Дорсолатеральная префронтальная кора (DLPFC) из области Бродмана 9 (BA9) пациентов с шизофренией и соответствующего контроля (9 и 14 человек, соответственно) анализировалась методом snRNA-seq на протяжении всего исследования. Область BA9 была выбрана на основании функциональных и анатомических данных пациентов с шизофренией, показывающих аномальную активность мозга, морфологию нейронов и экспрессию генов в этой области по сравнению с соответствующим контрольным мозгом (27-29). Важно отметить, что наша когорта образцов была сформирована с учетом потенциальных факторов, включая возраст доноров образцов (подавляющее большинство образцов было получено от 55-70-летних субъектов), их посмертные интервалы (PMIs) от 1 до 23 часов) и другие факторы (таблицы S1 и S2) (рис. S1, A и B). Более того, графики с многомерными шкалами (scaling), визуализирующие образцы на основе сходства их транскриптома, показали отсутствие влияния источника ткани, возраста, возраста появления первых симптомов и продолжительности заболевания на транскриптомное расстояние между контрольными образцами и образцами с шизофренией (рис. S1C).

Для каждого образца микро-иссеченные колонки коры, содержащие все слои, были отсортированы на ядра нейронов на основе экспрессии нейронального маркера NeuN (рис. 1A и рис. S2A). Стратегия сортировки NeuN+ была разработана таким образом, чтобы в отбрасываемой фракции NeuN было лишь незначительное количество ядер нейронов, а во фракции NeuN+ отбиралось более 95% нейронов, что было подтверждено нами ранее (30), и snRNA-seq проводили с использованием 10-кратного анализа Chromium v3. В целом, мы секвенировали 225 012 ядер (54 230 чтений на ядро), из которых 209 053 (81 817 с шизофренией и 127 236 контрольных ядер) прошли анализ контроля качества и фильтрацию дублетов и были высокого качества (с ~12 000 средними уникальными молекулярными идентификаторами (UMI) и ~4400 средними генами, обнаруженными на ядро; рис. S2, B-E, и таблица S1).

Fig. 1. snRNA-seq analysis of the DLPFC from patients with schizophrenia and matched controls.

(A) Experimental design of the snRNA-seq measurements. FACS, fluorescence-activated cell sorting. (B) UMAP representation of the measured nuclei, colored by subtypes. (C) Expression of marker genes for major cortical cell types, visualized on the UMAP embedding: GABAergic interneurons, principal neurons, and glia; additional markers distinguish families of GABAergic interneurons and principal neurons. (D) Heatmap showing expression of markers for specific neuronal subtypes. (E) Estimated cortical layer positions of the neuronal subtypes. These are predictions based on Allen Institute data (32, 33) with manual cortical layer microdissections before nuclei isolation and sequencing. Because of manual layer dissections, small degree of mispositioning of subtypes (e.g., principal neurons in layer 1) is expected.

... Чтобы охарактеризовать связанные с шизофренией различия в DLPFC, мы сначала изучили, изменен ли состав коры у больных шизофренией. Анализ нормализованной плотности клеток на совместных вкраплениях UMAP (рис. 2A) и прямое сравнение пропорций клеток (рис. S6, A и B; точные числа и доли ядер для каждого семейства/подтипа нейронов см. в таблице S4) показали общее снижение GABA-эргических интернейронов при шизофрении, затрагивающее подтипы из всех семейств, в частности, относящиеся к PVALB, SST и VIP. Этому противостояло увеличение доли основных нейронов, принадлежащих к семейству L2_3_CUX2 и подтипу L4_5_FEZF2_LRRK1 (рис. 2A и рис. S6, A и B). Поскольку изменения в доле одного подтипа потенциально могли исказить представленность других подтипов, мы применили методы анализа композиционных данных (34, 35) для расчета надежных оценок композиционных изменений (см. Материалы и методы). Этот анализ подтвердил, что шизофрения связана с общим увеличением большинства подтипов L2_3_CUX2 и L5_6_FEZF2 (включая L4_5_FEZF2_LRRK1) семейств главных нейронов и уменьшением нескольких подтипов интернейронов, наиболее заметных для семейств SST и PVALB (рис. 2B и рис. S6C), включающих подтипы, локализованные в L2-L3 (например, SST_CALB1; рис. S6C). Наконец, чтобы подтвердить композиционные изменения в главных нейронах с помощью независимого набора данных, мы повторно проанализировали крупнейший объемный транскриптомный набор данных мозга больных шизофренией в том же регионе - DLPFC (CommonMind: 353 больных шизофренией и 501 контрольный человек) (24, 36) - и провели деконволюцию подтипов нейронов на основе их сигнатур из нашего набора данных. Из-за сложности и перекрывающегося характера транскриптомных сигнатур, характеризующих тонкие подтипы нейронов, такой подход мог быть реализован только для семейств главных нейронов. Деконволюция подтвердила, что семейства L2_3_CUX2 и L5_6_FEZF2 имеют повышенную долю в DLPFC у больных шизофренией (рис. S6D).

Fig. 2. Compositional and transcriptomic changes in the cortex of patients with schizophrenia.

(A) Cell density differences between schizophrenia and control groups analyzed using UMAP embedding. Left: Visualization of control and schizophrenia cells. Middle: Cell density visualized from the control and schizophrenia samples, using UMAP embedding. Right: Statistical assessment of the cell density differences. Student's t test was used, visualized as a z score. (B) Change in neuronal composition evaluated by compositional data analysis. Top cell types distinguishing composition of control and schizophrenia samples are shown. The x axis indicates the separating coefficient for each cell type, with the positive values corresponding to neurons with increased abundance in schizophrenia and negative values to decreased abundance. The boxplots and individual data points show uncertainty based on bootstrap resampling of samples and cells (for full plot, see fig. S6C). Red line represents cutoff for significance of adjusted (by the Benjamini-Hochberg method) P values (significant cell types are above the line). ***P = 0.0001 to 0.001. (C and D) Boxplots showing the magnitude of transcriptional change between control and schizophrenia states for medium-resolution (C) and high-resolution (D) annotations. The magnitude is assessed on the basis of a Pearson linear correlation coefficient, normalized by the medium variation within control and schizophrenia groups (see Materials and Methods). The cell types are ordered on the basis of the mean distance, with the most affected cell types shown on the right. The distribution here arises as a result of comparisons of different pairs of patients/controls. The lower panels show the predicted cortical layer positions. Multiple correction was done by Benjamini-Hochberg. *P = 0.01 to 0.05. ns, not significant. (E) Boxplots showing interindividual gene expression distances (based on Pearson correlation) within control and schizophrenia samples, averaged across all neuronal cell types. ****P = 0.00001 to 0.0001. (F) Multidimensional scaling visualization of the similarity of gene expression between all samples, based on the distances shown in (E).

В целом, несколько подходов привели к согласованным результатам композиционных изменений подтипов нейронов в DLPFC больных шизофренией. Анализ показал снижение количества GABA-эргических нейронов семейств SST и PVALB, с наиболее заметным изменением в подтипе верхнего слоя SST-SST_CALB1. Кроме того, было показано увеличение количества главных нейронов верхнего слоя.

Затем мы изучили, насколько может быть изменено транскрипционное состояние различных нейронов при шизофрении. рис. 2C). Пять отдельных подтипов с наибольшими сдвигами экспрессии принадлежали подтипам нейронов из верхних слоев - PVALB_CRH, PVALB_SST, L2_CUX2_LAMP5_PDGFD, SST_CALB1 и L2_CUX2_LAMP5_MARCH1 (рис. 2D).

Мы обнаружили, что пациенты с шизофренией демонстрировали значительно большую меж-индивидуальную изменчивость экспрессии (рис. 2E), причем эта тенденция была выражена во всех подтипах нейронов (рис. S7A). При визуализации расстояний между образцами с помощью многомерного шкалирования мы обнаружили, что в то время, как контрольные группы были сгруппированы ближе друг к другу, образцы больных шизофренией были разбросаны в разных направлениях (рис. 2F). Анализ показал отсутствие значительных сдвигов экспрессии в "общем" направлении для любого подтипа нейронов при шизофрении (рис. S7, B и C). Таким образом, отсутствие общих сдвигов экспрессии и расширение образцов шизофрении позволяет предположить, что разнообразие фенотипов шизофрении может быть основано на разнообразии транскриптомных изменений в подтипах нейронов.

В целом, наиболее сильное влияние шизофрении на композиционные и транскриптомные изменения было связано с подтипами главных нейронов и GABA-эргических интернейронов в L2-L3 DLPFC. Существует большое количество данных, свидетельствующих о широкой эволюции L2-L3 вдоль оси грызун-примат-человек, в основном для главных нейронов (38-40). Поскольку эволюционная дивергенция интернейронов недостаточно хорошо изучена, мы провели количественную оценку межвидовых экспрессионных расстояний на основе недавно проведенного выравнивания моторной коры человека, мартышки и мыши (41). Анализ показал, что подтипы ID2 и PVALB в области L2-L3 имеют наибольшее расхождение в экспрессии у человека (рис. S7, D и E). Таким образом, очаг изменений в подтипах L2-L3 коррелирует с положением эволюционно наиболее дивергированных подтипов нейронов человека.

Наибольшие композиционные и транскриптомные изменения при шизофрении были отнесены к подтипам GABA-эргических интернейронов и главных нейронов в верхних слоях 2 и 3 DLPFC. Мы провели иммуногистохимическую (IHC) характеристику различных семейств GABA-эргических интернейронов во всех слоях коры в образцах мозга, взятых из парафина, включая случаи, проанализированные с помощью snRNA-seq (рис. 3A и таблица S5). Мы пометили кальретинин-экспрессирующие (CR+; кодируется геном CALB2) GABA-эргические интернейроны, наиболее обогащенный маркер интернейронов в верхних слоях коры головного мозга человека (42), и PV-экспрессирующие GABA-интернейроны (PV+; кодируется геном PVALB) и применили общий маркер основных клеток SMI 31.1 (белковый продукт генов NEFH и NEFM) в 10 образцах при шизофрении и 10 контрольных образцах. Кальбиндин (CB+; кодируется геном CALB1) и нейропептид Y (NPY+; кодируется геном NPY) GABA-эргических интернейронов были проанализированы в подгруппе из шести образцов шизофрении и шести контрольных образцов. Мы применили окрашивание по Нисслю к этой подгруппе образцов и рассчитали общую плотность нейронов в слоях DLPFC.



Fig. 3. Changes in density and distribution of CR+, PV+, VIP, and ID2 interneuron subtypes in the cortex of patients with schizophrenia.

(A) Experimental scheme for immunohistochemical (IHC) analysis. (B and C) Representative images and layer-wise IHC quantification of CR+ neurons in the DLPFC in patients with schizophrenia (SCZ) and control individuals (CTR); linear mixed model analysis with Bonferroni multiple comparison correction. Scale bars, 100 ?m. (D) Heatmap showing expression of major markers for subgrouping of ID2 and VIP subtypes of GABAergic interneurons. (E and F) Overview of simultaneous CR IHC and smFISH of VIP and CRH mRNAs, and representative confocal images for three subgroups of ID2 and VIP subtypes that could be distinguished on the basis of triple CR/VIP/CRH labeling in L2 DLPFC. Scale bars, 100 mm. (G to I) Quantification of density for CR+/VIP+/CRH+(VIP_CRH, VIP_ABI3BP, and VIP_TYR), CR+/VIP?/CRH+ (ID2_PAX6), and CR+/VIP-/CRH- (ID2_NCKAP5 and VIP_SSTR1) subgroups of ID2 and VIP subtypes; linear mixed model analysis with Bonferroni multiple comparison correction. (J and K) Representative images and layer-wise quantification of PV+ neurons in the DLPFC in patients with schizophrenia and control subjects; linear mixed model analysis with Bonferroni multiple comparison correction. Scale bars, 100 ?m. Diamonds on all plots represent means; error bars, ±SD.

... Не было обнаружено признаков изменения содержания белка CR в CR+ нейронах при шизофрении на основании интенсивности маркировки CR+ нейронов или данных по экспрессии генов, специфичных для подтипа (рис. S7F).

Чтобы выделить подтипы VIP и ID2 и потенциально определить, какой из них может объяснять наблюдаемое снижение плотности CR+ в шизофреническом DLPFC, мы использовали одномолекулярную флуоресцентную гибридизацию in situ (smFISH) и использовали ряд следующих маркеров на основе транскриптомных данных ... (рис. 3, D - F). Мы подтвердили, что все эти субпопуляции были наиболее многочисленны в L2-L3. Тройной позитивный подтип CR+/VIP+/CRH+ показал сниженную плотность в L2 и в L3, что указывает на то, что этот подтип интернейронов CR наиболее поражен (рис. 3Г). Однако эти изменения не были статистически значимыми при применении поправки Бонферрони для множественных сравнений (таблица S5F).

PV+ и CB+ GABA-эргические интернейроны также имели подтипы с большими композиционными и транскриптомными изменениями в анализе snRNA-seq. Хотя наш гистологический анализ показал заметное снижение плотности PV+ интернейронов в L2 при шизофрении (рис. 3, J и K) и заметное снижение плотности CB+ интернейронов в L2 при шизофрении (рис. 4, A и B), PMI показал значительный сбивающий эффект в обоих случаях (P = 8,3 х 10^-7 и 4,6 х 10^-3, соответственно; таблица S5F). Это может быть связано с включением некоторых образцов с высоким PMI в гистологический анализ из-за отсутствия образцов с низким PMI, тогда как анализ snRNA-seq проводился исключительно на образцах с низким PMI. Гистологический анализ NPY+ нейронов (представляющих в основном транскриптомный подтип SST_NPY) не выявил существенных различий между диагностическими группами в зависимости от слоя (рис. 4, C и D, и таблица S5G). Маркировка на Nissl и SMI31.1 не выявила статистически значимого снижения плотности общего числа нейронов или плотности основных нейронов, соответственно, ни в одном из слоев коры (рис. 4, E - H).



Fig. 4. Changes in density and distribution of CB+and NPY+ interneurons and excitatory neurons in the DLPFC in schizophrenia.

(A and B) Representative immunohistochemical (IHC) images and layer-wise quantification of GABAergic interneurons that express CB in the DLPFC in patients with schizophrenia and control subjects. (C and D) Representative IHC images and layer-wise quantification of GABAergic interneurons that express NPY neurons in the DLPFC in patients with schizophrenia and control subjects. (E and F) Representative IHC images and layer-wise quantification of Nissl-labeled neurons in the DLPFC in patients with schizophrenia and control subjects. (G and H) Representative IHC images and layer-wise quantification of principal neurons labeled by SMI31.1 in the DLPFC in patients with schizophrenia and control subjects. Diamonds on all plots represent means; error bars, ±SD. Analysis of cell densities on (B), (D), (F), and (H) was done using linear mixed model analysis with Bonferroni multiple comparison correction.

Чтобы получить дальнейшее представление о транскриптомных изменениях при шизофрении, мы рассчитали дифференциально экспрессированные гены (DEGs) для каждого подтипа между образцами с шизофренией и контрольными образцами (рис. S8 и S9; полные данные о DEGs для каждого подтипа со всей статистической информацией представлены в таблице 1 Дополнительного набора данных https://doi.org/10.5281/zenodo.5810785). В соответствии с результатами snRNA-seq, более высокая доля DEGs была связана с нарушениями регуляции в подтипах верхнего слоя коры (рис. 5A).



Fig. 5. Schizophrenia-associated changes in the DEGs and pathways.

(A) Fraction of all DEGs with predicted cortical layer positions below. Line inside the box represents median, and lower and upper hinges of the box correspond to the first and third quartiles. Upper and lower whiskers correspond to the smallest and the largest values. (B) Expression levels of CHRFAM7A across neuronal subtypes in the DLPFC identified by snRNA-seq. CR+ subtypes are highlighted in blue; P values were estimated by Wald test in DESeq2, multiple comparison correction by the Benjamini-Hochberg method. Diamond represents median. (C) Representative images for detection of CHRFAM7A mRNA in L2 CR+ neurons of schizophrenia and control subjects. Scale bars, 20 µm. (D) Quantification of proportion of L2 CR+ neurons that colocalize with CHRFAM7A mRNA in schizophrenia and control DLPFC (n = 3 control + 3 schizophrenia, means ± SD) and CHRFAM7A mRNA levels in L2 CR+ neurons. (E) DEGs were determined for antipsychotic-positive (100) and antipsychotic-negative (47) bulk RNA-seq samples for the DLPFC of schizophrenia patients. Overlap between antipsychotic-associated DEGs and DEGs for control versus schizophrenia in our snRNA-seq dataset was identified by hypergeometric test. Benjamini-Hochberg-adjusted P values. (F and G) DEGs were determined for placebo versus haloperidol/clozapine bulk RNA-seq samples for the DLPFC of rhesus macaque (n = 34). Overlap between drug treatment DEGs and DEGs for control versus schizophrenia in our snRNA-seq dataset was identified by hypergeometric test. Benjamini-Hochberg-adjusted P values. (H and I) List of GO terms significantly enriched in the set of top down- and up-regulated genes in the neuronal subtypes from schizophrenia DLPFC, compared to controls. Top 3 GO terms by adjusted P value per each cell type are shown. Colored by neuronal subtype. UL, upper layers. UL GO terms are in bold. Bonferroni-adjusted P values are shown. Dotted line represents P value significance cutoff. The full list of significant GO terms is in figs. S10 and S11.

Для подтверждения DEG, специфичных для подтипов нейронов, на основе данных snRNA-seq мы выбрали ген, кодирующий белок нейротрансмиссии, CHRFAM7A, который широко экспрессировался во всех подтипах нейронов CR+ и демонстрировал устойчивую даун-регуляцию при шизофрении (рис. 5B). CHRFAM7A - это специфический для человека слитый белок, обладающий свойствами ацетилхолинового рецептора, и было предложено, что он играет уникальную роль при шизофрении (43). Используя smFISH, мы исследовали подмножество участков DLPFC больных шизофренией и контрольной группы (n= 3 против 3), чтобы подтвердить изменения в экспрессии CHRFAM7A в CR+ клетках у пациентов с шизофренией. Соотношение L2 CR+CHRFAM7+ ко всем L2 CR+ нейронам было снижено на 18% у пациентов с шизофренией. Кроме того, уровень экспрессии CHRFAM7 в L2 CR+ нейронах был снижен у пациентов с шизофренией на 77% (рис. 5, C и D). Таким образом, анализ smFISH дополнительно подтверждает выявленные нами с помощью snRNA-seq транскриптомные изменения в коре головного мозга пациентов с шизофренией.

... Мы исследовали перекрывание DEGs, связанных с антипсихотиками у человека или с лечением макак, с DEGs, связанными с контрольными образцами и образцами шизофрении, либо для всех возбуждающих или тормозных нейронов, либо для каждого подтипа нейронов в нашем наборе данных. Мы обнаружили, что полученное перекрытие было незначительным (рис. 5, E - G), это указывает на то, что DEGs, отличающие пациентов с шизофренией от контрольной группы, скорее всего, связаны с шизофренией, а не с антипсихотическим лечением.

Чтобы изучить пути, которые могут лежать в основе связанных с шизофренией изменений в функции нейронов, мы извлекли наиболее высоко/низко регулируемые гены для каждого подтипа и рассчитали обогащение для терминов генной онтологии (GO) (Таблица 2 Дополнительного набора данных, https://doi.org/10.5281/zenodo.5810785). Наиболее значимые понижающие GO термины были связаны с энергетическим метаболизмом и биогенезом и локализацией белков [см. 3 лучших GO термина на подтип (или меньше, если есть менее 3 значимых GO терминов) на рис. 5H и полный список на рис. S10]. Напротив, гены с повышенной частотой регуляции были обогащены функционально значимыми путями, которые связаны с нейротрансмиссией, пластичностью и процессами развития [см. 3 лучших GO-термина на подтип (или меньше, если есть менее 3 значимых GO-терминов) на рис. 5I и полный список на рис. S11]. Вызванная шизофренией пониженная регуляция путей энергетического метаболизма и биогенеза белка и повышенная регуляция путей нейротрансмиссии и пластичности указывают на нарушение энергообеспечения и синтеза белка в пораженных подтипах нейронов и аберрантную активность нейронных сетей при шизофрении. Мы отметили, что повышение регуляции GO терминов нейротрансмиссии и пластичности и понижение регуляции GO терминов энергетического метаболизма и синтеза белка одинаково влияло на большую группу подтипов нейронов, в основном на верхних слоях на GABA-эргические интернейроны и семейства главных нейронов L2_3_CUX2 и L5_6_FEZF2 (рис. S12, A и B, для семейств и рис. S12, C и D, для подтипов). Кластеризация GO терминов по уровню их обогащения в каждом из подтипов выявила группы подтипов с похожими паттернами обогащения, что позволяет предположить, что они находятся в одной нейронной сети. Таким образом,существовали некоторые специфические для верхнего слоя сети, например, GABA-эргические интернейроны верхнего слоя VIP_ABI3BP кластеризовались с L2_3_CUX2_LAMP5_PDGFD (рис. S12E), а GABA-эргические интернейроны верхнего слоя - с L2_3_CUX2_LAMP5_PDGFD (рис. S12E). S12E) и верхний слой SST_CALB1 кластеризовался с L2_3_CUX2_LAMP5_PDGFD, верхний слой PVALB_SST с L2_3_CUX2_FREM3_SV2C и L2_3_CUX2_FREM3_UNC5D, а верхний слой PVALB_CRH с ID2_LAMP5_NOS1 (рис. S12F). Кроме того, были обнаружены межслойные сети, такие как большой кластер GABA-эргических нейронов PVALB, ID2 и VIP с подтипами основных нейронов L4_5 (рис. S12E). Эти результаты свидетельствуют о транскрипционных нарушениях в различных подтипах нейронов, которые потенциально организованы в локальные сети верхнего слоя или более дальнодействующие сети, охватывающие верхние и нижние слои в DLPFC человека. Эти нарушения в кортикальных сетях, скорее всего, способствуют возникновению нейропсихиатрических симптомов шизофрении.

Кроме того, мы проверили экспрессию нейротрансмиттерных рецепторов, которые, как предполагается, вносят вклад в фенотипы, связанные с шизофренией, или являются мишенями антипсихотических препаратов первой линии (45,46) - дофаминового рецептора DRD2, рецептора GABA GABRA1, глутаматного рецептора каинатного типа GRIK3, глутаматных рецепторов N-метил-D-аспартата (NMDA)-типа GRIN2A и GRIN2C, и окситоцинового рецептора OXTR (рис. S12G). S12G). Среди них экспрессия GABRA1 была снижена в SST_TAC3, SST_STK32A и PVALB_CRH; экспрессия GRIN2A была снижена в PVALB_CRH, а снижение экспрессии OXTR было обнаружено в SST_NPY (с поправкой на множественные гипотезы) (рис. S12G). Мы также отметили, что эти гены рецепторов экспрессировались от немногих до нескольких подтипов нейронов. Модуляция этих целевых рецепторов оказывает благоприятное воздействие на подтипы нейронов-мишеней, плохо экспрессирующих эти рецепторы при шизофрении. Однако не-направленная доставка модуляторов может потенциально влиять на другие подтипы нейронов, не затронутые болезнью, что еще больше усложняет проблему нейронных нарушений при шизофрении.

Чтобы сделать вывод об активности транскрипционных факторов по данным snRNA-seq, мы использовали DEGs между шизофренией и контрольными образцами в качестве потенциальных мишеней транскрипционных факторов и базу данных regulon, полученную из DoRothEA (47). Мы провели анализ обогащенных регулонов с помощью алгоритма aREA, реализованного в пакете VIPER (48), используя z-баллы DEGs. Мы оценили экспрессию 267 уникальных транскрипционных факторов во всех типах клеток, которые были далее проанализированы с помощью иерархической кластеризации для выявления дифференциально обогащенных регуляторов, связанных с шизофренией (рис. 6, A и B; полную тепловую карту см. на рис. S13). Наш анализ выявил ряд транскрипционных факторов, которые уже были связаны с шизофренией в результате анализа широкогеномных ассоциативных исследований (GWAS), включая TCF4, PRDM14, ASCL1, POU5F1, TEAD1, ZEB2 и FOXP1 (49-52). Некоторые из выявленных факторов с самым высоким и самым низким показателями обогащения (TCF4, ASCL1, ZEB2, HIF1A и LHX2) были выделены при исследовании другой области префронтальной коры, BA10, пациентов с шизофренией с помощью snRNA-seq (53), что подтверждает наши данные. Основные транскрипционные факторы TCF4 и ASCL1 считаются важными факторами предрасположенности к шизофрении, участвующими в корковом нейрогенезе, созревании и миграции нейронов (54, 55), и оба они были положительно обогащены в кластере подтипов верхнего и нижнего слоев коры (рис. 6B). Кроме того, кластеры подтипов интернейронов SST и подтипов главных нейронов верхнего слоя L2_3_CUX2 показали отрицательное обогащение HIF1A, фактора гипоксии, связанного с нарушениями морфологии мозга и аномальным развитием нервной системы (54), и двух факторов, важных для биосинтеза липидов и антипсихотического ответа, SREBF1 и SREBF2 (56) (рис. 6A). Кроме того, в нейронах SST наблюдалось увеличение содержания ZEB2 и FOXP1 - транскрипционных факторов, выявленных в GWAS, связанных со структурными аномалиями мозга (57-59). В целом, анализ сетей транскрипционных факторов подтверждает связь выявленных путей с нарушениями нейроразвития и шизофренией. Неправильная экспрессия транскрипционных регуляторов может способствовать нарушениям в нейронных цепях при шизофрении.



Fig. 6. Transcription factor networks in schizophrenia and enrichment of DEGs in genetic association with schizophrenia.

(A and B) Transcription factor (TF) enrichment in DEG genes was estimated based on the z score of the DEGs and was normalized for the purpose of hierarchical clustering. Overall, expression of 267 unique transcription factors across all cell types was estimated, which were further analyzed with hierarchical clustering to identify differentially enriched regulators associated with schizophrenia (see fig. S13 for the complete heatmap). NES, Normalized enrichment score. (C and D) Hypergeometric testing to identify significant overlap between DEGs in our dataset with genes relevant for schizophrenia from the DisGeNET database (60) and from the SFARI database. Black dotted line indicates P value cutoff. P values were adjusted using Bonferroni correction. (E) Linkage disequilibrium score regression analysis to estimate correlation between DEGs and with the largest schizophrenia GWAS dataset (61). L2_CUX2_LAMP5_PDGFD subtype (marked in red) showed significant correlation after adjusting P value by Bonferroni correction. Dotted line, significance cutoff.

Для дальнейшего подтверждения важности транскриптомных изменений, выявленных в нашем исследовании, для шизофрении, мы интегрировали данные snRNA-seq с несколькими наборами данных, содержащими гены, ранее ассоциированные с шизофренией и другими психическими расстройствами. Сначала мы провели гипергеометрическое тестирование для выявления значительных перекрытий между DEGs в нашем наборе данных с генами, имеющими отношение к шизофрении, из базы данных DisGeNET (60). Этот анализ выявил GABA-эргические нейроны SST, верхних слоёв подтипы GABA-эргических нейронов PVALB и VIP, а также главные нейроны, принадлежащие в основном к семействам L2_3_CUX и L5_6_FEZF2, как подтипы с наиболее значительным обогащением DEGs генами, связанными с шизофренией (рис. 6C). Мы также провели подобный анализ для генов расстройств аутистического спектра из базы данных Simons Foundation Autism Research Initiative (SFARI), который показал аналогичные результаты (рис. 6D), подчеркивая общность нарушений в нейронных сетях при шизофрении и расстройствах аутистического спектра. Интеграция наших данных snRNA-seq с крупнейшим набором данных GWAS по шизофрении (61) выборочно определила подтип L2_CUX2_LAMP5_PDGFD в верхних слоях коры как обогащенный генами GWAS по шизофрении (рис. 6E). В целом, генетические данные сильно коррелируют с результатами анализа snRNA-seq, что еще больше указывает на значимость изменений, выявленных в нашем исследовании, для нарушений функций мозга, связанных с психическими расстройствами.

Для повышения пространственного разрешения и дальнейшего подтверждения связанных с шизофренией транскриптомных и композиционных изменений в DLPFC мы использовали анализ пространственной транскриптомики Visium (рис. 7A). Мы проанализировали семь доноров с шизофренией и семь контрольных доноров, ранее включенных в наши когорты snRNA-seq и гистологических исследований (таблицы S1, S2 и S6). Изменения в экспрессии генов, выявленные с помощью пространственной транскриптомики, перекрывались с ранее обнаруженными изменениями экспрессии генов в данных snRNA-seq, в частности, в верхних слоях (рис. 7B; рис. S12, H и I; и таблицы 3 и 4 Дополнительного набора данных, https://doi.org/10.5281/zenodo.5810785). Пересекающиеся термины GO относятся к важным группам нейротрансмиссии, организации синапсов и метаболизма, что подчеркивает физиологически значимую общность пространственных и транскриптомных данных по отдельным ядрам. Далее мы проанализировали DEGs, выявленные с помощью пространственной транскриптомики, и заметили горячую точку транскриптомных изменений в верхних слоях коры, где были обнаружены GO термины, связанные с познанием, нейроразвитием и нейротрансмиссией, тогда как отличия путей в нижних слоях были гораздо менее заметны (рис. 7, C и D; рис. S12, J и K; и Таблица 4 Дополнительного набора данных, https://doi.org/10.5281/zenodo.5810785), что согласуется с результатами нашего анализа snRNA-seq. Мы также отметили возможные нарушения в работе глии, поскольку в пространственном анализе присутствуют все типы клеток DLPFC (Supplementary Dataset Table 4, https://doi.org/10.5281/zenodo.5810785), что дает нам еще большее представление о высокой сложности шизофрении на пространственном тканевом уровне.

Fig. 7.

Spatial transcriptomics analysis identified local transcriptional and compositional perturbations.

(A) Experimental scheme for spatial transcriptomics. (B) Individual GO terms in neuronal subtypes in the DLPFC of patients with schizophrenia that were enriched in up-regulated genes in both snRNA-seq and spatial transcriptomics data. GO term P values were Benjamini-Hochberg-corrected. (C and D) Clusters of GO terms in neuronal subtypes in the DLPFC of patients with schizophrenia that were enriched in up/down-regulated genes in spatial transcriptomics data. Visium spots were aggregated by cortical layer (L1-L6) for DE analysis. P values represent Bonferroni-corrected values of 0.05 or lower. (E) Spatial location of a selected set of neuronal cell types in Visium data. The location was estimated using Stereoscope cell subtype deconvolution from Visium mini-bulk data. Subtype location largely recapitulates expected spatial distribution demonstrated in Fig. 1E. Fractions of deconvoluted cell subtypes per Visium spot are shown on top of the representative tissue slice. Neuronal subtypes correspond to subtypes identified using snRNA-seq in Fig. 1B. Non-neuronal cell types were predicted using Allen Institute Cell Types Database: RNA-Seq Data Human M1 - 10^x Genomics reference dataset (84). The detailed location of all subtypes across all samples is demonstrated in fig. S14. (F) Changes in neuronal composition in the DLPFC of patients with schizophrenia that were identified in the spatial transcriptomics data. Normality was tested using Shapiro-Wilk test, and equality of variances was tested using Levene's test. As part of the data was not normally distributed, independent two-group Mann-Whitney U test was used to test significance of differences for all group pairs. Multiple comparison correction was done using the Benjamini-Hochberg method. Line inside the box represents median, and lower and upper hinges of the box correspond to the first and third quartiles. Upper and lower whiskers correspond to the smallest and the largest values, and not more than 1.5^x interquartile range.

Пространственный анализ подтвердил наши предыдущие оценки послойного распределения главных нейронов и преимущественной локализации GABA-эргических интернейронов (рис. 7E и рис. S14). Мы подтвердили композиционные изменения подмножества главных и GABA-эргических нейронов, которые больше влияли на верхние слои коры по сравнению с нижними слоями (рис. 7F). Эти результаты подтверждают наши предыдущие наблюдения с помощью snRNA-seq и гистологических исследований о нарушении работы нейронов верхнего слоя коры при шизофрении. Обзор наших результатов, суммирующий основные транскриптомные и композиционные изменения в DLPFC при шизофрении, представлен в таблице 1.

Table 1. The summary of major compositional and transcriptomic changes in the DLPFC of schizophrenia patients.

Мы представляем комплексное исследование, определяющее подтипы нейронов коры головного мозга, пораженные при шизофрении. Мы обнаружили дифференциальные изменения в подтипах нейронов, происходящих в основном из верхних слоев коры. Объединив все оценки подтипов нейронов, проведенные в данном исследовании, мы пришли к выводу, что подтипы GABA-эргических интернейронов и главных нейронов в верхних слоях коры обнаруживают наибольшие изменения при шизофрении и, таким образом, вероятно, вносят самый сильный вклад в фенотипические отклонения при шизофрении. Такие очаги изменений в подтипах слоев 2 и 3 могут лежать в основе человеческой природы шизофрении, поскольку верхние слои являются наиболее развитыми слоями коры головного мозга человека (38) и имеют повышенную морфологическую, транскриптомную и функциональную сложность по оси грызун - примат - человек (39, 40). Соответственно, наши данные и более ранние исследования (62) показывают, что слои 2 и 3 коры головного мозга человека характеризуются наибольшей сложностью GABA-эргических интернейронов, которые также имеют наибольшее расхождение с аналогами грызунов и обезьян.

Такой очаг связанных с шизофренией изменений в верхних слоях коры может возникнуть во время развития коры. Основные нейроны верхнего слоя коры в DLPFC начинают интенсивную дифференцировку в третьем триместре (63). В этот же период развития появляются и распространяются GABA-эргические интернейроны, предназначенные для верхних слоев коры (64). Развитие коры головного мозга человека на поздних сроках беременности характеризуется масштабным транскриптомным переходом от эмбрионального к зрелому транскриптому нейронов (65), который включает перестройку транскриптома, участвующего в дифференцировке и созревании нейронов (65, 66). Таким образом, любая дисфункция, которая может возникнуть в результате генетических отклонений или возмущения окружающей среды, может иметь длительные и серьезные последствия, которые могут проявиться на уровне кортикальной сети. Важно отметить, что нейроны верхнего слоя коры имеют очень сильно выступающие синаптические шипы (spine) в кортико-кортикальных circuitries, где окончательное удаление синапсов совпадает с появлением симптомов шизофрении (67). Таким образом, наши данные подтверждают теорию о том, что связанные с шизофренией события развития происходят в DLPFC на поздних сроках беременности из-за нарушения поступления и интеграции GABA-эргических интернейронов в кортикальную circuitry и нарушений дифференциации основных нейронов.

Наша работа также подчеркивает возможную роль до сих пор менее хорошо изученного семейства интернейронов, CR+ нейронов, в этиологии шизофрении. Наше исследование является первым, демонстрирующим "клеточный фенотип слоя 2 с низким уровнем CR" при шизофрении. Участие этого семейства интернейронов в шизофрении особенно интригует, поскольку есть данные, показывающие, что этот класс нейронов стал доминирующей GABA-эргической популяцией в префронтальной коре приматов (42). У грызунов CR+ нейроны составляют от 2 до 3% от общего пула нейронов, тогда как в префронтальной коре обезьян и человека их доля может достигать 15% от общего числа нейронов. Тот факт, что только в 50% случаев шизофрении наблюдается такой низкий уровень CR, позволяет предположить, что при разных типах и стадиях шизофрении существуют различные клеточные и молекулярные фенотипы. Высокая меж-индивидуальная вариабельность экспрессии генов, обнаруженная у пациентов с шизофренией в нашем исследовании, также подтверждает гетерогенность шизофрении, присутствующую на транскриптомном уровне.

В исследовании snRNA-seq другого психиатрического расстройства - расстройства аутистического спектра - сообщалось, что нейроны верхнего слоя коры головного мозга были наиболее поражены (68). Наш анализ генетической интеграции также показал усиление экспрессии генов, связанных с расстройством аутистического спектра, в DEGs подтипов нейронов верхнего слоя, в частности GABA-эргических интернейронов. Таким образом, сходство влияния шизофрении и аутизма на верхние слои коры может указывать на особую уязвимость нейронных цепей верхнего слоя при психических расстройствах.

Наша работа также показывает, что изменения, связанные с шизофренией, не затрагивают только отдельные семейства нейронов, а вовлекают множество подтипов нейронов, что свидетельствует об общем нарушении circuitry. Это широкомасштабное воздействие проявляется в оркестрованном понижении регуляции энергетического метаболизма и повышении регуляции генов нейропередачи в нескольких подтипах основных нейронов и GABA-эргических интернейронов, охватывающих в основном верхние слои коры с вовлечением FEZF2 основных нейронов из нижних слоев. Подобные изменения были ранее отмечены в связи с психическими расстройствами на основе генетических и объемных транскриптомных исследований (5, 65, 69). Эти общие нарушения при шизофрении могут возникать из-за дисрегуляции экспрессии транскрипционных факторов, влияющих на многие подтипы нейронов, и мы определили потенциальные регулоны, которые могут способствовать такой дисрегуляции.

Наше исследование также указывает на проблемы в текущих и перспективных методах лечения шизофрении. Мы показали, что вместо нескольких отдельных подтипов нейронов или генов изменения, связанные с шизофренией, включают сложную схему с несколькими подтипами нейронов и внутриклеточными сигнальными сетями. Таким образом, терапия, направленная на один конкретный белок или подтип клеток, может оказаться неэффективной. Мы также показали, что при шизофрении снижается экспрессия ряда транскрипционных факторов. Регулоны, связанные с этими транскрипционными факторами, могут лежать в основе фенотипа при шизофрении, который может быть установлен во время развития мозга и созревания circuitry. Будущие стратегии по выявлению ранее неизвестных мишеней для лечения шизофрении могут быть направлены на выявление центральных узлов в транскриптомных сетях в общей цепи, связанной с шизофренией, и разработку способов специфического воздействия на эти узлы во время созревания circuitry.

В ходе нашего анализа мы наблюдали преобладающее нарушение подтипов нейронов, живущих в верхних слоях коры, что включает подтипы GABA-эргических нейронов из всех четырех семейств - PVALB, SST, VIP и ID2 - и подтипы главных нейронов L2_3_CUX2; кроме того, несколько подтипов главных нейронов L4_6_FEZF2 (большинство из них-L4_5_FEZF2_LRRK1) показали значительные композиционные и транскриптомные изменения. Известно, что верхние слои получают информацию из других корковых и подкорковых областей (70) и являются критическими для человеческого познания (71), в то время как нейроны нижнего слоя передают информацию, проецируемую в другие области мозга. В целом, circuits головного мозга, ассоциированные с шизофренией, могут включать большую совокупность нейронных схем (circuitry), посылающих информацию в кору, где она принимается, преобразуется и передается в другие корковые и подкорковые области. Исследования связи, безусловно, показывают центральное положение префронтальной коры в схеме, связанной с шизофренией, демонстрируя нарушение связи между префронтальной корой и, например, миндалиной (72) и стриатумом (73, 74). Таким образом, сеть нейронов верхнего слоя в префронтальной коре может быть центральным игроком, который лежит в основе нарушения передачи информации при шизофрении. Хотя о вовлечении GABA-эргических и главных нейронов коры в шизофрению известно уже несколько десятилетий, наша работа выявила конкретные субпопуляции GABA-эргических и главных нейронов верхнего слоя коры, в которых наблюдаются наиболее выраженные транскриптомные изменения. DE, описываемое при специфичном для подтипов разрешении (resolution), предоставляет мишени в случае рецепторной сигнализации, метаболических и других путей для будущих механистических подходов, которые будут направлены на раскрытие механизмов развития шизофрении. Наконец, поскольку текущие наборы данных для одиночных клеток для изучения человеческих расстройств относительно малы (из-за нехватки качественного материала, необходимого для snRNA-seq, отсутствия подробной истории болезни, высокой стоимости и т.д.), некоторые изменения в численности типов клеток и в транскриптомике могут быть обусловлены биологическими ковариатами, такими как прием лекарств, сопутствующие заболевания, образ жизни и факторы окружающей среды. Таким образом, для получения более точных ответов о влиянии каждой биологической ковариаты на численность клеточных типов и транскриптомику следует проводить будущие исследования с использованием более крупных наборов образцов с обширной информацией об истории болезни, стратифицированных на основе известных ковариат.

Table 2. Summary for software and tools implemented in the study.