Цитотоксические Т-клетки экспрессируют различные рецепторы, включая PD-1 (белок 1 программируемой клеточной смерти), LAG3 (белок 3 гена активации лимфоцитов) и TIM3 (белок 3, содержащий домен муцина и иммуноглобулин Т-клеток)^6-8, которые подавляют функцию Т-клеток после активации их соответствующими лигандами. Эти рецепторы контрольных точек обеспечивают сдерживание иммунного ответа на повреждение или инфекцию, предотвращая тем самым слишком интенсивные реакции, которые могут повредить здоровые клетки⁹. Опухолевые клетки экспрессируют лиганды для этих иммунных контрольных точек, которые при активации блокируют цитолитические функции Т-клеток, тем самым способствуя выживанию раковых клеток^9,10.

При раке простаты нейрональные предшественники, экспрессирующие двойной кортин, инициируют вегетативный адренергический нейрогенез³, что способствует развитию и распространению опухоли². В опухолях головы и шеи потеря TP53 приводит к перепрограммированию иннервирующих опухоль сенсорных нервов в адренергические нейроны, которые способствуют росту опухоли¹. Наличие такой неоиннервации при раке, а также разнообразные действия нейропептидов на иммунные клетки^11-18, заставили нас исследовать, может ли местное высвобождение нейропептидов из активированных ноцицепторов (болевых рецепторов) способствовать росту рака путем подавления иммунного контроля.

Хотя экспрессия генов нейронного происхождения не обнаруживается с помощью РНК-секвенирования в злокачественных клетках человека или иммунных клетках (расширенные данные рис. 1a-c), мы наблюдали значительное увеличение их экспрессии в биоптатах пациентов с меланомой^19-22 (расширенные данные рис. 1d). Поскольку эти клинические данные предполагали повышенную иннервацию меланомы, мы проверили наличие ноцицепторных нейронов, оценив TRPV1+ нейроны в биоптатах пациентов с меланомой. Иммунолабильность TRPV1 была увеличена примерно в два раза в опухоли по сравнению с прилегающими здоровыми тканями в каждой из десяти исследованных биопсий. Количество опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (TILs) коррелировало (R2 = 0,63) с увеличением иммуномечения TRPV1 (расширенные данные рис. 2). Эти данные показывают, что меланомы иннервируются сенсорными нейронами и что эти нейроны могут влиять на внутриопухолевое количество иммунных клеток.

Чтобы исследовать это более подробно, мы привили мышам Nav1.8cre::tdTomato^fl/WT (Nav1.8 также известен как Scn10a) клеточную линию меланомы (B16F10-eGFP), экспрессирующую GFP. Через 22 дня после имплантации мы обнаружили большое количество NaV1.8+ ноцицепторных нейронов вокруг и внутри опухоли (рис. 1a). Секвенирование РНК образцов от мышей, несущих B16F10, показало, что злокачественные и инфильтрирующие меланому иммунные клетки не имели обнаружимых уровней маркеров нейронов (Nav1.8 или Trpv1), что указывает на то, что сигнал NaV1.8 может быть приписан инфильтрирующим опухоль нервам (расширенные данные рис. 3). Далее мы использовали метод совместного культивирования in vitro, чтобы оценить, модулируют ли злокачественные клетки функцию ноцицепторных нейронов. При совместном культивировании TRPV1+ ноцицепторы непосредственно протягивали нейриты в сторону клеток меланомы B16F10-eGFP, средняя длина нейритов увеличивалась, тогда как общая арборизация или ветвление нейронов уменьшались (расширенные данные рис. 4a-c). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что рост ноцицепторов усиливается вблизи клеток меланомы и что коллатерали сенсорных нейронов кожи прорастают непосредственно в ложе опухоли. Такая неоиннервация опухоли может быть сродни неоангиогенезу рака.



Fig. 1: Melanoma cells sensitize nociceptors.

a, Nociceptor (Nav1.8cre::tdTomato^fl/WT; magenta) reporter mice were inoculated in the hindpaw with B16F10-eGFP cancer cells (i.d., 2 x 10⁵ cells; green). Representative image of NaV1.8+ nerve fibres (magenta) innervating B16F10-eGFP-inoculated mouse skin after 22 days. Scale bar, 200 µm. b, In co-culture, B16F0 or B16F10 cells sensitize the response of nociceptors to capsaicin (100 nM), allyl isothiocyanate (AITC, 100 µM) and ATP (1 µM), as measured by calcium flux. A low concentration of the ligands induces a minimal response in control neurons, whereas B16F10 cells show marginal sensitivity to ATP. c, Dorsal root ganglion (DRG) neurons co-cultured (96 h) with B16F10 cells release substance P (SP), vasoactive intestinal peptide (VIP) and CGRP. B16F10 cells alone do not release neuropeptides. Stimulation with KCl (40 mM; 30 min) induced a significant release of neuropeptides from cultured neurons. d,e, Naive DRG neurons (Trpv1cre::-CheRiff-eGFPfl/WT) were cultured alone or in combination with B16F10-mCherry-OVA cells. After 48 h, the cells were collected, FACS purified and RNA sequenced. Hierarchical clustering of DEGs from the sorted neurons shows distinct groups of transcripts enriched in cancer-exposed TRPV1+ neurons (d), including Calca (the gene encoding CGRP; e). Data are shown as a representative image (a), as box-and-whisker plots (running from minimal to maximal values; the box extends from 25th to 75th percentile and the middle line indicates the median), for which individual data points are given (b,c), as a heat map showing normalized gene expression (log2(0.01 + transcripts per million reads (TPM)) x mean (d) or as a scatter dot plot with medians (e). Experiments were independently repeated two (a) or three (b,c) times with similar results. The sequencing experiment was not repeated (d,e). n as follows: a: n = 4; b: neurons (29 neurons from 10 mice), B16F10 (16 cells from 10 dishes), neurons + B16F0 (387 neurons from 12 mice), neurons + B16F10 (409 neurons from 12 mice); c: neurons (n = 12), neurons + B16F10 (n = 12), neurons + KCl (n = 12), B16F10 (n = 3); d,e: n = 4 per group. P values were determined by one-way ANOVA with post-hoc Bonferroni (b,c) or two-sided unpaired Student's t-test (e).

Учитывая, что меланома способствует аксоногенезу, что приводит к иннервации опухоли (рис. 1а и расширенные данные рис. 2), мы изучили, позволяет ли эта физическая близость меланомы модулировать чувствительность ноцицептора. Поскольку ноцицепторные нейроны обнаруживают сигналы из местной среды, мы измерили изменения потока кальция в ответ на подпороговые концентрации различных раздражающих лигандов. Когда ноцицепторы культивировали без клеток меланомы, лишь немногие из них реагировали на лиганды в выбранных концентрациях. Однако количество реагирующих нейронов увеличивалось, когда их совместно культивировали с клетками B16F10 (рис. 1б). Аналогично, амплитуда кальциевого потока в ответ на лиганды была выше в нейронах поясничных DRG (L3-L5), собранных ипсилатерально после 14-дневной инокуляции опухоли мышам, по сравнению с нейронами, собранными от мышей, которым вводили неопухолевые кератиноциты (расширенные данные, рис. 4d). Таким образом, сигналы, высвобождаемые меланомой, повышают чувствительность ноцицепторов.

Далее мы проверили, приведет ли эта гиперчувствительность нейронов к повышенному выделению иммуномодулирующих нейропептидов. В отличие от клеток B16F10, нейроны DRG, совместно культивированные с клетками B16F10 (5 x 10⁴ клеток, 96 ч), активно выделяют CGRP в среду (рис. 1c). Эти данные побудили нас проверить, изменяет ли воздействие меланомы транскриптомы ноцицепторных нейронов. Для этого мы культивировали наивные нейроны DRG (Trpv1cre::-CheRiff-eGFP^fl/WT) отдельно или в сочетании с клетками B16F10-mCherry-OVA. Через 48 часов TRPV1+ ноцицепторы были очищены с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) и секвенированы РНК. Были рассчитаны дифференциально экспрессированные гены (DEGs), и было обнаружено, что Calca - ген, кодирующий CGRP, и NGF-рецептор Trka (также известный как Ntrk1) избыточно экспрессируются в ноцицепторах, подвергшихся воздействию рака (рис. 1d-e и расширенные данные рис. 4e). Избыточная экспрессия Trka может способствовать развитию вызванной меланомой гиперчувствительности к боли, в то время как CGRP, высвобождаясь из активированных ноцицепторов, может иммуномодулировать TILs.

Чтобы определить механизм, посредством которого меланома сенсибилизирует нейроны ноцицепторов, мы использовали систему ко-культуры, разработанную для имитации взаимодействий, происходящих в микроокружении меланомы. Стимулированные (ex-vivo активированные CD3 и CD28, IL-12 и анти-IL-4 в течение 48 ч) OVA-специфическими цитотоксическими CD8+ Т-клетками (мыши OT-I), наивные нейроны DRG (Trpv1^cre::CheRiff-eGFP^fl/WT) и раковые клетки меланомы B16F10-mCherry-OVA культивировали отдельно или в комбинации. Через 48 часов клетки собирали, очищали методом FACS, секвенировали РНК и рассчитывали DEGs. Среди прочего, мы обнаружили, что Slpi (ингибитор протеазы секреторных лейкоцитов) избыточно экспрессировался в клетках рака меланомы при совместном культивировании с нейронами DRG (примерно в 3,6 раза) или OVA-специфическими цитотоксическими CD8+ Т-клетками (примерно в 270 раз), а также при воздействии обеих популяций (примерно в 150 раз) (рис. 2a,b и расширенные данные рис. 5a-e). Мы также обнаружили, что клетки B16F10-mCherry-OVA при совместном культивировании с нативными нейронами DRG и OVA-специфическими цитотоксическими CD8+ Т-клетками увеличивали секрецию SLPI в культуральную среду, причем этот эффект был максимальным через 48 часов (примерно в 200 раз; рис. 2c).

Fig. 2: Cancer-secreted SLPI drives the release of CGRP by nociceptor neurons...

Помимо защиты эпителиальных клеток от активности сериновых протеаз, SLPI усиливает регенерацию перерезанных аксонов ганглиозных клеток сетчатки²³ и пролиферацию нейрональных стволовых клеток²⁴. Хотя эти данные свидетельствуют о влиянии SLPI на нейроны, его роль в ноцицепции остается неясной. Чтобы решить эту проблему, мы измерили, активирует ли SLPI непосредственно культивированные нейроны DRG с помощью кальциевой микроскопии. Мы обнаружили, что SLPI (0,01-10 нг мл^-1) активирует около 20% нейронов DRG и что, в соответствии с тем, что эти нейроны являются ноцицепторами, чувствительные к SLPI нейроны были в основном маленькими (со средней площадью 151 мкм²) нейронами, реагирующими на капсаицин (около 90%) (рис. 2d, e и расширенные данные рис. 5f-i). Учитывая, что SLPI вызывает приток кальция, мы исследовали, является ли это средством, с помощью которого клетки B16F10 стимулируют высвобождение CGRP из нейронов (рис. 1c). SLPI в концентрации, аналогичной той, которую выделяют клетки меланомы (рис. 2c), вызывал высвобождение CGRP из культивируемых наивных нейронов DRG (рис. 2f). Наконец, мы попытались проверить, может ли SLPI вызывать болевую гиперчувствительность in vivo. При введении в правую заднюю лапу нативных мышей SLPI вызывал транзиторную тепловую гиперчувствительность (расширенные данные рис. 5j).

Секретируемый меланомой SLPI действует на ноцицепторы, вызывая приток кальция, высвобождение нейропептидов и тепловую гиперчувствительность, что указывает на то, что эти сенсорные нейроны обнаруживают и реагируют на присутствие раковых клеток. Дает ли это злокачественным клеткам функциональное преимущество перед клетками хозяина, остается неизвестным. Чтобы оценить это, мы имплантировали клетки B16F10-mCherry-OVA (внутрикожно (i.d.), 2 x 10⁵ клеток) в заднюю лапу восьминедельных самцов и самок мышей. Мы обнаружили, что мыши с более крупными опухолями имели более высокую долю внутриопухолевых PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ Т-клеток и более повышенную чувствительность к тепловой боли (не показано). Примечательно, что повышенная чувствительность к тепловой боли положительно коррелировала (n = 60; R2 = 0.55, P < 0.0001) с повышенной частотой внутриопухолевых PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T-клеток (рис. 3a; измерено на 13-й день после имплантации).

Fig. 3: Genetic ablation of nociceptors safeguards anti-tumour immunity.

Экспрессия маркеров адренергических и холинергических аксонов в опухолях коррелирует с плохим клиническим исходом². Денервация опухоли желудка ограничивает рост, а у пациентов, перенесших ваготомию, ниже уровень смертности от рака кишечника^16,25,26. Чтобы изучить характер трехстороннего взаимодействия между раком, ноцицепторами и CD8+ Т-клетками, мы использовали сингенную мышиную модель тройной негативной меланомы, которая является признанной моделью иммунонадзора⁹. Клетки B16F10-mCherry-OVA были инокулированы (i.d., 5 x 10⁵ клеток) восьминедельным самцам и самкам мышей-ноцицепторов (Trpv1^cre::DTA^fl/WT) или интактным (контроль помета; Trpv1WT::DTA^fl/WT). У мышей-самцов и самок, лишенных ноцицепторов, средняя продолжительность выживания увеличилась в 2,5 раза (оценивалась до 22-го дня; рис. 3б). В другой группе мышей, которых анализировали через 16 дней после инокуляции опухоли, мы обнаружили, что генетическая абляция ноцицепторов уменьшила рост опухоли (рис. 3c). Кроме того, у мышей, лишенных ноцицепторов, наблюдалось увеличение общего числа и относительной частоты цитотоксических (IFNγ+, TNF+ или IL-2+) опухоль-инфильтрирующих CD8+ Т-клеток, но уменьшение доли PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ Т-клеток (рис. 3d,e и расширенные данные рис. 6a,b).

До сих пор наши данные позволяли предположить, что ноцицепторные нейроны являются предшествующим драйвером внутриопухолевых PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ Т-клеток. Чтобы оценить, действительно ли это так, мы составили карту кинетики гиперчувствительности к тепловой боли, увеличения частоты внутриопухолевых PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ T-клеток и роста опухоли. По сравнению с исходным порогом и порогом мышей, лишенных сенсорных нейронов (Trpv1^cre::DTA^fl/WT; n = 19), восьминедельные контрольные мыши (Trpv1^WT::DTAf^l/WT; n = 96), которым прививали B16F10-mCherry-OVA (левая задняя лапа, и.д., 2 х 10⁵ клеток) продемонстрировали значительную тепловую гиперчувствительность на 7-й день, которая достигла пика на 21-й день (расширенные данные рис. 6c). У этих мышей внутриопухолевая частота PD-1+LAG3+TIM3+ (расширенные данные рис. 6d) или IFNγ+ (расширенные данные рис. 6e) CD8+ Т-клеток была значительно увеличена через 12 дней после инокуляции опухоли и достигла максимума на 19 день. Наконец, объем опухоли B16F10-mCherry-OVA достиг максимума на 22-й день (расширенные данные рис. 6f). В целом, эти данные показывают, что тепловая гиперчувствительность предшествует значительному истощению внутриопухолевых CD8+ Т-клеток примерно на пять дней и что болевая гиперчувствительность развивается до того, как опухоль можно измерить с помощью цифрового штангенциркуля (расширенные данные, рис. 6g).

Блокирование активности белков иммунных чекпойнтов (КПП) снимает "тормоз" иммунной системы, вызванный раковыми клетками, тем самым повышая ее способность уничтожать опухоли^6,8-10. Immune checkpoint inhibitors (ICIs), включая те, которые нацелены на PD-L1, улучшают клинические исходы у пациентов с метастатической меланомой⁸; однако эффективность ICIs значительно варьирует среди пациентов, половина из которых не получает пользы²⁷. Мы задались целью оценить, повлияет ли наличие (Trpv1^WT::DTA^fl/WT) или отсутствие (Trpv1^cre::DTA^fl/WT) иннервирующих опухоль ноцицепторных нейронов на ответ на лечение анти-PD-L1. Анти-PD-L1 (внутрибрюшинно (i.p.), дни 7, 10, 13 и 16) вводили либо мышам, опухолевые клетки которых (B16F10-mCherry-OVA, i.d., 5 ч 10⁵ клеток) были инокулированы в тот же день, либо мышам с установленными опухолями (около 85 мм³; достигнуто путем инокуляции Trpv1^cre::DTA^fl/WT примерно за 3 дня до этого). В обоих сценариях абляция ноцицепторов усиливала анти-PD-L1-опосредованное сокращение опухолей и инфильтрацию опухолеспецифических CD8+ Т-клеток (расширенные данные рис. 6h-k).

Чтобы проверить, зависит ли снижение роста опухоли, наблюдаемое в отсутствие нейронов ноцицепторов, от их действия на иммунные клетки, мы сравнили соответствующие эффекты ноцицепторов на рост иммуногенной и не-иммуногенной изогенной модели меланомы. YUMMER1.7 является высоко-иммуногенной производной клеточной линии BrafV600ECdkn2a-/-Pten-/-, модифицированной ультрафиолетовым облучением, и представляет собой клинически значимую модель меланомы²⁸. Как и в случае с B16F10-OVA, абляция ноцицепторов уменьшила рост опухолей (расширенные данные рис. 6l) и снизила их частоту вj внутриопухолевых PD-1+LAG3+TIM3+ CD8 T-клетках. при этом увеличив их количество и цитотоксический потенциал (IFNγ+ или TNF+; не показано). Напротив, YUMM1.7 (родительский и не-иммуногенный²⁹ аналог YUMMER1.7) показал сходный рост опухоли (расширенные данные рис. 6m) и сходную частоту внутриопухолевых PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ Т-клеток как в присутствии, так и в отсутствии ноцицепторов (не показано).

Далее мы проверили, связаны ли эти различия с тем, что нейроны ноцицепторов непосредственно модулируют внутри-опухолевые Т-клетки. Мы не наблюдали значительных изменений в опухолевом росте между мышами, интактными по ноцицепторам и с устраненными ноцицепторами, после системного истощения CD8+ (рис. 3f) или CD3+ (расширенные данные рис. 6n) Т-клеток. Хотя химиоаблация нейронов ноцицепторов смолифератоксином (RTX) уменьшила рост опухоли у B16F10-изолированных мышей дикого типа (расширенные данные рис. 6o), мы обнаружили, что наивные ОТ-I CD8+ Т-клетки усилили сокращение опухоли при трансплантации RTX-облученным Rag1-/- мышам (рис. 3g). При этом химиоаблация ноцицепторных нейронов защищала наивные OT-I CD8+ Т-клетки от истощения (рис. 3h). Эти данные предполагают, что замедление роста опухоли у мышей Trpv1^cre::DTA^fl/WT и RTX-облученных мышей зависит от модуляции CD8+ Т-клеток ноцицепторами.

Оптогенетическая активация нейронов ноцицепторов кожи вызывает антидромное высвобождение нейропептидов, которые опосредуют предвосхищающий иммунитет против микроорганизмов³⁰ и потенцируют кожный иммунитет³¹. Мы использовали трансдермальное освещение для стимуляции иннервирующих опухоль нейронов NaV1.8+ канала, экспрессирующего родопсин (Nav1.8^cre::ChR2^fl/WT). Ежедневная стимуляция синим светом усиливала рост B16F10 после начала облучения мышей, несущих видимые (около 20 мм³) или хорошо развитые (около 200 мм³) опухоли (расширенные данные рис. 6p). Это увеличение объема опухоли также было связано с повышением внутриопухолевого уровня CGRP, что подтверждает вовлечение нейронов, передающих боль (расширенные данные рис. 6q). Лазерное облучение не повлияло на рост опухоли у нечувствительных к свету мышей (Nav1.8^WT::ChR2^fl/WT; не показано).

Неонатальная или эмбриональная абляция подмножеств нейронов может привести к компенсаторным изменениям. Чтобы обойти эту возможность, мы глушили нейроны с помощью ботулинического нейротоксина А (BoNT/A), нейротоксического белка, производимого Clostridium botulinum, который действует путем расщепления SNAP25 (см. 32). BoNT/A вызывает длительную (20 дней) отмену высвобождения нейро-трансмиттеров из нейронов, иннервирующих кожу³³. BoNT/A уменьшает рост опухоли при раке простаты² и блокирует опосредованную ноцицепторами модуляцию нейтрофилов во время кожной инфекции³³. BoNT/A не влияет на функцию культивируемых B16F10 или CD8+ Т-клеток in vitro (расширенные данные рис. 7a-f). Когда BoNT/A (25 pg µл^-1, 50 µл, пять мест i.d.) вводили за один и три дня до инокуляции клеток B16F10-OVA, он уменьшал последующий рост опухоли и сохранял цитотоксический потенциал внутриопухолевых CD8+ Т-клеток (расширенные данные рис. 7g-n; по результатам измерения через 18 дней после инокуляции). Предварительная обработка BoNT/A также снижала рост опухолей YUMMER1.7 и усиливала анти-PD-L1-опосредованную регрессию опухоли (расширенные данные рис. 7o,p). При введении мышам с уже сформировавшимися опухолями (около 200 мм³) эффективность BoNT/A была ограниченной (расширенные данные рис. 7g-n). BoNT/A также не влиял на рост опухоли при введении мышам, у которых были генетически удалены ноцицепторные нейроны TRPV1+ (расширенный рис. 7o), что позволяет предположить, что его противоопухолевая эффективность зависит от наличия иннервирующих опухоль ноцицепторных нейронов.

Далее мы проверили противоопухолевую эффективность проверенной стратегии селективного подавления ноцицепторов³⁴. Этот протокол использует крупнопористые ионные каналы (TRPV1) в качестве клеточно-специфических портов входа лекарств для доставки QX-314 - заряженной и непроницаемой для мембраны формы лидокаина - для блокирования натриевых каналов, связанных с напряжением (NaV). Во время воспаления, аналогично тому, что мы наблюдали в опухолевой микросреде, эти крупнопористые ионные каналы открываются, что позволяет QX-314 проникать в нейроны и приводит к длительной электрической блокаде¹⁷. Хотя QX-314 не влиял на культивируемые клетки B16F10-mCherry-OVA и функцию CD8+ Т-клеток in vitro (расширенные данные рис. 8a-f), мы подтвердили, что он глушит иннервирующие опухоль ноцицепторы in vivo, о чем свидетельствует снижение индуцированного B16F10 высвобождения CGRP и болевой гиперчувствительности (расширенные данные рис. 8g-i). Мы обнаружили, что мыши, подвергнутые воздействию B16F10-mCherry-OVA, погибали в 2,7 раза чаще (P≤0,02), чем мыши, облученные QX-314 (расширенные данные рис. 8j; измерялось до 19-го дня). Как наблюдалось через 17 дней после инокуляции опухоли, QX-314-опосредованное глушение сенсорных нейронов (0,3%; ежедневно внутривенно, вокруг опухоли) уменьшило рост меланомы и ограничило истощение внутриопухолевых CD8+ Т-клеток (расширенные данные рис. 8k-n). Глушение ноцицепторов также увеличивало в опухоли количество CD8+ Т-клеток и сохраняло их цитотоксический потенциал (IFNγ+ или TNF+), а также их пролиферативную способность (IL-2+; расширенные данные рис. 8o-r). Аналогично тому, что наблюдалось у мышей, лишенных ноцицепторов (расширенные данные рис. 6j-j), глушение нейронов, иннервирующих опухоль, с помощью QX-314 усиливало регрессию опухоли под действием анти-PD-L1 (расширенные данные рис. 8s,t). При введении мышам с уже сформировавшейся (около 200 мм³) опухолью B16F10-mCherry-OVA, QX-314 по-прежнему снижал рост опухоли и сохранял противоопухолевую способность CD8+ Т-клеток (расширенные данные рис. 8k-r), что позволяет предположить возможность его использования в качестве терапевтического агента при раке.

При раке молочной железы специфическая симпатическая денервация опухоли снижает экспрессию PD-L1, PD-1 и FOXP3 в TILs¹⁵. Цитотоксические CD8+ Т-клетки человека и мыши экспрессируют множество рецепторов нейропептидов (10 или более), включая рецептор CGRP RAMP1 (расширенные данные рис. 1b и 3b). Учитывая, что ноцицепторы легко взаимодействуют с CD8+ Т-клетками в культуре и что выделяемые ими нейропептиды блокируют антибактериальный иммунитет^33,35-37, мы задались целью проверить, влияют ли эти медиаторы на экспрессию рецепторов иммунных КПП в CD8+ Т-клетках. Сначала изолированные от спленоцитов CD8+ Т-клетки культивировали в условиях стимуляции CD8+ Т-клеток типа 1 (Tc1) в течение двух дней, а затем еще четыре дня совместно с нейронами DRG. Мы обнаружили, что стимуляция ноцицепторов капсаицином увеличила долю PD-1+LAG3+TIM3+-экспрессирующих CD8+ Т-клеток, но снизила уровни IFNγ+, TNF+ и IL-2+. Капсаицин не оказывал заметного влияния на CD8+ Т-клетки в отсутствие нейронов DRG (расширенные данные рис. 9a,b). Когда T_c1-активированные CD8+ Т-клетки подвергались воздействию свежей кондиционированной среды (разведение 1:2), собранной из KCl (50 мМ) - стимулированных нейронов DRG, эта обработка увеличивала долю PD-1+LAG3+TIM3+ цитотоксических CD8+ Т-клеток и уменьшала долю IFNγ+ клеток (расширенные данные рис. 9c,d; измерено после четырех дней совместной культуры). Эти эффекты были предотвращены, когда цитотоксические CD8+ Т-клетки были подвергнуты действию (разведение 1:2) свежей KCl-индуцированной кондиционированной среды от нейронов, ослабленных BoNT/A (50 pg на 200 µл) или когда они были подвергнуты совместному воздействию блокатора RAMP1 CGRP8-37 (2 mg мл^-1; расширенные данные рис. 9c,d). Чтобы подтвердить, что высвобождаемые ноцицепторами нейропептиды вызывают истощение Т-клеток, мы подвергли Т_с1-активированные CD8+ Т-клетки воздействию CGRP. Обработанные CGRP клетки, экспрессирующие RAMP1 дикого типа, показали повышенное истощение и ограниченный цитотоксический потенциал. Эти эффекты отсутствовали в CD8+ Т-клетках, подвергнутых воздействию CGRP, которые были получены от мышей с нокаутом CGRP-рецептора (Ramp1-/-) (рис. 4a и расширенные данные рис. 9e,f).

Fig. 4: CGRP modulates the activation of CD8+ T cells.

Затем мы проверили, притупляют ли нейропептиды, выделяемые ноцицепторными нейронами, противоопухолевый ответ цитотоксических CD8+ Т-клеток через истощение. Цитотоксические Т-клетки OT-I вызывали устойчивый апоптоз культивируемых клеток B16F10-mCherry-OVA (AnnexinV+7AAD+ B16F10-mCherry-OVA; расширенные данные рис. 9g-i). Однако этот апоптоз клеток B16F10-mCherry-OVA уменьшался, когда Т-клетки подвергались воздействию капсаицина или KCl-стимулированной нейрон-производной среды, или когда клетки стимулировались CGRP (рис. 4b и расширенные данные рис. 9g-i). Цитотоксические Т-клетки OT-I не уничтожали культивируемые B16F10-mCherry-OVA при совместном воздействии среды, стимулированной KCl-нейронами, дополненной блокатором RAMP1 CGRP8-37 (2 µg мл^-1; расширенные данные рис. 9h). Если принять во внимание предыдущие доказательства того, что CGRP ограничивает активность CD8+ Т-клеток^12,38, то наши данные позволяют предположить, что через ось CGRP-RAMP1 ноцицепторы приводят к функциональному истощению CD8+ Т-клеток, что определяется одновременной потерей экспрессии цитотоксических молекул (то есть IFNγ и TNF) и пролиферативной способности (IL-2), повышенной ко-экспрессией нескольких маркеров истощения (PD-1+LAG3+TIM3+) и снижением способности уничтожать злокачественные клетки.

Нейропептиды, продуцируемые ноцицепторами, снижают иммунитет против бактерий³⁷ и грибов³⁹ и способствуют истощению цитотоксических CD8+ Т-клеток (рис. 4a,b и расширенные данные рис. 9). Учитывая, что высвобождаемый ноцицепторами CGRP увеличивается при культивировании клеток B16F10 (рис. 1c) или воздействии SLPI (рис. 2f), и что инфильтрирующие опухоль ноцицепторные нейроны избыточно экспрессируют Calca (рис. 1d,e), мы попытались проверить, коррелируют ли внутри-опухолевые уровни CGRP с истощением CD8+ Т-клеток. Для этого мы использовали драйвер Nav1.8cre для уничтожения большинства механо- и термочувствительных ноцицепторов дифтерийным токсином (Nav1.8^cre::DTA^fl/WT)^17,37. По сравнению с контрольной группой мышей, несущих меланому (Nav1.8^WT::DTA^fl/WT), абляция NaV1.8+ сенсорных нейронов сохраняла функциональность внутриопухолевых CD8+ Т-клеток (расширенные данные рис. 10a-d). В обеих группах мышей доля CGRP в опухоли прямо коррелировала с частотой PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ Т-клеток (расширенные данные рис. 10e).

Затем мы решили восстановить уровень CGRP (путем ежедневного внутри-опухолевого введения) у мышей, лишенных сенсорных нейронов, и измерили влияние на рост опухоли и истощение TIL. Через 11 дней после прививки мыши, лишенные сенсорных нейронов (Trpv1^cre::DTA^fl/WT), обработанные CGRP, демонстрировали рост опухоли и истощение CD8+ Т-клеток, аналогичные таковым у мышей, интактных по ноцицепторам (рис. 4c и расширенные данные рис. 10f). Далее мы лечили мышей с опухолями избирательным антагонистом RAMP1 BIBN4096 (5 mg кг^-1, внутривенно, один раз в два дня). Ранее было установлено, что этот препарат блокирует нейро-иммунные взаимодействия во время инфекций микроорганизмов и восстанавливает антибактериальную активность хозяина³⁵. Мыши, подвергшиеся воздействию BIBN4096, погибали в 2,6 раза реже (P≤0,02), чем мыши с B16F10, подвергшиеся воздействию транспортного средства (расширенные данные рис. 10g; измерено до 19-го дня). На 13-й день BIBN4096 (5мг кг^-1, внутривенно, каждые два дня) снижал рост B16F10, массу опухоли и частоту PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ Т-клеток (рис. 4d-e и расширенные данные рис. 10h-m). Поскольку BIBN4096 не показал никакого эффекта при введении мышам, лишенным ноцицепторов, и не повлиял на культивируемые клетки B16F10 или функцию CD8+ Т-клеток in vitro (расширенные данные рис. 10n-t), мы пришли к выводу, что противоопухолевое действие BIBN4096 зависит от наличия активных ноцицепторных нейронов.

Чтобы напрямую решить, является ли RAMP1 основным фактором истощения CD8+ Т-клеток, мы пересадили мышам Rag1-/- от мышей с Ramp1-/- или Ramp1 дикого типа (Ramp1WT) CD8+ Т-клетки (внутривенно (i.v.), 2,5 х 10⁶) или их смесь 1:1. Хотя мы получили одинаковое количество CD8+ Т-клеток во всех трех группах (расширенные данные рис. 10u), у мышей, получивших Ramp1-/- CD8+ Т-клетки, которые не реагируют на CGRP, был обнаружен ограниченный рост опухоли B16F10-OVA (рис. 5a). Относительная доля внутриопухолевых PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ Т-клеток также была ниже у Ramp1-/--трансплантированных от Rag1-/- мышей (расширенные данные рис. 10в). У мышей Rag1-/-, которым совместно трансплантировали RAMP1-экспрессирующие и - не-экспрессирующие CD8+ Т-клетки, мы обнаружили, что в пределах одной и той же опухоли относительная доля внутриопухолевых PD-1+LAG3+TIM3+ CD8+ Т-клеток была ниже в Ramp1-/- CD8+ Т-клетках (рис. 5b и расширенные данные рис. 10w). Далее мы провели РНК-секвенирование FACS-очищенных Ramp1WT и Ramp1-/- CD8+ Т-клеток из этих опухолей. По сравнению с Ramp1WT, мы обнаружили, что внутри-опухолевые Ramp1-/- CD8+ Т-клетки экспрессировали меньше способствующих истощению транскрипционных факторов (Tox и Eomes) и маркеров (Pdcd1 (кодирующий PD-1), Lag3 и Tim3 (также известный как Havcr2); рис. 5c). В целом, не реагирующие на CGRP Ramp1-/- CD8+ Т-клетки защищены от истощения, вызванного ноцицепторами, что гарантирует их противоопухолевый ответ.

Fig. 5: CGRP attenuates the anti-tumour immunity of RAMP1+ CD8+ T cells.

По сравнению с доброкачественными невусами, меланомы пациентов демонстрировали повышенную экспрессию Calca (расширенные данные рис. 1d). Наряду с другими маркерами ноцицепторных нейронов, избыточная экспрессия RAMP1 в этих биопсиях⁴⁰ коррелирует (P≤0.05) со снижением выживаемости пациентов (рис. 5d и расширенные данные рис. 11a-l). Влияет ли RAMP1 на истощение внутриопухолевых CD8+ Т-клеток, неизвестно. Чтобы ответить на этот вопрос, мы проанализировали два независимых беспристрастных набора данных РНК-последовательностей одноклеточных меланом человека^41,42 и обнаружили, что около 1,5% инфильтрирующих опухоль CD8+ Т-клеток экспрессируют RAMP1. Инфильтрирующие меланому RAMP1+ CD8+ Т-клетки пациентов избыточно экспрессировали рецепторы иммунных КПП PD-1 (также известный как PDCD1), TIM3 (HAVCR2), LAG3, CTLA4 и CD27 (рис. 5e и расширенные данные рис. 11m). Этот анализ также показал, что инфильтрирующие опухоль CD8+ клетки, собранные у пациентов, устойчивых к ICIs, заметно избыточно экспрессировали RAMP1 (расширенные данные рис. 11n-p). Такой профиль экспрессии напоминает функциональное истощение эффекторных CD8+ Т-клеток и предполагает, что CGRP-рецептор RAMP1 влияет на истощение CD8+ Т-клеток и клинический ответ на ICIs у пациентов с меланомой.

В целом, генетическое устранение ноцицепторных нейронов уменьшает рост опухолей B16F10, предотвращая истощение CD8+ Т-клеток, тогда как экзогенное введение CGRP оказывает противоположный эффект. Эти эффекты ограничены иммуногенными опухолями и не проявляются в отсутствие CD8 Т-клеток. Подобно доклиническому моделированию на мышах, данные по человеку свидетельствуют о том, что RAMP1-экспрессирующие CD8+ Т-клетки более склонны к истощению и ассоциируются с более низкой реактивностью на ICIs.

Иннервирующие опухоль ноцицепторы подавляют иммунный ответ на меланому путем регуляции множества рецепторов иммунных контрольных пунктов (КПП) на цитотоксических CD8+ Т-клетках. Блокирование оси CGRP-RAMP1 ослабляет это иммуномодулирующее действие нервной системы на CD8+ Т-клетки, тем самым защищая противоопухолевый иммунитет хозяина (расширенные данные рис. 12) и предоставляя потенциальные терапевтические возможности путем прерывания способствующих раку нейро-иммунных связей.