Протеинконвертаза субтилизин/кексин типа 1 (PCSK1, PC1/3) - это протеаза, экспрессируемая в нейроэндокринных тканях. PC1/3 обрабатывает и таким образом активирует различные центральные пропептиды, участвующие в регуляции массы тела, включая проопиомеланокортин (POMC), про-нейропептид Y (NPY) и про-агути-родственный белок (AgRP), а также периферические гормоны сытости, включая прогрелин, про-холецистокинин (CCK) и проглюкагон (дающий глюкагоноподобный пептид 1). Поэтому неудивительно, что мутации PCSK1 с потерей функции у человека приводят к сложному набору эндокринопатий, включая мальабсорбционную диарею, гипогонадотропный гипогонадизм, нарушение функции надпочечников, центральный диабет insipidus и гиперфагическое ожирение^1-5. Кроме того, в результате позиционного клонирования, исследования генов-кандидатов и геномных ассоциаций были выявлены общие несинонимные полиморфизмы в PCSK1, которые обуславливают риск развития ожирения^2-6. Мыши с нулевым геном Pcsk1 не страдают ожирением и поэтому не имитируют фенотип человека⁸. Однако у мышей, экспрессирующих усеченный вариант PC1/3, развивается гиперфагическое ожирение и повышается продуктивность метаболизма⁹. Дефицит POMC и, как следствие, недостаток пептидов, получаемых из POMC, ассоциируется с тяжелым ожирением у людей и грызунов^10,11, следовательно, нарушение обработки POMC может быть причиной гиперфагии у людей с дефицитом PC1/3.

В качестве альтернативы мы предположили, что недостаточное преобразование проинсулина до инсулина с помощью PC1/3 в клетках поджелудочной железы может быть связана с ожирением. Действительно, рецептор инсулина широко экспрессируется в мозге¹² , а введение инсулина непосредственно в мозг снижает потребление пищи и увеличение массы тела у бабуинов и грызунов^13,14. Напротив, ингибирование центрального инсулинового сигнала увеличивает потребление пищи и массы тела¹⁵. У людей интраназальное применение инсулина вызывает чувство сытости и снижает увеличение массы тела^16,17. Кроме того, удаление рецепторов инсулина в мозге увеличивает потребление пищи у грызунов^18,19. Более того, ожирение связано с центральной инсулинорезистентностью²⁰ или снижением транспорта инсулина в мозг²¹. Поскольку менее 1% периферического инсулина попадает в головной мозг²² посредством насыщаемого рецептора^23,24, а проинсулин имеет в 100 раз меньшее сродство к инсулиновому рецептору²⁵, то можно предположить, что нарушение преобразования проинсулина может привести к снижению действия центрального инсулина и, следовательно, к гиперфагическому ожирению.

Здесь мы разработали генетические модели, позволяющие осуществлять пространственно-временное устранение Pcsk1 у мышей. Мы показали, что центральный дефицит PC1/3 приводит к эндокринопатиям, но лишь незначительно влияет на регуляцию массы тела. Напротив, специфическое устранение Pcsk1 в клетках поджелудочной железы приводит к глубокому гиперфагическому ожирению, опосредованному недостатком зрелого инсулина. Более того, экспрессия PCSK1 в островках человека отрицательно коррелирует с индексом массы тела. Наши результаты позволяют предположить, что дефицит PC1/3 приводит к ожирению из-за отсутствия анорексигенных путей, направленных на инсулин.

Fig. 1: Induced whole-body PC1/3 deletion leads to pronounced hyperphagic obesity.

A Normalized Pcsk1 expression in the hypothalamus and pancreatic islets isolated from 12-week-old mice 4 weeks after knockout induction. B PC1/3 protein expression in hypothalami isolated from 14-week-old mice 5 weeks after knockout induction. Note: signal at 55?kDa is unrelated to PC1/3 and known to appear in this batch of antibody. C Food intake pre (from 7 to 8 weeks of age) and post (10-11 weeks of age) induction at 8 weeks of age. Each dot represents the average of a cage with 2-3 mice. D Body weight development. E Circulating glucose concentration after injection of 2?g?kg?1 glucose at 12 weeks of age 4 weeks post induction. Indicated p values relate to the comparison of Pcsk1fl/fl vs Pcsk1fl/fl UBC-CreERT2. F Proinsulin processing assessed by western blotting in pancreatic islets isolated from 12-week-old mice 4 weeks after induction. Open squares: Pcsk1fl/wt, open circles: Pcsk1fl/fl, red squares: Pcsk1fl/wt UBC-CreERT2, red triangles: Pcsk1fl/fl UBC-CreERT2. Data are presented as mean values?±?SEM. A and C were analyzed by a two-sided Mann-Whitney U test and D and E by a mixed-effects analysis with Holm-Sidak's multiple comparisons post hoc test. Source data are provided as a Source Data file.

...

У людей инактивационные мутации PC1/3 приводят к тяжелому ожирению³. Однако вклад тканеспецифической экспрессии PCSK1 неизвестен. Поэтому мы оценили уровень экспрессии РНК в опубликованном наборе данных РНК-секвенирования островков человека³⁵. Индекс массы тела отрицательно коррелировал с экспрессией PCSK1 и CPE, но не с PCSK2 или SCG5, что позволяет предположить, что островковый PC1/3 может быть важным фактором регуляции массы тела у человека (рис. 6A-C).



Fig. 6: Islet PCSK1 expression negatively correlates with body mass index in humans.

A-D Correlation of body mass index of donors and whole islet mRNA expression of A PCSK1, B PCSK2, C CPE, and D SCG5. The data set did not contain PCSK1N. Data extracted from GSE50244. n = 89. Source data are provided as a Source Data file.

Наша работа показывает, что нарушение переработки проинсулина является важным фактором, способствующим развитию гиперфагического ожирения, связанного с PC1/3. В то время как центральный дефицит PC1/3 лишь незначительно и преходяще увеличивал массу тела, клеточно-специфическое удаление PC1/3 вызывало выраженное ожирение в наших доклинических моделях мышей, а инсулинотерапия предотвращала гиперфагию.

Периферические сигналы, влияющие на потребление энергии, обрабатываются центральными цепями, и в этом процессе гипоталамические нейроны POMC являются основным местом интеграции. Активация POMC подавляет аппетит³⁶, а ингибирование POMC и мутации, снижающие активность POMC, вызывают ожирение у грызунов, собак и людей^10,11,36,37. Поскольку PC1/3 расщепляет POMC до анорексигенного α-MSH, каноническая точка зрения заключается в том, что связанное с PC1/3 ожирение может регулироваться снижением преобразования POMC. Однако, по-видимому, существует связь между переработкой POMC и развитием массы тела. Экстракты гипоталамуса, выделенные из мутантной мыши Pcsk1 N222D, страдающей ожирением, по-прежнему содержат 55% α-MSH⁹, но мыши с нулевым PC2, которые не вырабатывают α-MSH³⁸, не страдают ожирением³⁹. Более того, гипофизы, выделенные из цельного тела PC1/3 нокаутных мышей, по-прежнему имеют 50% содержание α-MSH⁸, а устранение PCSK1 в нейронах гипоталамуса, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, не влияет на содержание α-MSH⁴⁰. Таким образом, PC1/3 не нужен для преобразования POMC, а последний не обязательно регулирует развитие массы тела. В подтверждение этой идеи, удаление PC1/3 конкретно в нейронах POMC у взрослых не изменило развитие массы тела в течение 9 недель после индукции нокаута⁴¹. Мы подтвердили эти результаты, но, кроме того, наблюдали легкое ожирение в позднем возрасте у пожилых мышей. Более того, мы обнаружили, что пожизненный нокаут Pcsk1 в нейронах POMC вызывает ожирение, которое проходит после 6 и 12 месяцев у самцов и самок мышей, соответственно. У этих мышей был обнаружен уровень АКТГ, но недостаточный для нормальной работы надпочечников. Гонадные андрогены были снижены у этих мышей, но показатели размножения были нормальными. Аналогично, люди с дефицитом PC1/3 страдают от гипогонадизма^1,3, и наши данные позволяют предположить, что это частично опосредовано дефектной активностью PC1/3 в нейронах POMC.

Существуют значительные фенотипические различия в проявлении дефицита PC1/3 у людей и грызунов. Мыши с нулевым Pcsk1 истощены или страдают от преимплантационной летальности^8,42 , а Cmv-Cre версия нашей мышиной модели также нежизнеспособна. Такой очевидный контраст с пациентами с дефицитом PC1/3 может быть обусловлен тем, что у людей на ранних стадиях развития уровень надпочечниковых андрогенов высок, а у мышей зависит исключительно от синтеза гонадных андрогенов. Таким образом, у мышей может наблюдаться более тяжелая патология, поскольку недостаток гонадных андрогенов у человека может быть частично компенсирован.

В отличие от нашей модели нокаута PC1/3 по всему телу, широкие или целенаправленные линии нокаутов неожиданно обнаруживали лишь слабые преходящие фенотипические отклонения массы тела. Поэтому мы предположили, что может существовать важная, потенциальная периферическая, мишень PC1/3, которая регулирует формирование массы тела. Клетки поджелудочной железы казались логичными кандидатами, поскольку их основные продукты, инсулин и IAPP, обрабатываются PC1/3 и оба активируют центральные сигнальные пути насыщения. Действительно, мыши Pcsk1^fl/fl Pdx-Cre^ERT с индукцией нокаута во взрослом возрасте быстро становились гиперфагами и страдали ожирением. Концептуально, эти мыши представляют собой модель тяжелого диабета 2 типа, поскольку они увеличивают производство и секрецию менее активного и незрелого инсулина, чтобы держать гликемию под контролем. Потребление калорий было повышенным, и, несмотря на потерю калорий из-за глюкозурии, они набирали избыточную массу тела. Они фосфорилировали AKT и не развивали опасную для жизни гипергликемию, а также не впадали в катаболизм, несмотря на то, что у этих мышей отсутствовал полностью переработанный инсулин. Напротив, недостаток как зрелого, так и незрелого инсулина, как это наблюдается при диабете 1 типа, приводит к тяжелому катаболизму. Примечательно, что дефектный процессинг прогормонов островков и повышенный уровень проинсулина также были описаны у людей до и после начала диабета 1 типа (рассмотрено:43). Однако в настоящее время неизвестно, предрасполагает ли дефект преобразования прогормонов, присущий островкам, к развитию аутоиммунного диабета или же повышенная секреторная потребность вследствие аутоиммунного разрушения клеток приводит к относительному увеличению соотношения проинсулина и инсулина.

Исследование гормона сытости IAPP, вырабатываемого клетками, у мышей Pcsk1^fl/fl Pdx-Cre^ERT дало неожиданные результаты. Во-первых, в отличие от проинсулина, проIAPP перерабатывался в отсутствие PC1/3, возможно, с помощью PC2. Действительно, экспрессия PC2 и CPE, двух других протеаз, участвующих в переработке проинсулина/проIAPP, была повышена. Во-вторых, циркулирующие уровни IAPP были повышены, и это предотвращалось инсулинотерапией, что подтверждает совместную секрецию инсулина и IAPP³⁴. Несмотря на очень высокие циркулирующие в крови уровни эндогенного IAPP, эти мыши все еще страдали ожирением, это говорит о том, что IAPP не индуцирует сытость. В-третьих, мыши с двойным нокаутом Pcsk1 Iapp имели тот же фенотип массы тела, что и мыши с одиночным нокаутом Pcsk1, экспрессирующие Iapp. Это показывает, что фенотип ожирения не был вызван резистентностью к IAPP, индуцированной постоянным высоким циркулирующим уровнем IAPP. В этом контексте интересно, что в отличие от проинсулина, проIAPP не был обнаружен повышенным у людей с диабетом 2 типа^44-47. Эти данные доказывают, что в нашей мышиной модели IAPP не регулирует ожирение.

С другой стороны, нарушение переработки проинсулина опосредовало фенотип ожирения у мышей Pcsk1^fl/fl Pdx-Cre^ERT, а замена инсулина путем имплантации подкожных гранул инсулина предотвращала гиперфагию. Аноректический эффект центрального инсулина^{13,14,16,17,48} и орексигенный эффект дефицита центрального инсулина^15,18-20 хорошо описаны (обзор:49). Поскольку поглощение инсулина в мозге²² является процессом, опосредованным рецепторами^23,24, мы предположили, что мыши Pcsk1^fl/fl Pdx-Cre^ERT страдают ожирением, поскольку неполностью переработанный инсулин не может эффективно вызывать центральное насыщение. Удивительно, но мы легко обнаружили проинсулин-связанные пептиды в ЦНС мышей Pcsk1^fl/fl Pdx-Cre^ERT предполагая, что эти пептиды могут пересекать гематоэнцефалический барьер, несмотря на 100-кратное снижение сродства к рецептору инсулина²⁵. Однако, в подтверждение нашей гипотезы, центральное введение проинсулина не вызывало сытости, в то время как введение инсулина вызывало, несмотря на гораздо более длительный период полураспада проинсулина⁵⁰. Хотя отсутствие центрального действия инсулина является наиболее простым объяснением гиперфагии у этих мышей, в настоящее время мы не можем исключить, что гиперпроинсулинемия сама по себе вызывает гиперфагию и что инсулинотерапия предотвращает этот фенотип косвенно, снижая секреторную активность клеток и, таким образом, уровень циркулирующего проинсулина. Аргументом против этой гипотезы является наблюдение, что фосфорилирование AKT в тканях-мишенях инсулина было снижено, а не повышено у мышей Pcsk1^fl/fl Pdx-Cre^ERT .

Хотя экспрессия Pdx у взрослых в основном ограничивается β клетками^32,33, экспрессия репортерного гена, опосредованная рекомбинацией Cre, у некоторых мышей с драйвером Pdx-Cre была также обнаружена в двенадцатиперстной кишке и в нейронах гипоталамуса^51,52, это повышает вероятность того, что наблюдаемая гиперфагия может быть опосредована неклеточными мишенями. Тем не менее, уровни кишечной PC1/3-мишени GLP-1 не были изменены, и мы, как и другие исследователи⁵³ , обнаружили, что ген мишень не был снижен в гипоталамусе при исследовании мышей с драйвером Pdx-Cre^ERT(Dam). Более того, ни одна из нейрон-специфических моделей нокаута PC1/3 не повторила выраженный фенотип ожирения, наблюдаемый у мышей по всему телу или Pcsk1^fl/fl Pdx-Cre^ERT , а заместительная терапия инсулином предотвращала гиперфагию. Эти данные убедительно свидетельствуют о том, что дефицит Pcsk1 в клетках поджелудочной железы опосредует наблюдаемый фенотип ожирения. Примечательно, что как конститутивное, так и у взрослых удаление PC1/3 в тканях, экспрессирующих POMC, вызывало ожирение, хотя только в легкой и преходящей форме, показывая, что процессинг POMC регулирует развитие массы тела.

Полное отсутствие PC1/3 у людей^3-5,54 и в нашей модели мыши с индуцируемым нокаутом всего тела вызывает гиперфагическое ожирение. Однако и частичное снижение экспрессии Pcsk1, по-видимому, регулирует развитие массы тела. В мышиных моделях со сниженной активностью PC1/3 развивается ожирение^9,55, а у человека несинонимные полиморфизмы в PCSK1 повышают риск ожирения^6,7. Интересно, что пред-диабет и диабет 2 типа, которые ассоциируются с ожирением, характеризуются снижением экспрессии PCSK1 в панкреатических островках³⁵ и нарушением преобразования проинсулина, что приводит к увеличению соотношения проинсулина и инсулина^45-,47. Мыши-нокауты по инсулину нежизнеспособны⁵⁶ , но мыши с нулевым инсулином Ins1 или Ins2 имеют нормальный уровень циркулирующего в крови инсулина, у них не развивается гипергликемия или ожирение⁵⁷. Таким образом, снижение дозы инсулина само по себе не является достаточным для изменения развития массы тела. Повышенная секреция инсулина, наблюдаемая при пред-диабете, может быть следствием повышенной потребности в инсулине из-за связанной с ожирением инсулинорезистентности. Тем не менее, существование врожденного дефекта секреции инсулина было предложено и подтверждено исследованиями GWAS^58,59. Особый интерес представляют вышеупомянутые полиморфизмы в PCSK1, которые связаны с ожирением^6,7. Можно предположить, что генетическая предрасположенность к изменению экспрессии и преобразования инсулина может способствовать развитию ожирения, а не (только) быть его следствием⁶⁰. Более того, синдром Прадера-Вилли, генетическое заболевание, характеризующееся выраженной гиперфагией, ассоциируется с пониженным уровнем PC1/3 в островках⁶¹. В подтверждение роли PC1/3 в регуляции массы тела человека мы обнаружили, что индекс массы тела отрицательно связан с экспрессией PCSK1 в островках. Примечательно, что эндопептидаза CPE, но не PCSK2, также отрицательно коррелировала с индексом массы тела. Интересно, что мыши с нулевым Cpe страдают ожирением и не имеют зрелого инсулина⁶², в то время как мыши с нулевым PC2 не страдают ожирением⁶³.

В целом, наши данные показывают, что основной механизм ожирения, вызванного дефицитом PC1/3, не является дефектом центрального процессинга, и мы предполагаем, что инсулин, вырабатываемый клетками поджелудочной железы, является основным игроком в этой патологии. Поэтому разумная экзогенная терапия инсулином в дозе, близкой к физиологической, может предотвратить ожирение у людей с дефицитом, вызывая чувство сытости и не способствуя чрезмерному отложению жира.