Ранее мы сообщали, что транскрипты Numb и Nbl экспрессируются в слое RGC сетчатки взрослой мыши (32). Поскольку слой RGC также содержит перемещенные амакриновые клетки и астроциты, мы сначала попытались более точно определить, действительно ли белки Numb и Nbl экспрессируются в RGCs, окрашивая срезы взрослой сетчатки на Brn3b, общий маркер RGC, вместе с антителом, распознающим Numb и Nbl (рис. S1, A - C) (33). Как и ожидалось, Numb/Nbl были обнаружены в RGCs, включая их аксоны и дендриты, хотя самый сильный сигнал наблюдался в теле (рис. S1, D и E).

Чтобы раскрыть потенциальную роль Numb/Nbl в RGCs, мы скрестили мышей линии с драйвером Islet1-Cre (34) с мышами линии Numb-floxed, в которой экзон 1 гена Numb фланкирован сайтами loxP (35). Поскольку известно, что Nbl компенсирует потерю Numb в различных контекстах (36), мы сгенерировали условно нокаутированную линию мышей Numb на нулевом фоне Nbl (37), что позволило нам изучить специфическую роль Numb в RGCs (рис. S1F). Для оценки активности Cre мы дополнительно ввели репортерный аллель Rosa26-loxP-STOP-loxP-tdTomato (tdT). Как и ожидалось, экспрессия tdT наблюдалась в клетках сетчатки, экспрессирующих Islet1, таких как RGCs, начиная с эмбрионального дня 14,5, а также в биполярных клетках и подмножестве амакринных клеток (рис. S1, G - L) (38). В данном исследовании животные Islet1^Cre/+; Numb^fl/fl; Numbl^del/del будут называться условными двойными нокаутами (cDKOs), Islet1^Cre/+; Numb^fl/+; Numbl^del/del будут называться Numb^+/-;Nbl KO и Islet1^+/+, а Numb^fl/fl; Numbl^del/del будут называться Nbl KO. Как и ожидалось, мы обнаружили потерю сигнала иммуно-окрашивания Numb в RGCs cDKO по сравнению с Numb^+/-; Nbl KO (рис. S1, M - P). Поскольку Nbl является нулевым в обоих условиях, мы заключили, что сигнал иммуно-окрашивания, наблюдаемый в RGCs, специфичен для Numb. Мы также провели полимеразную цепную реакцию (ПЦР) на геномной ДНК взрослой сетчатки дикого типа (WT), Numb^+/-; Nbl KO, Nbl KO и cDKO (рис. S1, Q - T). Вырезание не было полным, но это было ожидаемо, поскольку большая часть клеток, экспрессирующих Numb в сетчатке, не несут драйвера Islet-Cre. Эти результаты подтверждают создание линии мышей, позволяющей инактивировать Numb в RGCs с помощью Cre.

Для изучения роли Numb в выживании нейронов мы сначала проанализировали срезы сетчатки 5- и 20-месячных cDKO по сравнению с Numb^+/-;Nbl KO и Nbl KO контролем (рис. S2, A - K). В 5 месяцев окрашивание на маркер RGCs Brn3b, маркер амакриновых клеток Pax6 или маркер биполярных клеток Chx10 не выявило значительных изменений в количестве этих типов клеток в сетчатках cDKO по сравнению с контролем (рис. S2, I - K). Однако у 20-месячных мышей мы наблюдали трехкратное уменьшение числа RGCs в сетчатке cDKO (рис. S2, L, M, R, S и V), тогда как число амакринных и биполярных клеток не изменилось (рис. S2, N - Q, T и U). Поскольку Nbl является нулевым во всех исследованных условиях, эти результаты показывают, что Numb необходим для долгосрочного выживания RGCs , но не нужен для выживания биполярных и амакринных клеток. Чтобы подтвердить этот вывод и определить временной ход потери RGCs , мы приготовили плоскостные срезы сетчатки 5-, 8- и 20-месячных мышей и подсчитали количество Brn3b+ RGCs (рис. 1M). В 5 месяцев общее количество RGCs было одинаковым у всех исследованных генотипов и существенно не отличалось от мышей WT, что соответствует нашим наблюдениям на срезах сетчатки (рис. 1, A-D и M, а также рис. S2K). Однако, начиная с 8-месячного возраста, мы наблюдали значительное снижение числа RGC у животных cDKO (рис. 1, E-H и M), которое прогрессировало до потери около 50% RGC в 20 месяцев (рис. 1, I-L и M). Количество RGCs у мышей с нокаутом Nbl не отличалось от такового у животных WT в любом возрасте, что указывает на то, что инактивация Nbl сама по себе не влияет на выживаемость RGCs (рис. 1M). Хотя в предыдущем исследовании сообщалось, что с возрастом у мышей WT происходит нормальная потеря RGCs (39), в более поздней работе сообщалось об отсутствии разницы в количестве RGCs с возрастом (40), что согласуется с нашими данными. Причина этих разных результатов остается неясной. Вместе взятые, эти результаты показывают, что Numb необходим для поддержания долгосрочного выживания RGCs .



Fig. 1. Numb is essential for long-term survival of RGCs.

(A to L) Single-plane confocal images of retinal flat mounts stained for Brn3b from 5- (A to D), 8- (E to H), and 20-month-old (I to L) WT, Nbl KO, Numb^+/-; Nbl KO, and cDKO mice, as indicated. Images were taken in the ganglion cell layer (GCL). Scale bar, 30 µm. (M) Quantification of the number of Brn3b+ RGC per mm² in WT, controls, and cDKO mice at 5, 8, and 20 months old. Means ± SEM,n = 5 animals per genotype per time point. *P = 0.05 and **P = 0.01, two-way ANOVA followed by Turkey's test. n.s., not significant.

Наши результаты показывают, что Numb негативно регулирует внутриклеточный уровень Tau тем самым предотвращая токсическое накопление олигомеров Tau и нейродегенерацию. Мы также продемонстрировали, что экспрессия длинной изоформы Numb в нейронах двух различных мышиных моделей тауопатии предотвращает нейродегенерацию и улучшает функцию нейронов, открывая путь к разработке беспрецедентных терапевтических подходов для лечения тауопатий.

Роль Numb и Nbl была широко изучена в развивающейся нервной системе, где они контролируют решения о судьбе клеток-предшественников в неокортексе (36, 70), сетчатке (32, 33, 71, 72) и спинном мозге (19). В отличие от этого, их роль в зрелых нейронах не так хорошо установлена. Хотя инактивация Numb/Nbl нарушает арборизацию (ветвление) аксонов в сенсорных нейронах (19), аксональный рост нейронов гиппокампа (20) и ориентацию комиссуральных нейронов в нервной трубке (21), в этих исследованиях не сообщалось об увеличении гибели клеток нейронов, что контрастирует с настоящим исследованием. Предыдущие исследования не оценивали потерю нервных клеток у пожилых животных, в то время как наши данные показывают, что значительная потеря нейронных клеток не обнаруживается в сетчатке до 8 месяцев у Numb/Nbl cDKO. Аналогично, мы ранее сообщали, что инактивация Numb/Nbl в фоторецепторах палочек мыши приводит к поздней дегенерации (32). В спинальных моторных нейронах, однако, мы обнаружили, что инактивация как Numb, так и Nbl не влияет на выживаемость даже у двухлетних животных, что свидетельствует о специфических функциях клеток в нормальных физиологических условиях. В патологических условиях, например, у мышей TauP301S, инактивация Numb/Nbl ускоряет дегенерацию как двигательных нейронов, так и RGCs , что предполагает нарушение важнейшей способствующей выживанию роли при патологическом повышении уровня тау. Потеря Numb/Nbl также ускоряет время наступления двигательного дефицита, наблюдаемого у мышей TauP301S, что согласуется с наблюдаемой потерей моторных нейронов. Поскольку позднее начало неврологических фенотипов часто упоминается как ограничение для использования мышей TauP301S в качестве моделей заболеваний, наши результаты показывают, что мыши Numb/Nbl cDKO; TauP301S могут представлять собой более удобную модель для некоторых исследований.

Наши результаты показывают, что Numb может компенсировать потерю Nbl в RGCs, поскольку одной инактивации Nbl недостаточно для гибели RGCs даже у старых мышей. И наоборот, остается неизвестным, может ли Nbl компенсировать потерю Numb, поскольку все генетические эксперименты на мышах, о которых здесь сообщается, для простоты проводились на фоне нокаута Nbl. Однако в некоторых других контекстах наблюдалось взаимное функциональное дублирование Numb и Nbl (36, 73), в том числе в сетчатке, где было обнаружено, что Nbl компенсирует потерю Numb в выживании фоторецепторов (32). На основании этих наблюдений мы предполагаем, что Nbl также может компенсировать потерю Numb в RGCs , но для окончательного решения этого вопроса потребуются дальнейшие исследования.

До гибели клеток нейронов первым признаком дегенерации, обнаруженным в нейронах cDKO, является появление пузырьков (blebbing) на аксонах, как in vivo, так и в культуре, это наблюдается в различных моделях нейродегенерации (41, 42). Поскольку инактивация Numb в RGCs приводит к повышению уровня мономеров и олигомеров Tau мы предполагаем, что это повышение Tau нарушает аксональный транспорт, что в конечном итоге приводит к гибели клеток (рис. 9A), это согласуется с предыдущими результатами, показывающими роль Tau в аксональном транспорте (74, 75). Наши данные о том, что избыточная экспрессия Tau в RGCs WT вызывает blebbing, в сочетании с результатами, показывающими, что нокаут Tau в RGCs cDKO спасает NMDA-опосредованную гибель клеток, также поддерживают модель, в которой повышение Tau в RGCs cDKO является причиной аксонального blebbing и гибели клеток нейронов.



Fig. 9. Model.

(A) In healthy neurons (left), Numb/Nbl function to maintain Tau homeostasis and promote neuronal survival. In the absence of Numb/Nbl (cDKO, right), intracellular Tau levels rise, leading to formation of Tau oligomers and axonal blebs, followed by cell death. (B) In tauopathy neurons, Tau oligomerizes, which leads to axonal blebbing and neurodegeneration (left). Upon expression of Numb-72 in tauopathy neurons, however, the native form of Tau is released in the extracellular space, leading to reduced oligomeric Tau, fewer axonal blebs, and rescued neuronal survival (right). Created with BioRender.com.

Олигомеры Tau являются предшественниками нейрофибриллярных клубков и, как полагают, играют решающую роль в возникновении и распространении тауопатий (6, 76, 77). Наши данные показывают, что потеря Numb приводит к накоплению как мономерных, так и олигомерных форм Tau в зрительном нерве, что указывает на решающую роль Numb в регуляции уровней Tau внутри нейронов. Хотя выяснение точных молекулярных механизмов, с помощью которых Numb контролирует уровни Tau, потребует дальнейших исследований, наши результаты показывают, что вариает Numb-72 способствует высвобождению нативных мономеров Tau во внеклеточное пространство. Несколько исследований показали, что Tau не только является белком нейронов, но и может высвобождаться во внеклеточное пространство через экзосомы и эктосомы (63, 64). Хотя сообщалось, что высвобождение олигомеров Tau способствует распространению патологии, физиологически Tau также может секретироваться нейронами через экзосомы (78, 79), что, как полагают, служит механизмом клиренса для предотвращения накопления патологического Tau (64). Недавно было показано, что транскрипционный фактор EB (TFEB), ключевой регулятор лизосомного биогенеза, необходим для экзоцитоза определенных видов Tau (80). Инактивация TFEB снижает уровень Tau в интерстициальной жидкости у мышей TauP301S и повышает внутриклеточный уровень Tau, это приводит к усилению патологии и распространению. Способствуя высвобождению мономерного Tau во внеклеточное пространство, мы предполагаем, что экспрессия Numb-72 уменьшает пул Tau доступный в клетке для образования олигомеров, способствуя предотвращению гибели клеток при тауопатиях (рис. 9B). В соответствии с этой идеей, экспрессия Numb-72 в RGCs TauP301S, которые имеют повышенный уровень олигомеров из-за гиперфосфорилирования Tau, достаточна для уменьшения числа пузырьков в аксонах в культуре и полного спасения выживания in vivo до того же уровня, что и в RGCs WT. Экспрессия Numb-72 также уменьшает количество пятен и потерю нервных клеток в мышиной модели болезни Альцгеймера 3xTg, хотя и в меньшей степени. Это наблюдение не является неожиданным, учитывая, что у мыши 3xTg также экспрессируются мутированные версии APP и Presenilin. Однако, поскольку Numb взаимодействует с цитоплазматическим хвостом APP, а экспрессия изоформ Numb, содержащих вставку PTB (Numb-72 и Numb-66), снижает уровень APP в клеточной линии SH-SY5Y (22, 81), эти результаты позволяют предположить, что экспрессия Numb-72 у мышей 3xTg может иметь двойной эффект, снижая уровни как Tau, так и APP.

Поскольку известно, что накопление Tau нарушает передачу по аксонам(45), можно предположить, что снижение внутриклеточного уровня Tau не только способствует выживанию, но и улучшает транспорт везикул в аксонах и повышает функцию нейронов. Наши результаты соответствуют этой идее, поскольку мы обнаружили, что Numb-72 увеличивает электрическую реакцию в нейронах TauP301S в культуре и улучшает зрительные способности мышей с мутантом TauP301S in vivo. Таким образом, оказывается, что снижение уровня Tau с помощью Numb-72 имеет множество полезных эффектов, от поддержания выживаемости до улучшения функции нейронов. Хотя мы не можем исключить, что экспрессия Numb-72 в нейронах может вызвать нежелательные побочные эффекты, мы не наблюдали никаких признаков токсичности ни в нейронах WT, ни в нейронах мутантов. Тем не менее, в будущем будет интересно провести структурно-функциональные эксперименты для определения минимальной последовательности Numb-72, необходимой для снижения уровня Tau поскольку это может помочь создать синтетический пептид, который будет более пригоден для клинического применения. Учитывая, что единственное различие между Numb-72 и другими изоформами Numb заключается во вставках последовательностей в доменах PRR и PTB, вполне вероятно, что эти области вовлечены в процесс. Будущая работа также поможет определить, может ли экспрессия Numb-72 снизить уровень Tau и предотвратить дегенерацию различных типов нейронов головного мозга, но наши данные о том, что инактивация Numb ускоряет дегенерацию нейронов как в сетчатке, так и в спинном мозге в мышиных моделях тауопатии, свидетельствуют о широком распространении способствующей выживанию активности в ЦНС.