5), которые не зачали ребенка ни в браке, ни при незащищенном половом контакте. Примечательно, что пациент указал, что он также страдает от дефектов слуха и зрения, а его двоюродный дядя (II-5) и двоюродная тетя (II-4, умерла) испытывали подобные проблемы. Далее мы провели проверку зрения и слуха пробанда, а color fundus photography (CFP) выявила некоторые мозаичные изменения на дне глаз, указывающие на истончение сетчатки (рис. 1А). С помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) мы также обнаружили, что наружный ядерный слой (ONL) истончился, а слой между внутренним сегментом/наружным сегментом (IS/OS) помутнел (рис. 1B). Отоскопическое обследование показало, что барабанные перепонки в обоих ушах пациента были неповрежденными (рис. 1С), результаты теста на акустическую immittance также были в норме (рис. 1D). Однако акустическое отражение не было обнаружено в двусторонних ушах (рис. 1E), что указывает на возможное наличие препятствий на пути слуховой проводимости. Кроме того, бинауральный тест на порог чистого тонального слуха пациента показал, что порог от 1,5 до 8 кГц составлял от 40 до 80 децибел (dB HL) (нормальный диапазон ~20 dB HL) (рис. 1F), что указывает на наличие у пациента двусторонней нейро-сенсорной тугоухости, связанной с умеренными или тяжелыми дефектами порога слуха на средних и высоких частотах.



Fig. 1. A pathogenic splicing mutation in CEP78 identified in an infertile family.

(A) Color fundus photograph of the proband. The retina was generally normal except for tessellated fundus changes. (B) Optical coherence tomography results from the proband. The outer nuclear layer (ONL) appeared to be thinning, with the cone-rich macular fovea relatively preserved. The inner segment (IS)/outer segment (OS) layer was blurred. The extent of retinal changes between both eyes was similar. (C) Images of two-sided tympanic membranes observed in an otoscopic examination of the proband. (D) The acoustic immittance test results of the proband were shown on the right in an As-type picture and on the left as an A-type picture. (E) The acoustic reflection of the proband was not detected in the two ears. (F) Binaural pure-tone hearing threshold test results of the proband. (G) Pedigrees and sequence chromatograms of the identified mutation. The homozygotes are indicated by red arrows, and the heterozygotes are indicated by black arrows. (H) RT-PCR analysis was performed on cDNA samples from the proband (lane 2) and a normal control (lane 3). Lane 1 represents a DNA ladder. Lane 4 includes a blank control. Sanger sequencing showed aberrant integration of 121-bp bases of intron 8 and a 3-base deletion of exon 9 in the amplified cDNA fragment of the proband. Three independent experiments were performed. (I) Western blotting results showed that the mutant-CEP78 plasmids did not result in CEP78 expression. Three independent experiments were performed. GAPDH, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. ...

Хотя предыдущие исследования показывают, что мутации с потерей функции CEP78 вызывают синдром CRDHL у людей, роль CEP78 в зрении и слухе у мышей, а также в мужском бесплодии у людей и мышей, документально не подтверждена. В настоящем исследовании мы выявили неизвестную мутацию сплайсинга CEP78 у пациентов с олигоастенотератозооспермией и, создав мышей с нокаутом Cep78, продемонстрировали, что мутации потери функции в CEP78/Cep78 непосредственно способствуют мужскому бесплодию. Мы также предположили, что CEP78 может играть роль в сперматогенезе, способствуя USP16-опосредованной модуляции экспрессии тектина через убиквитиновую сигнализацию. Более того, мы обнаружили, что дефицит Cep78 приводит к аномальному зрению и слуху у мышей. Таким образом, наша работа определяет функцию CEP78 в генетике человека и мыши и раскрывает потенциальный механизм, регулирующий сперматогенез.

На сегодняшний день несколько инактивирующих вариантов, вариант миссенса и два сложных структурных варианта CEP78 были выявлены у людей с аутосомно-рецессивным синдромом CRDHL, редким синдромом наследственного заболевания сетчатки, сопровождающегося нейросенсорной тугоухостью (19-22). Кроме того, две сплайс-мутации в CEP78 были выявлены в двух независимых семьях с легкой степенью синдрома Ашера - генетического заболевания, характеризующегося сочетанием пигментного ретинита и нейросенсорной тугоухости (50). В одном из этих сообщений было высказано предположение, что мутации CEP78 могут также коррелировать с мужским бесплодием (21). Необъяснимо, но в том исследовании два пациента с синдромом CRDHL несли одну и ту же мутацию CEP78 (c.449T>C, p.Leu150Ser, NM_001098802.1), при этом один из них (F1, III-2) был бесплоден, а другой имел потомство (F2, II-2); в третьей семье пробанд (II:1) также демонстрировал мужское бесплодие, в то время как фертильность его брата или сестры, несущих ту же мутацию CEP78, не была документирована. Поэтому необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, связаны ли мутации CEP78 с мужским бесплодием. В нашем исследовании мы выявили большую семью с мутацией CEP78 и мужским бесплодием. Примечательно, что у двух бесплодных братьев и сестер наблюдалось снижение количества и подвижности сперматозоидов, аберрантная морфология сперматозоидов и нарушения в ультраструктуре сперматозоидов. Более того, у мышей-самцов с нокаутом Cep78 наблюдался фенотип олигоастенотератоспермии и бесплодие. Таким образом, наши результаты подтверждают решающую роль CEP78 в мужском бесплодии. Почему предыдущие исследования не указывали на связь между вариантами CEP78 и мужским бесплодием? Изначально мы предположили, что эти мутации могут быть вовлечены в генерацию различных транскриптов. Однако, когда мы проанализировали позиции известных мутаций, мы заметили, что все зарегистрированные мутации были расположены в каждом транскрипте CEP78. Возможность того, что эти мутации могут нарушать различные консервативные домены CEP78, также была исключена. Таким образом, мы предположили, что все пациенты были набраны для этих исследований из-за серьезных нарушений зрения и слуха, а элемент мужского бесплодия мог быть легко проигнорирован. Наконец, в 14 семьях с синдромом CRDHL родословные показали, что только три семьи с пациентами мужского пола имели потомство, чему, возможно, способствовали вспомогательные репродуктивные технологии. Этот вывод может разумно объяснить, почему пациенты имели одну и ту же мутацию, но один был бесплоден, а другой имел потомство. В целом, в настоящем исследовании мы выяснили, что мутации потери функции CEP78 могут вызывать синдром CRDHL, сопровождающийся мужским бесплодием, который мы назвали синдромом CRDHLMI, а также выявили причинный ген мужского бесплодия у людей и мышей.

CEP78 локализуется на родительских центриолях (17), которые определяют положение жгутиков и ресничек и становятся базальным телом этих органелл (51). В настоящее время продолжаются работы по поиску механизма, лежащего в основе участия CEP78 в цилиогенезе. CEP78 взаимодействует с поло-подобной киназой 4 (Plk4) на центриолях и необходим для индуцированной Plk4 избыточной дупликации центриолей (17). CEP78 специфически связывается с EDD-DYRK2-DDB1VprBP, препятствуя переносу убиквитина от фосфоглюконатдегидратазы (EDD) к CP110, что имеет ключевое значение для длины центриолей и сборки ресничек (47). Недавно в другом исследовании было предложено, что CEP78 взаимодействует с CEP350 для продвижения цилиогенеза путем негативного регулирования уровня CP110 через EDD1-зависимый механизм (52). Однако сигнальный путь CEP78, участвующий в сперматогенезе, полностью неизвестен. В настоящем исследовании мы провели протеомный анализ семенников мышей-самцов WT и нокаутных мышей CEP78, чтобы понять молекулярный механизм участия CEP78 в процессе сперматогенеза. Наше внимание привлекло резкое снижение экспрессии членов семейства TEKT, поскольку семейство TEKT играет важную роль в сперматогенезе (40-46). Механистически мы предположили, что CEP78 регулирует экспрессию TEKT1, TEKT2, TEKT3, TEKT4 и TEKT5 путем положительной регуляции уровней USP16 через зависимый от убиквитинирования путь. Кроме того, CEP78 регулирует экспрессию H1-7 (дефицит которого вызывает дефекты формирования ядер сперматозоидов), взаимодействуя с CETN1 для модуляции развития головки сперматозоида. Наши результаты проясняют потенциальные механизмы, посредством которых CEP78 регулирует формирование сперматозоидов, и дают дополнительные сведения для будущих исследований функций CEP78 в сперматогенезе.

В сообщениях о людях с мутациями CEP78 в сетчатке глаза наблюдалась конусно-родовая дистрофия, вызванная дегенерацией фоторецепторов колбочек скорее, чем фоторецепторов палочек. У мышей с нокаутом по Cep78 функциональные изменения впервые были зарегистрированы в ответах ЭРГ, адаптированных к свету, а не к темноте, что указывает на то, что колбочки были скомпрометированы раньше, чем палочки у мышей. Хотя на снимках глазного дна пациентов с мутацией CEP78 были видны крупные сосудистые аркады вокруг макулы, внешний вид изображений глазного дна мышей с нокаутом Cep78 был схож с таковым при пигментном ретините. Эти различия могут быть связаны с тем, что в сетчатке мышей доминируют палочки. Характеристика потери слуха, вызванной мутациями CEP78, в основном одинакова как у людей, так и у мышей с нокаутом Cep78, и это не врожденная глухота, а замедленная потеря слуха. Нарушения в поддержании и обеспечении функции волосковых клеток, но не повреждения на стадии развития волосковых клеток, опосредуют этот тип потери слуха. Однако, с точки зрения степени, потеря слуха у модельных мышей была не такой тяжелой, как у людей. У большинства пациентов высокочастотная потеря слуха в молодости была тяжелой, тогда как у модельных мышей высокочастотная потеря слуха была умеренной. Поэтому исследование слуха и зрения у мышей с нокаутом Cep78 требует дальнейшего изучения.

В заключение следует отметить, что наша работа выявила неизученную роль CEP78 в заболеваниях человека, сообщив о том, что CEP78 является причинным геном мужского бесплодия. В качестве оригинального открытия, наше исследование позволило выяснить подробный молекулярный механизм, посредством которого CEP78 регулирует процесс сперматогенеза. Особое беспокойство вызывает плохой прогноз у пациентов и мышей с мутациями CEP78 после лечения ICSI, что указывает на то, что идентификация причинных генов, связанных с функцией центросомы, может дать ключ к оценке результатов лечения ICSIу пациентов с бесплодием.