Наш геном хранится в виде хроматина, плотно обернутого вокруг белков гистонов. Такое уплотнение необходимо для того, чтобы поместиться в ядре клетки. В связи с этим возникает необходимость в системе, обеспечивающей доступность генома для экспрессии генов [1]. Для этого эпигенетическая регуляция оставляет след из меток, которые способствуют как структурной упаковке, так и разворачиванию генома. Гистоны представляют собой в основном глобулярные структуры, организованные в октамерные нуклеосомы (четыре димера, определяемые парами гистонов H3-H4 и H2A-H2B), с неструктурированными хвостами [2]. Знаки модификации гистонов на хвостах могут принимать различные формы, среди которых наиболее распространены метилирование по лизинам или аргининам и ацетилирование, регулирующие экспрессию генов [3]. Метилирование отличается своей специфичностью - лизин-специфические метилтрансферазы (KMTs) нацелены на один лизин (K) на одном гистоне (H) - и гибкостью: метки метилирования могут как активировать, так и репрессировать транскрипцию, что делает его одним из основных механизмов регуляции хроматина, влияющих на фундаментальные ядерные процессы [4].

Метилирование остатков лизина на N-концевых хвостах гистона H3 и лизина на N-конце H4 регулирует основные функциональные процессы генома [5]. Проще говоря, три сайта метилирования лизина участвуют в транскрипционной активации: H3K4, H3K36 и H3K79 (H3K4 и H3K36 связаны с инициацией и элонгацией транскрипции, соответственно); три других сайта связаны с репрессией транскрипции: H3K9, H3K27 и H4K20 [6]. Каждый остаток лизина может принимать до трех метильных групп с образованием моно-, ди- и триметилированных производных (Kme1, Kme2 и Kme3, соответственно) (рис. 1). Дальнейшая настройка регуляции достигается за счет баланса активности КМТ и лизиновых деметилаз (KDMs) (рис. 1). В результате эпигенетический регуляторный ландшафт превращается из статичного в динамичный. Различные участки метилирования могут действовать совместно, "выравнивая" гены, что обеспечивает их быструю активацию при переходе на новую линию развития. Эти промоторы с двойным метилированием, т.е. бивалентные, несут метки как активации, так и репрессии, так что дефинитивные типы клеток несут метки либо в поддержку транскрипционно активного, либо в поддержку "молчащего" состояния, тем самым поддерживая решения о клеточной судьбе [7]. Более пятидесяти белков, закодированных в геноме человека, являются известными или предсказанными KMT (KMT с каталитическим SET-доменом) [8]; каждый из них нацелен на определенный гистон-лизин (H_K_) и катализирует любую или комбинацию me1, me2 или me3 [5]. Кроме того, у человека описано более тридцати гистоновых деметилаз (KDM), которые в целом можно разделить на лизин-специфические деметилазы (LSD, включающие девять подсемейств KDM) и гистоновые деметилазы Jumonji C (JmjC) [9,10]. Некоторые метки метилирования преимущественно обогащены на промоторах регуляторных генов, контролирующих различные пути развития. Окружающая позиционная последовательность, расстояние между ними и комбинация меток метилирования создают контекст, который связывает метилированные участки с последующими биологическими функциями, опосредованными метил-лизин-связывающими белками [2].



Figure 1. Dynamics of histone lysine methylation and demethylation. The methylation marks regulate structural unwinding and packing of the genome, which facilitates and represses gene expression, respectively. Methylases and demethylases combined offer a dynamic regulatory system that can respond to endogenous and environmental changes. The enzymes catalyze addition and removal of methylation marks, either stepwise (single) or multiple marks at once. K, lysine; me, methyl group (CH3).

В процессе развития происходят огромные транскрипционные сдвиги. Метилирование играет важнейшую роль в управлении этими переходами. С этим согласуются данные о том, что при старении и нарушениях развития человека, а также при онкологических заболеваниях обнаруживаются метки дерегуляции метилирования [5,11-13]. Аналогичным образом было показано, что метилирование лизина в гистонах играет важную роль в развитии сердца, а его дерегуляция связана с сердечными заболеваниями [14-16]. Аналогичным образом, KDMs демонстрируют преимущественную экспрессию на плодном и взрослом этапах развития сердца [16]. Исследования на животных моделях показали их важность для развития сердца [17-20], а некоторые KDMs продемонстрировали дифференциальную экспрессию в сердце пациентов с сердечной недостаточностью [21-23]. Более того, делеционные мутации de novo в KDM5A и KDM5B оказались связаны с врожденными пороками сердца [24,25].

Недавно Davies et al. написали обширный обзор по деметилазам в сердце [16]. Учитывая растущее число генетических ассоциаций между КМТ и заболеваниями сердца в последнее десятилетие, в настоящем обзоре мы приводим имеющиеся на сегодняшний день данные, как на пациентах (исследования генетических ассоциаций), так и на моделях in vitro и in vivo (включая животных), подтверждающие роль КМТ в развитии и/или заболеваниях сердца (рис. 2). В заключение мы описали дальнейшие шаги по продвижению этой области и то, как более глубокое понимание эпигенетического вклада может открыть новые пути для лечения, что в конечном итоге принесет пользу пациентам.



Figure 2. Histone lysine-specific methyltransferases (KMTs) and their targets. Each grey ball represents a globular histone (H), together organized into a nucleosome (an octamer consisting of two identical subunits of the core histones H4, H3, H2A, and H2B). The black line represents the unstructured N-terminal ends of the H4 an H3 histones that contain the lysine (K) methylation sites. Red font, KMT with sufficient evidence to support a regulatory role during heart development and/or disease (defined by supporting data from multiple model systems, which can be strengthened by disease association); yellow font, limited suggestive evidence (defined by supporting data from a single model system); and black font, currently no data to indicate involvement. Details have been described in this review.

Лизин-метилтрансферазы с доменом SET являются активными КМТ, и их домен SET катализирует метилирование специфических лизиновых меток как на гистоновых, так и на не-гистоновых субстратах [4]. Впервые домен был обнаружен у дрозофилы, где три белка имели общую последовательность SET: модификатор позиционно-эффективной изменчивости Suppressor of variegation 3-9 [Su(var)3-9], регулятор хроматина группы polycomb Enhancer of zeste [E(z)] и регулятор хроматина группы trithorax Trithorax (Trx) [4,26]. Белки, несущие варианты примерно 130-аминокислотного домена SET, идентифицированы в геномах всех эукариотических организмов, секвенированных к настоящему времени, а также во многих бактериальных геномах [26-28].

Ниже КМТ сгруппированы по меткам в гистонах лизина (H_K_), в отношении которых они проявляют основную активность. Для каждой метилтрансферазы приведены имеющиеся данные исследований генетических ассоциаций у пациентов, которые связывают варианты этой КМТ с сердечно-сосудистыми заболеваниями (табл. 1), а также данные о ее роли в развитии сердца, включая данные исследований на клеточных и животных моделях (рис. 2).

KMT2A (HUGO Gene Nomenclature Committee, HGNC, псевдонимы: MLL1, MLL1A, TRX1) - это гистон-лизиновая метилтрансфераза, принадлежащая к семейству SET1, члены которого имеют SET-домен, отвечающий за их гистон-метилтрансферазную активность. Мутации в KMT2A вызывают синдром Wiedemann-Steiner (WSS; OMIM #605130) - редкое врожденное заболевание, характеризующееся избыточным ростом волос, малым ростом и характерными чертами лица [29,30]. Вначале у одной субпопуляции пациентов был ошибочно диагностирован синдром Кабуки (KS; OMIM #147920), еще один синдром множественных врожденных аномалий, обычно проявляющийся пороком сердца, который обусловлен вариантами в KMT2D [30]. С тех пор фенотипический спектр синдрома Wiedemann-Steiner был расширен и стал включать в себя врожденные пороки сердца и другие фенотипы. Так, в одном из исследований сердечные аномалии, в основном структурного характера, были выявлены у ~35% пациентов [31].

У дрозофилы подавление trx, мушиного гомолога KMT2A и KMT2B млекопитающих в сердце, приводило к отсутствию сердечного актина, свидетельствующему о полном отсутствии сердечной трубки, а также к сокращению продолжительности жизни [32]. Эти результаты, полученные на мухах, подтверждают причинную роль вариантов KMT2A для врожденных пороков сердца.

KMT2D (HGNC псевдоним: MLL4) - еще один представитель семейства SET1, который, как и KMT2A, действует как метилтрансфераза лизина гистонов. Варианты в KMT2D вызывают синдром Кабуки - редкое врожденное заболевание, характеризующееся множественными аномалиями, включая низкий рост, характерные черты лица, умственную отсталость, стойкие подушечки пальцев и скелетные аномалии. Синдром Кабуки часто проявляется врожденными пороками сердца (~70% пациентов), которые характеризуются уникальной склонностью к левосторонним обструктивным поражениям [33-35]. Дополнительные варианты в KMT2D были зарегистрированы у пациентов с различными сердечными заболеваниями, включая левосторонние поражения сердца, гетеротаксию, гипоплазию левого сердца и синдром множественных врожденных аномалий, отличный от синдрома Кабуки [36-40].

Для изучения роли и механизма действия KMT2D в развитии и заболеваниях сердца были использованы многочисленные животные модели. Исследование на мышах продемонстрировало важность KMT2D в сердечных предшественниках и кардиомиоцитах во время развития сердца [34]. Было показано, что делеция Kmt2d в миокарде приводит к снижению уровня H3K4me1 и H3K4me2 в энхансерах и промоторах, что влияет на экспрессию генов, участвующих в гомеостазе/транспорте ионов (Atp1a2, Fxyd1, Atp2b4, Snta1 и Kcnj12), в ранениях/иммунном/воспалительном ответе (Tgfb1, Ccl2 и Ccl7), в гипоксии-реоксигенации (Vegfa, Hmox1 и Gpx3) и в регуляции клеточного цикла/дифференцировка (Eid1, Smyd1, Nkx2-5, Snta1 и Prrx2) [34]. Модельные лягушки (Xenopus laevis) с нокдауном kmt2d демонстрирует гипопластическое сердце, в котором отсутствует трехкамерная структура вследствие аномального развития первого и второго сердечных полей и нарушения дифференцировки сердца [41]. Эта модель имитирует гипопластические пороки сердца, наблюдаемые у пациентов с синдромом Кабуки. Нулевые мутанты kmt2d у рыбок данио (Danio rerio) демонстрируют сложный фенотип, напоминающий основные признаки синдрома Кабуки, включая микроцефалию, дефекты нёба, аномальное развитие уха и пороки сердца [42]. Фенотип сердца был связан с дефектом васкулогенеза, влияющим на формирование эндокарда и, как следствие, на формирование просвета сердечного желудочка, а также с дефектами ангиогенеза. Далее они обнаружили гиперактивную Notch-сигнализацию в эндокардиальных и эндотелиальных клетках у kmt2d null рыбок данио, что было связано с повышением уровня белка Rbpj, фактора транскрипции Notch [42]. Эти данные побуждают к проведению клинических исследований у пациентов с синдромом Кабуки для определения консервативности роли KMT2D-Notch-сигнализации в развитии сердца. У дрозофилы гены Lpt и trr кодируют N-концевой и C-концевой гомологи KMT2C и KMT2D млекопитающих соответственно [43]. Выключение генов Lpt или trr, а также их одновременное выключение в сердце мухи приводило к сходной аномальной морфологии сердца, фиброзу тканей и функциональным дефектам сердца. Как и KMT2D, Lpt и trr модулируют гистоны H3K4me1 и H3K4me2 [43]; кроме того, у Lpt- и trr-дефицитных мух были нарушены гомологи дифференциально экспрессируемых генов в Kmtd-мишенях у мышей, включая гены, участвующие в транспорте/связывании ионов (Ca-α 1T [мышь Cacna1h], CaMKII [мышь CamK2a], Syn [мышь Snta1] и Ype [мышь Ypel5]), гипоксии (CG15116 [мышь Gpx1] и CG3156 [мышь Abcb10]), регуляции клеточного цикла (E2f1 [мышь E2f2]) и другие [43]. В целом эти исследования на животных подтверждают консервативную роль KMT2D в развитии сердца и позволяют понять молекулярно-генетические механизмы, лежащие в его основе.

KMT2C (HGNC псевдоним: MLL3) - еще одна гистон-лизин-метилтрансфераза, принадлежащая к семейству SET1. Уровни мРНК и белка KMT2C были повышены в левом желудочке сердца пациентов с дилатационной кардиомиопатией (DCM), перенесших трансплантацию сердца [44]. Эти уровни экспрессии коррелировали с тяжестью патологии, и в сердцах пациентов наблюдалось сопутствующее увеличение меток H3K4me2, но не H3K4me3 [44]. Кроме того, в сердцах с дилатационной кардиомиопатией обнаружено повышение экспрессии белков Smad3, GATA4 и EGR1. Все эти три белка являются ключевыми медиаторами гипертрофии кардиомиоцитов и сердечного фиброза, которые являются характерными признаками дилатационной кардиомиопатии [44]. В другом исследовании экзомные последовательности выявили вероятные причинные варианты de novo в KMT2C и KDM5A - гистоновых метилазах, которые сегрегационно связаны с заболеванием в семье с врожденными пороками сердца [45]. Однако прямая связь между KMT2C и развитием сердца или врожденными пороками сердца пока не доказана.

В мышиной модели ремоделирования сердца (основанной на поперечном сужении аорты) наблюдалось значительное повышение уровня мРНК KMT2C [44]. Как и у пациентов с дилатационной кардиомиопатией, у мышей наблюдалось увеличение конечного диастолического и систолического размеров левого желудочка, снижение фракционного укорочения, а также признаки отложения коллагена [44]. Эти данные свидетельствуют о консервативной роли KMT2C в патологическом механизме, лежащем в основе дилатационной кардиомиопатии. Примечательно, что в сердцах мышей, в отличие от сердец человека, уровень мРНК SETD1A был снижен, что может быть связано с индуцированной давлением, а не генетически обусловленной причинностью заболевания в этой модели [44].

SETD7 (HGNC псевдонимы: KMT7, SET7, SET7/9, Set9) - гистоновая метилтрансфераза, специфически регулирующая монометилирование H3K4 (H3K4me1) [46]. SETD7 высоко экспрессируется в развивающемся сердце рыбок данио (Danio rerio). Нокдаун setd7 (анти-смысловой морфолино) в этот период не изменил картину экспрессии маркеров сердца, однако привел к серьезным дефектам сердца рыбок данио, к выраженному отеку сердца (т.е. набуханием из-за снижения кровотока) [47]. Более того, одновременный нокдаун setd7 и smyd3, другой H3K4-метилтрансферазы, в процессе развития приводил к синергетическим дефектам сердца [47]. На кардиомиоцитах, полученных in vitro из эмбриональных стволовых клеток человека и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC), было показано, что SETD7 является ключевым регулятором приверженности к сердечной линии [48]. Это происходит за счет взаимодействия с ключевыми кофакторами на разных стадиях дифференцировки. Примечательно, что помимо метилирования H3K4me1, SETD7 опосредует экспрессию генов-мишеней через ассоциацию с модификацией H3K36me3 на этих генах-мишенях, включающих важные компоненты хроматин-ремоделирующего комплекса SWI/SNF и NKX2-5, одного из основных факторов транскрипции сердца [48]. SETD7 также необходим для процессов использования кальция в терминально дифференцированных кардиомиоцитах, в которых кальциевая сигнализация является ключевой для сокращения и, таким образом, регуляции сердечного ритма [48].

SMYD3 (HGNC псевдоним: KMT3E), белок семейства SMYD, экспрессируется повсеместно в процессе развития у рыбок данио (Danio rerio) [49,50]. Помимо синергического действия с SETD7 в процессе развития сердца [47], как недостаток (анти-смысловое морфолино), так и избыточная экспрессия smyd3 сами по себе в процессе развития рыбок данио вызывают пороки сердца [47]. Эти пороки сердца характеризуются отеком перикарда и аномальной экспрессией известных маркеров сердечной камеры cmlc2, amhc и vmhc, а также аномальной экспрессией миогенных регуляторных факторов myod и myog [50]. Эти данные подтверждают важную роль SMYD3 в развитии сердца.

SMYD1 (HGNC псевдоним: KMT3D, BOP), в отличие от повсеместно экспрессируемой SMYD3, является специфической H3K4-метилтрансферазой поперечно-полосатых мышц. Экспрессия SMYD1 (тогда она называлась BOP) была значительно повышена в эксплантированном сердце пациентов с конечной стадией сердечной недостаточности, что коррелировало со снижением экспрессии сердечных генов [51]. Позднее варианты в BOP (SMYD1) были выявлены у пациентов с диагнозом гипертрофической кардиомиопатии [52]. Однако в этих исследованиях еще не была определена молекулярно-генетическая роль SMYD1 в развитии сердца.

В одном из первых исследований, проведенных на цыплятах и мышах, было установлено, что BOP действует как гистон-деацетилаза-зависимый транскрипционный репрессор и экспрессируется в предшественниках сердечной и скелетной мышц до начала дифференцировки [53]. Более того, нокдаун BOP у мышей нарушал созревание желудочковых кардиомиоцитов и препятствовал развитию правого желудочка. Экспрессия Hand2, установленного и необходимого компонента для развития правого желудочка, зависела от BOP [53]. На рыбках данио было показано, что из двух форм SmyD1, образующихся в результате альтернативного сплайсинга, потеря smyd1b вызывает дефекты сердечной мышцы; они были более серьезными у двойных (smyd1a, smyd1b) мутантов (анти-смысловое морфолино) [54-56]. Дефекты сердца были связаны с нарушением организации саркомеров, что сопровождалось увеличением экспрессии hsp40, hsp90a1 и, возможно, unc45b [55,56]. У мышей было показано, что Smyd1 необходим для дифференцировки кардиомиоцитов и морфогенеза сердца [53]. Условный нокдаун Smyd1 в первом или втором поле сердца, в частности у мышей, продемонстрировал его важнейшую роль в поддержании пролиферации кардиомиоцитов на протяжении как минимум двух различных этапов развития эмбрионального сердца. При потере Smyd1 в сердце окислительный стресс и стресс эндоплазматического ретикулума (ER) вызывали раннюю летальность [57]. Роль Smyd1 в здоровом раннем развитии сердца опосредована его взаимодействием с ASHL2, который активирует промотор Isl1 по H3K4me3, увеличивая тем самым экспрессию Isl1. Кроме того, Smyd1 взаимодействует с HDAC через ингибитор деацетилазы TSA, что приводит к снижению экспрессии ANF [58], сердечного натрийуретического пептида и признанного маркера сердечной недостаточности.

На взрослых мышах была показана важность SMYD1 в ограничении роста сердца. В мышиной модели гипертрофии и сердечной недостаточности Smyd1 был повышен, а потеря функции приводила к клеточной гипертрофии и ремоделированию, что в конечном итоге приводило к сердечной недостаточности [59,60]. Smyd1 регулирует экспрессию генов, связанных с сердечной патологией, включая митохондриальную энергетику и энергетику сердца [59,60].

На сегодняшний день не выявлено связи с развитием сердца других метилаз H3K4, таких как KMT2B (HGNC псевдоним: MLL2, TRX2, MLL1B, MLL4), KMT2E (HGNC псевдоним: SETD5B), SETD1A, SETD1B (HGNC псевдоним: KMT2G) и PRDM9 (HGNC псевдоним: KMT8B) [61]. Примечательно, что специфическая для кардиомиоцитов делеция Smyd2 (SMYD2; HGNC alias: KMT3C) показала, что он не нужен для структурного и функционального развития сердца у мышей, и не влияет на метилирование H3K4 и H3K36 [62].

SUV39H1 (HGNC псевдоним: KMT1A) и SUV39H2 (HGNC псевдоним: KMT1B) относятся к семейству SET-домен-содержащих гистон-лизиновых метилтрансфераз и обладают сходной ферментативной активностью. Каждая из них регулирует метилирование H3K9, что приводит к репрессии транскрипции генов. Метилирование гистонов (H3K4me3, H3K9me2 и H3K9me3) было снижено в левом желудочке пациентов с диагностированной не-ишемической дилатационной кардиомиопатией в конечной стадии [63]. После вмешательства в организм путем имплантации аппарата вспомогательного кровообращения левого желудочка (LVAD) уровень метилирования восстанавливался с одновременным повышением уровня SUV39H1 [63]. В другом исследовании было обнаружено, что MCP1 (псевдоним CCL2) значительно повышается в CD14+ моноцитах пациентов с ишемической болезнью сердца. Эти поражения сердца были связаны с воспалительной реакцией. В CD14+ моноцитах пациентов в промоторной области MCP1 были снижены уровни SUV39H1, регуляторного фактора (RFX1) и деацетилазы гистонов (HDAC1) [64]. Эти исследования косвенно указывают на причастность SUV39H1 к сердечным заболеваниям.

Исследования на мышах и клеточных линиях аналогичным образом, но косвенно, указывают на роль SUV39H1 в развитии сердечных заболеваний. Kindlin-2 является важным регулятором структуры и функции сердца. Он взаимодействует с SUV39H1, способствуя привлечению этоq КМТ к промотору GATA4 для катализации метилирования H3K9me2 и H3K9me3 [65]. Установлено, что GATA4 является ключевым транскрипционным фактором в процессе кардиогенеза, и нарушение этой системы у мышей приводит к гипертрофической кардиомиопатии [65]. Исследование in vitro с использованием миобластов мыши C2C12 и эмбриональных фибробластов мыши показало важность опосредованного Suv39h1 метилирования H3K9 на промоторах генов миогенной дифференцировки. Репрессия транскрипции генов, активирующих дифференцировку мышц, снималась SETD7 (HGNC alias: SET7) [66]. Так ли это происходит in vivo и в сердечной мышце, еще предстоит выяснить.

Хотя эти исследования дают некоторые основания предполагать участие SUV39H1 в сердечных заболеваниях, в настоящее время нет данных, подтверждающих или опровергающих аналогичную роль SUV39H2.

EHMT1 (HGNC псевдоним: KMT1D) и EHMT2 (HGNC псевдоним: KMT1C, G9A) также являются членами семейства SET-домен-содержащих гистон-лизин-метилтрансфераз и обладают сходной ферментативной активностью, регулирующей метилирование H3K9 для репрессии транскрипции генов. Варианты в EHMT1, как и в KMT2C, были признаны причинно-следственными при синдроме Kleefstra [67]. Среди пациентов с синдромом Клифстра, обусловленным мутациями в EHMT1, ~40-45% имеют пороки сердца; даже при отсутствии структурных пороков сердца у таких пациентов наблюдаются сердечные аритмии [68].

Исследования in vitro и на животных моделях EHMT1 и его вариантов часто сосредоточены на нейроразвивающих аспектах синдрома Клифстра; таким образом, остается много вопросов о патогенном механизме, посредством которого EHMT1 может способствовать развитию врожденных пороков сердца. Что касается EHMT2, то нокдаун G9A (псевдоним) значительно снизил метилирование H3K9me2 в кардиомиоцитах, полученных из костных мезенхимных стволовых клеток крысы [69]. Это совпало с увеличением экспрессии нескольких транскрипционных факторов (GATA4, NKX2-5 и MEF2C), которые, как известно, играют важную роль в формировании кардиомиоцитов на ранних стадиях развития миокарда [69]. Исследование нокдауна на мышах продемонстрировало важность G9A в предотвращении гипертрофии взрослого сердца. Взаимодействие G9A с EZH2, каталитической субъединицей polycomb репрессивного комплекса 2 (PRC2), регулирует его H3K27me3 активность, а взаимодействие с MEF2C поддерживает структуру гетерохроматина, необходимую для подавления генов развития во взрослых кардиомиоцитах [70]. Специфичный для G9A ингибитор BIX01294 позволил увеличить клетки предшественники сердца мыши, не повлияв ни на их фенотип, ни на способность к дифференцировке [71]. В целом это свидетельствует о важности EHMT2 в регуляции гипертрофии кардиомиоцитов.

SETDB1 (HGNC псевдоним: KMT1E) - метилтрансфераза H3K9. Jarid2 является ключевым регулятором развития сердечно-сосудистой системы, а также многих других процессов развития. Он требует активности метилирования SETDB1 для репрессии экспрессии генов-мишеней, включая Notch1, во время развития сердца у мышей [72]. Однако, если не считать данного исследования, остается неясным, в какой степени SETDB1 участвует в развитии сердца и сердечных заболеваний.

MECOM (HGNC псевдоним: KMT8E, PRDM3) проявляет гистоновую H3K9-метилтрансферазную активность и первоначально был описан как онкогенный предполагаемый транскрипционный фактор. Целевой мутагенез, направленный на разрушение полноразмерного Evi1 (мышиный гомолог MECOM) в эмбриональных стволовых клетках мыши, показал его важность для многих процессов развития, включая развитие сердца [73]. У мышей с дефицитом Evi1 наблюдались тяжелые врожденные пороки сердца, которые приводили к перинатальной смерти [74]. Было обнаружено, что многие гены, которые ранее ассоциировались с врожденными пороками сердца, несут известный сайт связывания Evi1, и экспрессия 18 из этих генов была нарушена при нокдауне Evi1 с помощью siRNA [74]. Эти результаты позволяют предположить, что MECOM может играть центральную роль в транскрипционной регуляции в процессе развития сердца.

PRDM16 (псевдоним HGNC: KMT8F) - транскрипционный фактор, опосредующий метилирование H3K9. PRDM16 локализован в ядрах кардиомиоцитов на протяжении всего развития (у мышей и человека) и во взрослом сердце [75]. Варианты PRDM16 ассоциированы с несиндромальной некомпактной кардиомиопатией левого желудочка (LVNC), дилатационной кардиомиопатией, ассоциированной с синдромом делеции 1p36 [75,76], и детской дилатационной кардиомиопатией [77].

У рыбок данио с гаплонедостаточностью PRDM16 или человеческим усеченным мутантом наблюдалась сократительная дисфункция и частичное рассоединение кардиомиоцитов, а также нарушение пролиферативной способности кардиомиоцитов [75]. Prdm16 был незаменим для раннего развития сердца у мышей, однако его дефицит приводил к гипертрофии сердца на более поздних стадиях, неблагоприятному ремоделированию и, в конечном итоге, к сердечной недостаточности. Гипертрофические гены регулируются Prdm16, а также Ehmt1/2 [78]. Кроме того, во взрослом сердце Pdrm16 играет важнейшую роль в поддержании функции митохондрий и предотвращении метаболического стресса [78]. Сердца мышей с кардиоспецифическим условным нокаутом Pdrm16 демонстрировали нарушения сердечной проводимости и фенотипы, связанные с кардиомиопатией, включая сердечный фиброз и гипертрофию [79]. Это сопровождалось нарушением ионного гомеостаза (Ca²⁺, K⁺ и Na⁺) в ткани левого желудочка сердца [79]. Кроме того, у мышей, специфически нокаутированных по Prdm16 в кардиомиоцитах, наблюдалась LVNC, напоминающая таковую у пациентов с вариантами PRDM16 [80]. Активность транскрипционного фактора Prdm16 у этих мышей была сосредоточена в уплотненном миокарде левого желудочка, где он активировал гены компактного миокарда (Hey2 и Mb) и репрессировал гены трабекулярного миокарда (Nppa, Cited1, Nppb и Mest) и гены нейронов (Cttnbp2 и Spon1), сохраняя тем самым их транскрипционную идентичность [80].

PRDM2 (HGNC псевдоним: KMT8A) находится вблизи локуса-кандидата восприимчивости к кардиотоксичности (характеризующейся прогрессирующей систолической дисфункцией левого желудочка), вызываемой химиотерапевтическим препаратом anthracycline, что было выявлено с помощью геномной ассоциации последовательностей в человеческой когорте [81], и это дает первый намек на его возможную роль в развитии и/или заболевании сердца.

Исследований, подтверждающих роль других метилаз H3K9, таких как SETDB2 (HGNC псевдоним: KMT1F) и PRDM8 (HGNC псевдоним: KMT8D), в развитии или заболеваниях сердца, пока не проводилось.

EZH1 (HGNC псевдоним: KMT6B) и EZH2 (HGNC псевдоним: KMT6A) являются альтернативными каталитическими компонентами polycomb репрессивного комплекса 2 (PRC2), который высоко консервативен от дрозофилы до приматов [82]. На него возложена задача моно-, ди- и триметилирования H3K27 (H3K27me1/2/3), что обеспечивает репрессию транскрипции генов в процессе развития, дифференцировки и судьбы клеток [82].

Регуляция EZH2 описана при различных заболеваниях сердца, в том числе в тканях сердца пациентов с дилатационной кардиомиопатией в конечной стадии [83], в мышце предсердия и фибробластах предсердий пациентов с фибрилляцией предсердий (выраженный фиброз предсердий и дифференцировка фибробластов предсердий) [84], а также в сыворотке крови пациентов с ишемической болезнью сердца [85]. Как EZH2, так и H3K27me3 были увеличены в тканях сердца пациентов с ишемической болезнью сердца [86].

Каталитические домены EZH1 и EZH2 в PRC2 демонстрируют частичную функциональную избыточность. Однако все больше данных свидетельствует о функциональной специализации, при которой EZH1 доминирует в процессе регенерации сердца, а EZH2 - в процессе его развития. Действительно, нокдаун Ezh1 сам по себе не влияет на развитие и функцию сердца [87]. Однако Ezh1, но не Ezh2, был необходим для регенерации после инфаркта миокарда, т.е. травмы, у мышей. Состав PRC2 для каждого из них различен: если Ezh1 взаимодействует с компонентом супрессора Zeste 12 (Suz12) [87], то Ezh2 предпочитает компонент эмбрионального развития эктодермы (Eed) [88]. Полученные данные свидетельствуют о том, что для развития и регенерации сердца требуется различный эпигенетический ответ [87]. Это отражается и на профилях экспрессии их генов: Показано, что Ezh1 повышает регуляцию генов, связанных с ростом сердечной мышцы у мышей [87], тогда как Ezh2 подавляет мезенхимные и нейрональные генные программы в кардиомиоцитах мыши [88]. Кроме того, нокдаун Ezh2 в сердце мышей приводил к снижению пролиферации кардиомиоцитов, усилению апоптоза и дисрегуляции перехода эндотелия в мезенхиму. Это сопровождалось различными пороками развития сердечно-сосудистой системы, такими как гипопластические эндокардиальные подушки, которые приводили к перинатальной смертности и были связаны с нижележащей мишенью Hey2 [89]. Hey2 играет ключевую роль в развитии сердца [90,91], а генетические варианты ассоциированы с врожденными пороками сердца [92]. Условный нокаут Ezh2 в кардиомиоцитах привел к остановке неонатальной регенерации сердца мыши из-за замедления пролиферации кардиомиоцитов и модификации H3K27me3. Это было связано с передачей сигналов PDGFR-β [93]. Как и у пациентов, в мышиных моделях фиброза предсердий наблюдалось увеличение EZH2, а фармакологическое (GSK126, селективный ингибитор EZH2) и молекулярное ингибирование EZH2 ослабляло сердечный аномальный фенотип. В основе этого патологического механизма лежит EZH2-опосредованная Smad-сигнализация, способствующая дифференцировке фибробластов [84]. Нарушение взаимодействия EZH2 со Smad также связано с фиброзом сердца. Длинная не-кодирующая РНК NEAT1 повышена у пациентов с сердечной недостаточностью. На мышиной модели было показано, что это приводит к усиленному набору Ezh2 в промоторную область Smad7, что подавляет его экспрессию и способствует развитию фиброза сердца [94]. В ткани сердца мышей, перенесших инфаркт миокарда, как и в ткани пациентов с ишемической болезнью сердца, обнаружено увеличение EZH2 и H3K27me3, а также снижение экспрессии Na⁺-каналов (Nav1.5) [86]. Опять же, как фармакологическое (GSK126), так и молекулярное ингибирование EZH2 ослабляло аномальный фенотип сердца [86]. У мышей с Ezh2-дефицитными сердечными предшественниками наблюдалась постнатальная патология миокарда и нарушение экспрессии сердечных генов, в том числе повышение уровня Six1, что вызывало гипертрофию кардиомиоцитов и увеличивало экспрессию генов скелетных мышц [95]. В совокупности эти исследования на животных моделях, как и исследования на пациентах, демонстрируют разнообразие кардиологических заболеваний, в которых EZH2 играет определенную роль. Учитывая частичную функциональную избыточность EZH1 и EZH2, необходимо провести дополнительные исследования роли EZH1 в этих моделях кардиологических заболеваний, особенно в качестве потенциальной терапевтической мишени для обеспечения защиты после повреждения сердца [87].

ASH1L (псевдоним KMT2H) - это гистон-лизиновая метилтрансфераза со специфической для H3K36 (H3K36me1 и -me2) активностью, которая противодействует polycomb замалчиванию (silencing), выступая в качестве активатора транскрипции [96-98]. Генетические варианты ASH1L ассоциированы с врожденными пороками сердца [25,99,100].

Предварительные данные, полученные на Drosophila подтверждают, что Ash1 (мушиный гомолог ASH1L) играет роль в развитии сердца (manuscript in preparation).

SETD2 (псевдоним HGNC: HIF-1, KMT3A) является H3K36me3 гистон-лизиновой N-метилтрансферазой [101]. Setd2 высоко экспрессируется на всех эмбриональных стадиях у мышей и в значительной степени отвечает за H3K36me3 в сердце мыши. Действительно, сердечные предшественники, дефицитные по Setd2, демонстрировали заметные дефекты коронарных сосудов и некомпактность желудочков, что приводило к летальности плода в середине беременности у мышей [102]. У этих мышей наблюдалось значительное снижение уровня H3K36me3, что ассоциировалось с дисрегуляцией экспрессии ключевых кардиогенов, включая Rspo3 и Flrt2 [102]. Полученные данные подтверждают роль SETD2 в развитии сердечно-сосудистой системы и, как следствие, в развитии заболеваний.

NSD1 (HGNC псевдоним: KMT3B) и NSD2 (HGNC псевдоним: KMT3G; MMSET) проявляют активность H3K36me1 и H3K36me2 [103-106]. Мутации в NSD1 были идентифицированы как генетическая причина синдрома Sotos, который характеризуется пре- и постнатальным избыточным ростом, выраженными черепно-лицевыми чертами, поздним костным возрастом и задержкой развития. Кроме того, у части пациентов наблюдаются врожденные пороки сердца [107-109]. Вариант de novo в NSD1 был связан с дефектом атриовентрикулярной перегородки - специфическим пороком сердца, который проявляется как врожденный порок сердца [110]; кроме того, генетические варианты NSD1 были связаны с врожденными пороками сердца [25,99]. NSD2 (предыдущее обозначение HGNC: WHSC1) находится в критической делеционной области синдрома Wolf-Hirschhorn (WHS; OMIM #194190) - заболевания нейрального развития, характеризующегося лицевой дисморфией и задержкой роста, у части пациентов которого наблюдаются врожденные пороки сердца [111]. Наконец, варианты в NSD2 ассоциированы с врожденными пороками сердца [100], причем как потеря функции (LoF), так и усиление функции (GoF) в NSD2 ассоциированы с аномальной морфологией сердца, связанной с нарушением формирования сердечного паттерна [100,112].

Молекулярный механизм участия NSD1 в развитии сердца неизвестен. У мышей, дефицитных по Nsd2, наблюдалась задержка роста, дефекты средней линии и соответствующие врожденные пороки сердечно-сосудистой системы, напоминающие синдром Wolf-Hirschhorn [113]. Nsd2 генетически взаимодействует с транскрипционным фактором Nkx2-5, что приводит к нарушению экспрессии генов в развивающихся эмбриональных сердцах мышей [113]. Кроме того, в мышиной модели гипертрофии сердца с одновременным условным нокдауном Nsd2 в миокарде наблюдался более мягкий фенотип ремоделирования желудочков и улучшение сердечной функции, что объяснялось снижением уровня H3K36me2 [114], это свидетельствует о роли NSD2 в ремоделировании желудочков.

Роль метилирования H3K36 в процессе развития сердца, опосредованного NSD3 (псевдоним HGNC: KMT3F), остается невыясненной.

Помимо перечисленных выше типов метилирования, в процессе развития сердца могут играть роль специфические лизин-метилазы H3K79 и H4K20.

DOT1L (HGNC псевдоним: KMT4) катализирует метилирование по H3K79. Экспрессия DOT1L снижена в образцах миокарда пациентов с идиопатической дилатационной кардиомиопатией [115].

Кардиоспецифический нокдаун Dot1L у мышей приводил к расширению камер, увеличению гибели клеток кардиомиоцитов, систолической дисфункции и нарушениям проводимости, а также к увеличению смертности. Этот фенотип напоминает таковой у пациентов с дилатационной кардиомиопатией [115]. В кардиомиоцитах мыши Dot1L действует через регуляцию транскрипции Dystrophin (Dmd), что влияет на стабильность Dmd-гликопротеинового комплекса, необходимого для жизнеспособности кардиомиоцитов [115]. Кроме того, на моделях мышиных кардиомиоцитов in vitro и in vivo было показано, что Dot1L управляет переходным паттерном H3K79me2, необходимым для кардиомиогенеза [116].

PRDM6 (HGNC псевдоним: KMT8C) участвует в метилировании H4K20. Генетический вариант PRDM6 ассоциирован с продолжительностью QRS (мера времени проведения от атриовентрикулярного узла к системе His-Purkinje и миокарду желудочков). Изменения интервала QRS связаны с прогрессированием заболевания при нескольких кардиологических этиологиях, а также с внезапной смертью [117].

У эмбрионов мыши Prdm6 экспрессируется в тканях, обогащенных клетками-предшественниками сосудов, включая сердце, а также в эмбриональных и взрослых линиях эндотелиальных клеток [118]. Избыточная экспрессия Prdm6 индуцирует апоптоз и ингибирует пролиферацию эндотелиальных клеток [118], что косвенно указывает на его роль в развитии сердца.

Специфический нокдаун Prdm6 в клетках нейронального гребня сердца мыши продемонстрировал его важность для эмбрионального развития сердца, поскольку сердца мышей с дефицитом Prdm6 демонстрировали бивентрикулярную некомпактность и неспособность к закрытию ductus arteriosus (малой артерии, соединяющей аорту и легочную артерию) [119]; эти результаты были связаны с уменьшением содержания H4K20me1. Было показано, что Prdm6 регулирует сеть генов, необходимых для спецификации нервного гребня сердца, включая Wnt1, Tfap2b и Sox9 [119].

В настоящее время нет данных, указывающих на роль метилирования H4K20 или его ключевых компонентов - KMT5A (HGNC alias: SETD8), KMT5B и KMT5C - в развитии сердца.

Table 1. Variants in lysine-specific methyl transferases associated with heart disease. KMT, lysine-specific methyltransferase; fs, frame-stop; N/A, detailed variant information not available. *, translation stop codon. Footnote 1: The authors apologize for any relevant studies that might have been omitted. Footnote 2: Patient also carried a variant in histone demethylase KDM5A (R1467W). Footnote 3: Both genetic variants were synonymous, i.e., they did not lead to an amino acid change in the protein sequence.

Исследования геномного секвенирования сердечных заболеваний, в том числе у пациентов с врожденными пороками сердца, позволили выявить большое количество генов-кандидатов [24,25,99]. Среди них много генов, участвующих в модификации гистонов (табл. 1). Хотя некоторые из них были подтверждены на животных моделях [24,32], вклад большинства этих генов во врожденные пороки сердца не может быть подтвержден из-за отсутствия функциональных данных in vivo в контексте развития сердца. Кроме того, каталитическая активность КМТ часто индуцируется с помощью комплексообразования, поэтому нельзя переоценить значение кофакторов и интеракторов КМТ в регуляции развития сердца, а также важный противовес и динамику, обеспечиваемую КМД. Для быстрого скрининга большого числа генов, участвующих в модификации гистонов, необходима высокопроизводительная модельная система, такая как дрозофила, которая уже продемонстрировала свой потенциал в этом отношении [32].

В совокупности имеющиеся литературные данные свидетельствуют о том, что каждое метилирование гистона по лизину, активирующее или репрессирующее транскрипцию, играет определенную роль в развитии сердца и, как следствие, в развитии заболеваний. Однако, будь то их влияние на решение судьбы клетки и спецификацию паттерна на критических стадиях развития или опосредование клеточных процессов во время развития или в зрелых клетках, сайты метилирования не действуют изолированно. В конечном итоге, чтобы понять вклад метилирования гистонов в регуляцию транскрипционных переходов в процессах здоровья и болезни, необходимо наблюдать весь ландшафт метилирования. Первые исследования, направленные на достижение этой цели, уже позволили получить новые сведения. Исследование многочисленных модификаций гистонов (H3K4me3 - активные промоторы; H3K27me3 - неактивные промоторы; H3K4me1 и H3K27ac - промоторы и энхансеры) вместе с транскриптомом на определенных стадиях дифференцировки сердца (стволовые клетки эмбрионов мыши в кардиомиоциты) позволило выявить сложные и в то же время различные паттерны хроматина, которые коррелируют с решениями о родословной [120]. Полученные данные позволили выявить различные паттерны хроматина, которые коррелировали с экспрессией генов, специфичных для конкретной стадии, многие из которых являлись человеческими генами-кандидатами сердечных заболеваний. Также было обнаружено множество хроматиновых паттернов, которые быстро снижают экспрессию генов, связанных с плюрипотентностью, при инициации дифференцировки, и хроматиновые паттерны, которые могут предсказывать наборы функционально связанных генов для оркестровки общих (на ранней стадии) и различных (на более поздней стадии) паттернов экспрессии генов во время дифференцировки кардиомиоцитов [120]. В другом сообщении изучены H3K4me3 (инициация транскрипции), H3K36me3 (элонгация транскрипции) и H3K27me3 (репрессия транскрипции) на пяти стадиях дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в кардиомиоциты [121]. Было обнаружено, что временные паттерны H3K4me2 и H3K27me3 в процессе дифференцировки кардиомиоцитов являются более сложными, чем до сих пор существовавшая бивалентная модель, и продемонстрированы сложные изменения гистон-лизинового паттерна на промоторах транскрипционных факторов, которые, как известно, играют критическую роль в процессе развития сердечно-сосудистой системы [121]. Эти исследования заложили основу для понимания все возрастающей сложности меняющегося ландшафта метилирования и того, как он в целом регулирует необходимые тонкости для успешного развития сердечной ткани.

Идентификация генов, связанных с метилированием при сердечных заболеваниях, открывает возможности для новых подходов к изменению экспрессии генов, связанных с заболеванием, например, введения малых молекул, направленных на специфические КМТ. Pinometostat (EPZ-5676; Epizyme, Inc., Cambridge, MA, USA) - ингибитор DOT1L и первый ингибитор КМТ, который вошел в фазу 1 клинических испытаний по изучению его безопасности и переносимости у пациентов с лейкемией (NCT01684150), а затем в фазу 1/2 клинических испытаний (NCT03701295) для проверки его эффективности в качестве средства лечения лейкемии [122,123]. С тех пор ингибиторы EZH2 GSK2816126 (GlaxoSmithKline) и tazemetostat (EPZ-6438; Epizyme, Inc., Cambridge, MA, USA) вошли в фазу 1/2 клинических испытаний для лечения В-клеточных лимфом (NCT02082977 и NCT01897571, соответственно) [123,124]. Положительные результаты испытаний по безопасности и применению будут способствовать тестированию этих специфических ингибиторов КМТ на предмет их эффективности в лечении врожденных и других заболеваний сердца, связанных с вариантами КМТ. Как и генетические функциональные скрининги, модели дрозофилы могут быть использованы для быстрого и крупномасштабного скрининга соединений-кандидатов [125-128]. Результаты фармакологического скрининга (например, эффективность и токсичность) на моделях мух могут послужить основой для определения приоритетности соединений-кандидатов для последующего тестирования на моделях млекопитающих, которое требует больших затрат и времени, и только после этого переходить к клиническим испытаниям.