Экспрессию белков α, β и γ катенина в BTB оценивали методом WB и IF или IHC у грызунов и редких гольянов (Gobiocypris rarus), подвергавшихся воздействию BPs.[2, 17, 34, 35, 38] Экспрессия белка β-катенина в BTB не была нарушена у взрослых крыс Вистар, мышей-подростков ICR и мышей-отъемышей Kunming, подвергавшихся в течение 5 или 60 дней воздействию BPА ( Напротив, экспрессия белка β-катенина снижалась у редких гольянов (Gobiocypris rarus), подвергавшихся воздействию BPA в течение 35 дней при концентрации 15µg/L Более того, экспрессия генов β-катенина в BTB, оцененная методом RT-PCR, снижалась у крыс Sprague-Dawley, получавших подкожно 50 mg/kg BPA в течение 15 дней.[1] Воздействие на взрослых крыс Sprague-Dawley в течение 30 дней 100 mg/kg bw/d BPS в течение 30 дней вызывало увеличение экспрессии белка β-катенина, однако при дозе 50 мг/кг/сут изменений не наблюдалось.[2] Экспрессия белков α и γ катенина не изменялась под воздействием BPA у взрослых крыс Вистар в дозах 0.02, 2, 10 или 50 мг/кг/сут[34] (табл. 2).

Комплекс кадхерин/катенин является функциональной единицей межклеточных соединений ES , регулирующей динамику обмена между клетками Сертоли и Сертоли и зародыша.[42] В процессе сперматогенеза половые клетки на последовательных этапах проходят между соседними SC к просвету семенных канальцев. Это движение происходит за счет изменения адгезии между сертолиевыми клетками и SC, зародышевыми клетками и сертолиевыми клетками зародыша.[30] Функциональная единица межклеточных ES состоит из комплекса кадхерин/катенин, причем β- или γ-катенин физически взаимодействует со связывающим доменом катенина вблизи С-конца кадхерина. Через α-катенин как связывающий белок этот комплекс соединяется с актиновой цитоскелетной сетью. Src, CK2 и Csk - это ES -ассоциированные сигнальные молекулы, которые контролируют функциональность комплекса кадхерин/катенин путем фосфорилирования комплекса, изменяя его структурную конфигурацию, что вызывает модификации в нижележащем актиновом цитоскелете, возможно, через активацию малых ГТФаз. В результате происходит разборка или сборка ES .[43] Таким образом, изменения в экспрессии β-катенина могут нарушить сборку/разборку BTB.

В четырех исследованиях экспрессию белка окклюдина в BTB оценивали с помощью WB и IF или IHC. Экспрессия белка окклюдина снижалась практически у всех животных, получавших BPA: У Kunming мышей, получавших перорально в дозах 0,05, 5 и 50 мг/кг в сутки в течение 30 дней[15]; у крыс Вистар, получавших перорально в дозах 10 и 50 мг/кг в сутки в течение 5-6 дней[34]; у редких гольянов (Gobiocypris rarus), получавших 15 µg/L в течение 35 дней. [17] Пероральное воздействие BPAF на мышей линии Kunming (5-50 мг/кг в сутки) не привело к изменению экспрессии окклюдина [38]. Экспрессия гена окклюдина, оцененная методом RT-PCR, в BTB снизилась у крыс линии Sprague-Dawley, получавших подкожно 50µг/кг в сутки BPAF в течение 15 дней[1] (табл. 2).

Окклюдин и клаудины - интегральные TJ-белки, регулирующие проницаемость эпителия и входящие в состав TJ-филаментов, наблюдаемых методом сублимационного разрыва[44]. В семенниках экспрессируются клаудины-1, -3, -4, -5, -7, -8 и -11. Клаудины-4, -5, -8 и 11 увеличивают внеклеточное электрическое сопротивление, а клаудин-7 повышает околоклеточную катионную проницаемость.[45] Наибольшая экспрессия клаудина-11 наблюдается на стадиях V-VII, что предшествует перемещению прелептотеновых/лептотеновых сперматоцитов через BTB. [46] У мышей с нулевым клаудином-11 нарушается полярность SC и функция TJ, что приводит к отсоединению и выпадению SC.[47] Окклюдин состоит из четырех проницающих мембрану доменов, двух внеклеточных петель и двух внутриклеточных сегментов. Избыточная экспрессия окклюдина в эпителиальных клетках повышает трансэпителиальное электрическое сопротивление.[48, 49] В кишечных эпителиальных клетках с дефицитом окклюдина белки ZO по-прежнему рекрутируются в TJ ,[50] это указывает на значимость, но не необходимость окклюдина для барьерной функции. Синтетические пептиды, соответствующие части последовательности второй внеклеточной петли, увеличивают парацеллюлярную проницаемость в клетках А6 и SC за счет нарушения взаимодействия между петлями,[51, 52] что также необходимо для позиционирования окклюдина на TJ ,[53] это свидетельствует о важности расположения окклюдина на TJ для регуляции проницаемости BTB. Окклюдин также может локализоваться на переднем крае мигрирующих клеток MDCK,[54] а его избыточная экспрессия индуцирует разрастание клеток AC2M2.[55] После нокдауна окклюдина атипичная протеинкиназа С и PATJ не накапливаются на переднем крае, а фосфоинозитид-3-киназа не активируется, что приводит к уменьшению числа клеточных выпячиваний. [54] Эти данные свидетельствуют о том, что окклюдин контролирует расположение белков полярности, установление полярности клетки и направление ее движения. Окклюдин может выполнять аналогичную функцию в семенниках и способствовать движению прелептотеновых/лептотеновых сперматоцитов через BTB. [30] Следовательно, снижение экспрессии окклюдина может влиять на проницаемость BTB и движение сперматоцитов.

У крыс (Вистар и Хольцмана), перинатально получавших низкие дозы (10 или 400 µг/кг в сутки) BPA в течение 5-42 дней, наблюдалось снижение экспрессии Cx43 в BTB.[14, 28] 30-дневное введение BPS (50-100 мг/кг в сутки) взрослым крысам Sprague-Dawley снижало экспрессию белка Cx43 в BTB.[2] Однако миллиграммовые дозы (0,02-50 BPА в течение 5 дней не изменяли экспрессию белка Cx43 ни у взрослых крыс Вистар[34], ни у мышей-отъемышей Кунминга, получавших BPА в течение 28 дней в дозах 5-20 мг/кг/сут, но при дозе 50 мг/кг/сут экспрессия снижалась[38]. В предыдущих исследованиях экспрессия белка Cx43 оценивалась с помощью WB и IF или IHQ. Экспрессия гена CX43, оцененная методом RT-PCR, не изменялась у крыс Sprague-Dawley, перинатально получавших 50 µг/кг BPA в сутки в течение 15 дней[1] (табл. 2).

GJ, образованные коннексинами, являются каналами межклеточной коммуникации между соседними SC, по которым осуществляется транспорт химических и биологических сигнальных молекул. Специфическая для SC делеция Cx43 у мышей приводит к нарушению сперматогенеза вследствие мейотической остановки, при которой сперматогонии не дифференцируются в сперматоциты[56] BTB у таких SC-специфических мышей с нокаутом Cx43 также демонстрирует значительные дефекты. На границе раздела SC и клеток не обнаруживается GJ, ZO-1, а N-кадхерины смещены в BTB, а GJ утрачивают коммуникационную функцию[57]. Cx43 между SC контролирует их пролиферацию, а между SC и сперматогониями регулирует выживание половых клеток, а не их пролиферацию. Во время развития семенника Cx43 в GJ, присутствующие в перинатальном семеннике, контролируют дифференцировку SC и поддерживают количество половых клеток (гоноцитов или примитивных сперматогоний). В дальнейшем Cx43 может контролировать дифференцировку половых клеток, что, по-видимому, необходимо для мейотической прогрессии сперматоцитов.[58, 59] SC обеспечивают метаболическую и сигнальную связь с половыми клетками через Cx43 GJ и позволяют синхронизировать пролиферацию, дифференцировку и выживание мужских половых клеток.[60] Кроме того, Cx43 может косвенно управлять сперматогенным процессом, контролируя TJ белки BTB.[57, 61].

Эти данные в совокупности иллюстрируют возможное участие GJ в функционировании BTB и его значительную роль в сперматогенезе. Таким образом, изменение характера экспрессии Cx43 под воздействием BPs может способствовать нарушению сперматогенеза.

Пять авторов изучали экспрессию белка ZO-1 у грызунов с помощью WB и IF или IHC, но результаты не являются убедительными.[2, 14, 28, 35, 38] BPA (10 µг/кг в сутки) вызывал снижение экспрессии белка ZO-1 в BTB крыс Вистар, подвергавшихся воздействию в течение 38-42 дней на перинатальной стадии. [14] Однако BPA (400µг/кг в сутки) вызывал увеличение экспрессии белка ZO-1 в BTB крыс Хольцмана, подвергавшихся воздействию в течение 5 дней на неонатальной стадии. [28] Экспрессия белка ZO-1 в BTB не изменялась у мышей-отъемышей линии Kunming, получавших BPAF (5µмг/кг/сут) в течение 28 дней[38], и у мышей-подростков ICR, получавших BPAF (50?г-50µмг/кг/сут) в течение 60 дней[35], однако она снижалась у мышей-отъемышей из Kunming, получавших 20 или 50µмг/кг/сут BPAF[38] (табл. 2).

Три белка ZO (ZO-1, ZO-2 и ZO-3) относятся к суперсемейству мембран-ассоциированных гуанилат киназных белков.[62] С ZO ассоциированы многие регуляторные белки.[62] Белки ZO локализуются в ядре при нарушении клеточных контактов или механических повреждениях. [ZO-1 взаимодействует с сигнальными белками, связанными с клеточной полярностью, созреванием TJ и ремоделированием цитоскелета[64] Ядерное расположение, сигналы экспорта и пост-трансляционные модификации контролируют перемещение ZO-2 между цитоплазмой и ядром. [65] Кроме того, увеличение экспрессии ZO-3 в TJ наблюдалось при ингибировании MEK1/2 и снижении фосфорилирования ERK1/2.[66] Если у мышей, дефицитных по ZO 1 или ZO 2, наблюдается ранняя эмбриональная летальность, то у мышей с нокаутом по ZO 3 явный фенотип отсутствует. [67, 68] Микроинъекция эмбриональных стволовых клеток ZO 2 KO в бластоцисты мышей дикого типа позволила получить жизнеспособные ZO 2 химеры.[62] У взрослых самцов ZO-2 химер наблюдалось снижение фертильности и патологические изменения в семенниках. Эксперименты с лантановым трассирующим веществом показали нарушение функции BTB у этих мышей.[62] Кроме того, уровни экспрессии ZO 1, ZO 3, клаудина 11 и окклюдина, по сравнению с контрольной группой, по данным анализа экспрессии и расположения генов, не были изменены. ZO 1 и окклюдин по-прежнему локализованы в области BTB, но клаудин 11 и Cx43 были неправильно локализованы из BTB. Эти результаты свидетельствуют об ограниченном дублировании ZO 2 и других белков ZO у взрослых мышей. ZO-1 был первым TJ-ассоциированным белком, идентифицированным в BTB, и непосредственно связан с актиновыми филаментами, закрепляя трансмембранные белки TJ на актиновом цитоскелете.[69, 70] ZO-1 связывается непосредственно с окклюдином,[71] клаудинами,[50, 72] и молекулами функциональной адгезии. [73] Связывание ZO-1 с окклюдином необходимо для нацеливания окклюдина на TJ и закрепления окклюдина на внеклеточных уплотнениях.[71, 74] Кроме того, ZO-1 связывает различные белки GJ, включая Cx43,[75, 76] преобладающий Cx в SC.[77] В SC мыши Cyr et al.[78] описали колокализацию ZO-1, окклюдина и Cx43 в одних и тех же соединительных комплексах. Они предположили, что структурная адгезия и коммуникация между клетками происходят на одних и тех же межклеточных интерфейсах и что ZO-1 может регулировать внутриклеточную сборку TJs и GJs. Следовательно, изменения в экспрессии ZO-1 могут нарушать внутриклеточные сигнальные пути, необходимые для регуляции сборки этих соединений.

По сравнению с контролем у взрослых крыс Вистар, получавших перорально 0,02, 2, 10 и 50 мг/кг/сут BPА в течение 5-6 дней, не наблюдалось изменений экспрессии белков N-кадхерина, E-кадхерина и JAM-A в BTB [34]. Экспрессия белка Nectin-3 снижалась в BTB только при обработке крыс 50 мг/кг/сут BPА, а при обработке 0,02, 2 или 10 мг/кг/сут изменений в его экспрессии не наблюдалось. [34] Экспрессия белка N-кадхерина не изменялась в BTB мышей-отъемышей из Куньминга, получавших в течение 28 дней перорально BPAF (5-50 мг/кг/сут)[38], и у взрослых крыс породы Sprague-Dawley, получавших в течение 30 дней перорально 50 мг/кг/сут BPsС. [2] Однако у новорожденных крыс Хольцмана, подвергавшихся в течение 5 дней воздействию 400 µг/кг BPA в сутки, и у взрослых крыс Sprague-Dawley, получавших в течение 30 дней 100 мг/кг BPS в сутки, наблюдалось увеличение экспрессии белка N-кадхерина в BTB.[2, 28] Полученные результаты оценивались с помощью WB и IF или IHC. Экспрессия гена N-кадхерина, оцененная методом RT-PCR, не изменялась у крыс Sprague-Dawley, получавших подкожно 50 µг/кг BPA в течение 15 дней[1] (табл. 2).

N-кадхерин и β-катенин являются составными белками адгерентных соединений яичек. Кадхерины - большое семейство гликопротеинов клеточной поверхности - имеют один внеклеточный домен, сходный с доменами иммуноглобулинов[79]. Половые гормоны регулируют экспрессию и обновление N-кадхерина, влияя на ход сперматогенеза[43]. [Между соседними SC существуют различные типы гомотипических адгерентных соединений, которые образуют комплексы между SC в BTB (базолатеральные соединения) и между SC и вытянутыми сперматидами (апикальные соединения).[80] Во взрослых яичках N-кадхерин отвечает за целостность эпителия семенников, регуляцию продукции сперматозоидов и формирование BTB.[43]

Nectins относятся к семейству связывающих молекул типа иммуноглобулинов, являются ключевыми молекулами адгезии и тесно связаны с кадхерином при формировании ES . Нектины инициируют образование контактов между двумя соседними клетками, а кадхерины затем рекрутируются в область контакта, образуя прочные межклеточные адгезии.[81] SC экспрессируют нектин-2 и нектин-3. В то же время сперматогенные клетки экспрессируют нектин-3. Все самцы мышей с нокаутом по нектину-2 и нектину-3 стерильны, у них наблюдается дефектная морфология сперматозоидов с деформированным ядром и аномальным расположением митохондрий в средней части[82, 83] У нектина-3^-/- у мышей нектин-2 в апикальной части ES смещен и нарушает гетерофильное взаимодействие между нектином-2 и нектином-3 в апикальной части ES , что приводит к нарушению развития сперматозоидов и их морфогенеза[84, 85].

Впервые JAM был идентифицирован как мембранный белок, интегрированный во внутриклеточные соединения эндотелиальных и эпителиальных клеток.[86] Три основных представителя JAM (JAM-A, -B и -C) обнаружены в семеннике млекопитающих. JAM-A и JAM-B ко-локализуются с окклюдином и приурочены к базальному отделу эпителия семенника.[87] Таким образом, JAM-A и JAM-B участвуют в формировании базальных ES и TJ между SC в BTB.[88] JAM-B также экспрессируется на SC в апикальных ES и образует функциональный комплекс с JAM-C, экспрессирующимся на вытянутых сперматидах. Это взаимодействие JAM-B (SC) и JAM-C (половые клетки) важно для закрепления половых клеток на SC в апикальной части ES и служит платформой для сборки комплексов клеточной полярности для поддержания полярности круглых сперматид.

Таким образом, целостность различных адгерентных соединений является критической для процесса сперматогенеза и образования жизнеспособных сперматозоидов. Следовательно, изменение экспрессии любого из этих белков негативно сказывается на становлении BTB и на производстве сперматозоидов.

Экспрессия белка кортактина (оцененная с помощью WB и IHQ) снизилась у взрослых мышей ICR, подвергавшихся воздействию BPА в течение 5 дней в дозе 2,5 µг/кг в сутки.[27] Экспрессию белков FAK, Arp 3 и палладина в BTB исследовали с помощью WB и IHQ у мышей-отъемышей Kunming, получавших перорально 5-50 мг/кг BPsА в сутки в течение 28 дней. При дозе 20 мг/кг/сутки увеличивалась экспрессия только белка FAK. При дозе 50 мг/кг в сутки экспрессия белка FAK увеличивалась, а экспрессия белка палладина уменьшалась. При дозе 5 мг/кг в сутки изменений в экспрессии этих белков не отмечено[38] (табл. 2).

Одним из наиболее важных признаков BTB по сравнению с другими барьерами кровь-ткани является заметное присутствие пучков актиновых микрофиламентов и микротрубочек между SC[89]. Актиновые микрофиламенты в базальных ES обеспечивают адгезионную прочность соединений SC-клеток в BTB, который также является местом прикрепления комплексов белков адгезии TJ , базальных ES и GJ. Несколько актин-связывающих белков регулируют динамику актина. Палладин, EPS8 и эзрин, являющиеся g-связывающими белками актина, а также Arp2/3 и N-WASP, являющиеся белками зарождения ветвящегося актина, модулируют преобразование актиновых микрофиламентов между их пучковой и непучковой/ветвящейся конфигурацией, что облегчает транспорт прелептотеновых сперматоцитов через BTB. [89] Это быстрое преобразование актиновых микрофиламентов также способствует другим внутриклеточным событиям, таким как транспорт органелл и эндоцитарные везикулы, опосредованные белковым эндоцитозом, трансцитозом и рециклированием. В базальной ES формируется ультраструктура, известная как базальный тубулобульбарный комплекс, представляющий собой гигантские эндоцитарные везикулы, используемые для переноса белков. Белки в дегенерирующем старом BTB над прелептотеновыми сперматоцитами могут быть рециркулированы для сборки нового BTB за этими сперматоцитами. Следовательно, белки в BTB, служащие строительными блоками, не требуют постоянного синтеза de novo на протяжении всего эпителиального цикла, чтобы не истощать ограниченные метаболические ресурсы SC[89].

Палладин - белок сшивания/обвязки актиновых филаментов, структурно взаимодействующий и ко-локализующийся с EPS8 и Arp3 (которые вместе с Arp2 образуют комплекс Arp2/3, вызывающий нуклеацию разветвленного актина и превращающий пучковые актиновые филаменты в неразветвленную/разветвленную сеть), что подтверждает его роль в регуляции динамики пучков актиновых филаментов в ES . Нокдаун палладина в SC in vitro с установленным барьером проницаемости TJ приводил к нарушению функции TJ , что было связано с дезорганизацией актиновых филаментов, влияющих на распределение белков в TJ . Его нокдаун in vivo также нарушает организацию F-актина, что приводит к потере полярности и адгезии сперматид и вызывает дефекты транспорта сперматид и сперматогенеза[90, 91].

Cortactin, актин-связывающий белок, является одним из белков адгезии апикального ES , который объединяется с несколькими межклеточными адгезиями.[27] Кортактин управляет зарождением актина de novo и создает точки ветвления на уже существующих филаментах, активируя комплекс ARP2/3. Помимо содействия удлинению филаментов, связывание кортактина стабилизирует F-актин[92] и участвует в эндоцитарном пути семенного эпителия.[93] У крыс уничтожение кортактина путем интратестикулярного введения дуплексов siRNA приводит к резкому укорочению тубулобульбарных комплексов и задержке или невозможности выхода сперматозоидов.[94] Экспрессия Arp3 в апикальной части ES коррелирует с движением сперматид и соответствующей ориентацией сперматид. Аналогично, высокий уровень Arp3 в BTB связан с его перестройкой для учета транзита прелептотеновых сперматоцитов на VIII стадии эпителиального цикла[95].

FAK является неотъемлемым компонентом BTB, регулирующим адгезию SC и выполняющим роль бифункционального молекулярного "переключателя", направляющего циклическую разборку и сборку BTB в ходе эпителиального цикла сперматогенеза. Поэтому p-FAK-Tyr407 способствует ассоциации ARP3 с N-WASP, облегчая транзит прелептотеновых сперматоцитов через BTB.[96] Кроме того, FAK необходим для набора и распределения белков, ответственных за стабилизацию и укрепление целостности BTB, таких как комплекс occludin-ZO-1 и адгезию сперматид через соединительные комплексы клеток Сертоли и зародыша апикальных ES , закрепляющих сперматиды.[97]

Соответственно, изменение экспрессии любого из этих белков влияет на целостность BTB, динамику пучков актиновых филаментов и ES .

В четырех исследованиях авторы сообщили о смещении и/или рассеянии белков occludin, Cx43, ZO-1, N-cadherin, ARP3 и palladin в BTB[2, 14, 28, 38]. Однако в двух статьях авторы сообщили об отсутствии изменений в локализации этих белков между контрольной и экспериментальной группой. [15, 34] В одном исследовании не обнаружено изменений в локализации некоторых белков, таких как β-катенин, Claudin11, Cx43, N-кадхерин и ZO-1, но в других исследованиях описаны изменения в апикальных белках ES β1-интегрина и нектина-3[2] (табл. 2).

Следовательно, смещение или рассеивание этих белков нарушает BTB, что приводит к нарушению процесса сперматогенеза.

У мышей-отъемышей CD-1, получавших 100-600 мг/кг BPA в сутки в течение 56 дней, наблюдалось уменьшение количества или даже исчезновение TJ между SC, что было выявлено с помощью TEM.[36] У взрослых мышей ICR и крыс Вистар, получавших 20 или 200µг/кг BPA в сутки в течение 6 дней, не было отмечено изменений в ES между SC, что было выявлено с помощью TEM. Однако наблюдались изменения в ES между SC и сперматидами.[37] У взрослых мартышек, получавших 2,5 мг/кг/сутки BPА в течение 70 дней, не наблюдалось изменений в ультраструктуре SC, однако при обработке 25 мг/кг/сутки BPА клеточные соединения SC-SC и SC-зародыш были повреждены[16] (табл. 2). Таким образом, обработка BPA ультраструктурно изменяет несколько функциональных комплексов BTB.

Практически во всех исследованиях, рассмотренных в данной работе, сообщалось о влиянии воздействия BP на репродуктивные параметры. Эти эффекты включали изменение морфологии сперматозоидов (деформация ядер, везикул и акросомальных крышек сперматид) [27, 36, 37]; нарушение количества и качества спермы и/или сперматогенеза [2, 14, 15, 28, 35, 38]; снижение уровня тестостерона в сыворотке крови[35]; дегенеративные эффекты на SC и клетки Лейдига [16], увеличение массы семенников[1] и повреждение ДНК сперматозоидов[38] (табл. 2). Таким образом, вызванные воздействием BPs изменения экспрессии или локализации белков BTB способствуют изменению различных факторов, участвующих в репродуктивной функции.

Ни в одном из исследований не приводились данные об ослеплении (blinding) групп на протяжении всего эксперимента, а также расчет размера выборки[1, 14-17, 27, 28, 34-38, 98]. В семи из 13 исследований животные были распределены по экспериментальным группам случайным образом, но ни в одном из них не приводились подробности процедуры[1, 2, 14, 28, 35, 36, 38] (табл. 3).

Table 3. Summary of risk of bias analysis in studies on BPs effect in animals.

В настоящем обзоре обобщены данные о влиянии введения BP in vivo на экспрессию белков соединения BTB. Насколько нам известно, это первый обзор, в котором рассматриваются изменения в белках BTB после введения BPs in vivo. BPs являются EDCs, влияющими на мужскую репродуктивную систему. Их влияние на репродуктивную функцию зависит от нескольких факторов, таких как модель животного, возраст животного на момент воздействия, продолжительность лечения, тип воздействия (хроническое или острое), возраст животного на момент взятия пробы после воздействия и способ введения.

В данном обзоре описаны 14 белков и генов BTB, которые подвергаются воздействию BPs. Наиболее часто изучались белки β-катенин и Cx43 (6 из 13 исследований); окклюдин, N-кадхерин и ZO-1 оценивались в пяти исследованиях; кортактин, E-кадхерин, JAM-A, нектин-3, α-катенин, γ-катенин, FAK, Arp3, клаудин-11, Eps 8 и палладин оценивались в одной статье.

В исследованиях in vitro воздействие высокой дозы BPA (200 µМ) на SC вызывало снижение экспрессии β-катенина, Cx43, N-кадхерина, окклюдина и ZO-1. Это снижение не наблюдалось в умеренных и низких дозах, за исключением ZO-1, который демонстрировал немонотонный ответ со значительно более низкой экспрессией белка в низких (менее 25 µМ) и высоких дозах.[12] BTB создается десятками белков, относящихся к различным типам клеточных соединений (каркасные белки, ES , десмосомы, TJs, GJs); взаимодействие между различными белками обеспечивает функционирование BTB. Хотя сообщалось, что BPs влияют на ось гипоталамус-гипофиз-гонады, внутригонадную стероидную сигнализацию и действуют как агонист и/или антагонист стероидных гормонов, способных связываться со стероидными рецепторами,[99-101] точный механизм влияния BPs на экспрессию или локализацию некоторых белков BTB остается неизвестным. Поэтому информация о механизме влияния BPs на экспрессию белков в BTB соединениях до сих пор недостаточна.

Согласно полученным результатам, введение BPs (BPA и BPAF) приводит к смещению белков соединения BTB у неонатальных крыс Вистар и Хольцмана, обработанных BPA, и у отнятых мышей Кунминга, обработанных BPAF. Структура BTB обеспечивает функционирование связи SC и зародышевых клеток и связи SC-SC.[31] BTB признана ранней мишенью для токсического воздействия на семенники.[26] Физиология BTB сильно зависит от активности стероидов, поэтому аберрантная локализация функциональных белков и их измененная экспрессия являются последствиями воздействия BPs.[26, 28, 31] Wu et al. [38] сообщили, что Arp и palladin смещены; это нарушение приводит к дезорганизации актиновых микрофиламентов в SC, которые не могут должным образом организоваться в пучковую сеть, что, возможно, препятствует цитоскелет-зависимой эндоцитарной везикуло-опосредованной транспортировке белков, критической для целостности BTB.[38] Таким образом, смещение белков BTB связано с дестабилизацией клеточной структуры.

По данным различных исследований, разрушение BTB, вызванное BPA, является обратимым, поэтому его считают подходящей моделью для изучения динамики BTB.[34] Согласно литературным данным, обратимость связана с двумя факторами: временем взятия образца после токсического воздействия и используемой дозой. У самцов мышей Kunming, получавших перорально низкую (0.05 мг/кг в сутки), среднюю (5.0 мг/кг в сутки) или высокую (50 мг/кг в сутки) дозы BPA с 35-го по 65 день жизни, было отмечено, что на 65 день жизни количество сперматозоидов, их подвижность и экспрессия окклюдина снижались в зависимости от дозы. Однако на 125-й день жизни эти параметры восстанавливались в группах с низкой и средней дозой. Напротив, в группе высоких доз восстановление не происходило, что позволяет предположить, что более высокие дозы BPA могут вызывать необратимые нарушения репродуктивной функции у мышей-самцов, связанные с повреждением SC или других компонентов, еще не проявляющих признаков восстановления.[15] Thuillier et al.[102] исследовали влияние фетального (день беременности [GD] 14 до рождение) воздействия BPA (0,1-200 мг/кг в сутки) на популяции половых и соматических клеток в семенниках неонатальных, препубертатных и взрослых крыс. Морфологическое исследование срезов семенников, полученных в возрасте PND 3, не выявило заметных изменений в популяциях соматических клеток. В препубертатном возрасте (PND 21) обработка BPA вызывала увеличение популяции сперматогоний. К 60 годам жизни популяции взрослых половых клеток вернулись к нормальному уровню. Однако абсолютный объем (мм³) клеток Лейдига значительно уменьшился (p менее 0,05), и единственным видимым эффектом, сохранившимся на популяции клеток семенников, было небольшое, но значительное увеличение числа клеток Лейдига.[102] Обратимые и дозированные эффекты, возникающие при обработке BPA, были также зарегистрированы in vitro. Например, 24 ч воздействия BPA (200 µM (~45 мг/кг массы тела)) обратимо нарушало TJ-барьер в SC, выделенных из семенников 20-дневных крысят Sprague-Dawley. В то же время BPA в концентрации 40 µМ не оказывал заметного влияния. Это обратимое нарушение было связано с активацией ERK и снижением уровней отдельных белков TJ , базальных ESs и GJs BTB.[36, 61] Таким образом, обратимость эффектов, вызываемых BPs в BTB, связана с конкретным окном воздействия, дозой и временем сбора, и эти факторы, вероятно, влияют на результаты, представленные в каждой статье.

Влияние малых доз BPs на мужскую репродуктивную функцию является спорным.[103, 104] Для BPА NOAEL, по данным EFSA, составляет 5 мг/кг в сутки.[40] В 2015 г. EFSA опубликовала результаты переоценки воздействия и токсичности BPА и установила временное допустимое суточное потребление (tTDI) на уровне 4µµg/kg?bw/d. [105] LOAEL для репродуктивной токсичности BPА составляет 300 мг/кг в сутки, а NOAEL - 60 мг/кг в сутки.[41] Насколько нам известно, не существует описанных значений NOAEL или LOAEL для BPAF. В некоторых исследованиях воздействие BPs в дозах ниже NOAEL оказывало вредное влияние на белки спаек BTB крыс [1, 14, 27, 28] и на репродуктивные параметры [106]. Например, воздействие пероральных доз BPA на два поколения (0,2 и 200 µг/кг в сутки) не привело к значительным изменениям репродуктивных и возрастных параметров у крыс (Crj: CD [SD] IGS)[107] У крыс линии Sprague-Dawley, получавших низкие дозы (0,001-5 мг/кг в сутки) BPA, не было отмечено существенных изменений, связанных с соединением. BPA в малых дозах (0 001-5 мг/кг/сутки), не выявили влияния на репродуктивные параметры (количество, подвижность, морфологию, суточную продукцию сперматозоидов в эпидидимальной полости) и не обнаружили немонотонных кривых доза-ответ в разных поколениях.[108] Таким образом, доза может быть не единственным фактором, влияющим на эффект, вызываемый BPs.

Различия в чувствительности к эстрогенным соединениям были зафиксированы между штаммами крыс. Аутбредные крысы Sprague-Dawley CD от Charles River Laboratories [Crl: CD[SD]] обладает очень низкой чувствительностью к экзогенным эстрогенам. [109] Однако низкая доза BPA (50 µг/кг в сутки) вызывала изменения в белках BTB и увеличение массы семенников.[1] Крысы Fisher 344 более чувствительны к низким дозам BPA, чем крысы Sprague-Dawley.[109] В статьях, включенных в данный обзор, использовались разные штаммы крыс и мышей, поэтому этот фактор, вероятно, влияет на результаты. Кроме того, существуют видовые и индивидуальные различия в экспрессии эстрогеновых рецепторов α (ERα) и β (ERβ) в клетках Лейдига, Сертоли, перитубулярном миоиде, сперматогониях, сперматоцитах и сперматидах[110], поэтому регуляция на геномном уровне и задействованные сигнальные пути также могут быть разными.

В различных исследованиях утверждается, что результаты, полученные на грызунах, не могут быть распространены на человека из-за несходства эндокринной системы человека и грызунов [16, 22, 111]. Например, печеночная способность к глюкуронидации BPA у человека выше, чем у крыс и мышей [112], и "безопасный" уровень BPA может быть не вреден для человека [15]. Поэтому для оценки эффектов BPs необходима животная модель с репродуктивными параметрами, более близкими к человеческим. Очень важно сравнить метаболизм BPА у нечеловеко-образных животных и человека и понять, как он изменяется с возрастом. [15, 16, 113] Однако животные - единственный вариант для тестирования всего организма.[22] Таким образом, необходимо создать модель оценки BPА in vivo, которая может быть использована в репродуктивной токсикологии у человека для определения негативного влияния BPs на репродуктивную функцию.

Возраст, в котором животное подвергалось воздействию EDCs, влияет на эффект воздействия BPs на репродуктивную функцию самцов. В некоторых исследованиях сообщалось, что введение BPA взрослым животным приводит к уменьшению массы семенников и простаты, снижению высоты эпителия семенников[114], потере структурной интеграции в гонадальном отделе [115], снижению уровня тестостерона в сыворотке крови, фолликулостимулирующего гормона в сыворотке крови и количества половых клеток [116]. Однако в исследованиях, проанализированных в данном обзоре, возраст грызунов, подвергшихся воздействию BPs, был различным (от GD 1 до PND 120). В двух работах, где грызуны подвергались воздействию BPА (10 или 400 µг/кг в сутки) в неонатальном периоде, экспрессия всех исследованных белков BTB была нарушена (Cx43, N-кадхерин и ZO-1).[14, 28] Напротив, у взрослых грызунов (PND 90 или 120), получавших BPА (20 или 200 µг/кг в сутки), ES между SC не изменялась.[37] По данным Li et al, [34] воздействие BPA оказывало различное влияние в зависимости от возраста крыс. У неполовозрелых крыс BPA вызывал нарушение целостности BTB, в то время как у взрослых крыс BPA не вызывал изменений этого параметра.[34] Эти результаты подтверждают мнение о том, что пренатальный или неонатальный организм более чувствителен к воздействию BPA, чем взрослый.[34]

Перинатальные организмы более чувствительны к воздействию BPA. После перорального приема BPA быстро метаболизируется в кишечнике и печени, главным образом в виде BPA-глюкуронида (BPA-GA). Небольшое количество BPA может также реагировать с сульфатом с образованием BPA-сульфата (BPA-S); большинство конъюгатов BPA выводятся с калом через желчь и мочу [117-119]. Кроме того, метаболизм BPA зависит от пола животного. У крыс-самцов вводимый BPA конъюгируется в печени до моно-глюкуронида и деконъюгата глюкуронида/сульфата. У крыс-самок, напротив, BPA конъюгируется почти исключительно в глюкуронид, а деконъюгат отсутствует [120]. Ферменты, опосредующие пути конъюгации, имеют гендерные различия. Сульфат-конъюгация BPA опосредуется семейством SULT1, изоформой фенолсульфотрансферазы. [121] Уровень экспрессии семейства SULT1 выше у самцов, чем у самок крыс. [122] Изофермент UGT2 (сульфотрансфераза), опосредующий глюкуронирование BPA, имеет половые различия в экспрессии мРНК; более высокие уровни показаны у самок по сравнению с самцами. [123] Воздействие BPA на крыс во время беременности может привести к переносу соединения через плаценту к плоду и негативному влиянию на него, несмотря на эффективные системы метаболизма препарата у плода.[124-126] Nishikawa et al.[126] показали, что BPA-GA переносится и деконъюгируется в организме плода. У человека BPA пересекает плаценту двунаправленно, и способность плаценты ограничивать воздействие BPA на плод, обусловленное воздействием окружающей среды матери, ограничена [119]. Поэтому вероятно, что воздействие BPA в перинатальном периоде связано с развитием системы метаболизма, поскольку метаболиты активны и могут оказывать вредное воздействие. BPA-GA может индуцировать накопление липидов в преадипоцитах человека и мыши и увеличивать экспрессию ряда важнейших адипогенных маркеров на уровне мРНК и белка [127].

Ученые постоянно указывают на необходимость проведения дополнительных исследований для лучшего понимания источников воздействия BPA на человека. Эти потребности в исследованиях послужили основанием для запроса информации от Национальной токсикологической программы и Национального института наук о здоровье окружающей среды в 2009 г.[113] Известно, что основным источником воздействия BPA на человека является употребление загрязненной пищи (рис, птица, домашний скот, морепродукты, белок, фрукты и овощи). Другими возможными источниками воздействия являются атмосферный воздух, пыль, вода и контакт с кожей. [128-130] Пути введения BPs, которые рассматривались в исследованиях по изучению влияния EDCs на репродуктивные параметры, включают пероральный (через зонд, добавление BPA в пищу или питьевую воду или введение химиката в масло), инъекционный (подкожный, внутрибрюшинный, внутрикостный или внутримышечный) и имплантацию капсул или минипунктов, что приводит к устойчивому уровню воздействия (обзор см. в Richter et al.[109]). Способ введения также связан с силой наблюдаемого эффекта. Токсическое воздействие BPs на репродуктивную функцию мужчин связано с биодоступностью и метаболизмом. Установлено, что фармакокинетика и метаболизм меченного 14C BPA после однократного перорального, внутрибрюшинного или подкожного введения крысам Fischer 344 в дозах 10 или 100 мг/кг зависит от пути введения. Относительная биодоступность BPA при пероральном введении значительно ниже, чем при подкожном или внутрибрюшинном введении. Кроме того, метаболиты, образующиеся при различных путях введения, приводят к формированию уникальных метаболитных профилей.[131] Таким образом, BPA, вводимый перорально, менее токсичен для крыс и мышей. BPА, введенный подкожно или внутрибрюшинно, наносит больший вред мужским репродуктивным органам и половым аксессуарам, чем BPА, введенный диетическим путем[132]. В обзоре установлено, что у грызунов изучались только два пути введения BPА (пероральный и подкожный), а для BPAF и BPS (oral) изучался один путь введения (пероральный). У редкого гольяна (Gobiocypris rarus) BPA вводился через воду, а у обыкновенных мартышек - перорально. Таким образом, информация о влиянии BPs на экспрессию белка BTB при различных путях воздействия практически отсутствует. Необходимо оценить другие пути воздействия BPs на человека.

В статьях, рассмотренных в данном обзоре, использовались различные средства доставки. В трех исследованиях использовался DMSO, а в девяти - спирт, растворенный в масле. Имеются данные in vitro и in vivo о том, что транспортные средства, такие как DMSO и этанол, не являются безвредными и модулируют реакцию на биомаркеры эндокринных разрушителей.[133] DMSO - универсальный растворитель, регулярно используемый для введения in vivo нерастворимых в воде молекул, таких как BPs, и широко признанный нетоксичным при низких концентрациях. [134, 135] DMSO играет потенциальную роль в регуляции биологических процессов на транскрипционном уровне, влияет на ультраструктуру клеток, может воздействовать на молекулярные пути и оказывает in vivo влияние на репродуктивные параметры. DMSO, используемый в качестве транспортного средства, вызывал значительное увеличение активности ароматазы и экспрессии изоформ ароматазы (P450aromA и P450aromB) и генов ERα у рыб. [136] В другом исследовании у неполовозрелых атлантичеcrих лососей, подвергшихся воздействию DMSO, используемого в качестве контроля растворителя, через 7 дней после воздействия изменились уровни мРНК StAR, P450scc и CYP11 β [137] DMSO влияет на ультраструктуру клеток, вызывая образование TJ-подобной структуры, увеличение экспрессии окклюдина и ZO-1 и их локализации на границах клеток, а также увеличение трансэпителиального электрического сопротивления клеток пигментного эпителия сетчатки (RPE) in vitro, сравнимое с явлением, наблюдаемым в клетках RPE in vivo.[138] DMSO широко используется для денатурации белков. Его воздействие на кожу человека изменяет конформацию межклеточного кератина с α спирали на β лист.[139] Было также показано, что DMSO взаимодействует с межклеточными липидными доменами рогового слоя кожи человека. Учитывая размер молекулы DMSO и ее полярную природу, DMSO может взаимодействовать с полярными группами некоторых бислойных липидов, деформируя геометрию упаковки [140]. DMSO может влиять на клеточные пути, поскольку он мгновенно запускает высвобождение кальция из внутриклеточных запасов для начала дифференцировки гранулезных клеток из куриных преовуляторных фолликулов. [141] Наконец, DMSO влияет на репродуктивные параметры, так как вызывает преждевременное раскрытие влагалища у новорожденных самок мышей C57BL/Crgl.[142] Мы сообщали, что DMSO не является инертным, так как он повышает уровень прогестерона в сыворотке крови, количество а-ядерных поверхностных клеток влагалища и продолжительность диэструса у сук.[143].

В качестве транспортного средства этанол также вызывает эффект в отношении стероидогенных ферментов. Этанол, используемый в качестве транспортного средства, снижал уровень мРНК CYP3A (стероидогенного фермента) на 3-й день после воздействия по сравнению с холостыми образцами (0-й день) у молоди атлантического лосося (Salmo salar).[144] В яичниках зрелых самок тилапии этанол способствовал превращению тестостерона в эстрадиол, активируя P450arom.[145]

Однако в данном систематическом обзоре включенные в него статьи не сообщали об изменении изучаемых параметров под воздействием транспортного средства в опытных экспериментах или контрольной группы. Мы рекомендуем тщательно подходить к выбору транспортного средства и его концентрации. Учитывая повсеместное использование DMSO в биологических анализах, Galvao et al.[134] предложили использовать для солюбилизации лекарственных препаратов мицеллы/липосомальные составы, а не DMSO. Однако при отсутствии альтернативы процентное содержание DMSO должно быть минимальным, а для проверки влияния растворителя в дополнение к контролю с DMSO следует включать контрольную группу без лечения [134].

В последнее время BPA постепенно заменяется аналогами BPA, такими как BPS, BPF, BPAF, TBBF или TBBPA, из-за ограничений, наложенных на использование BPA в некоторых материалах, контактирующих с пищевыми продуктами. Однако на использование аналогов ограничений нет. Они даже считаются безопасными в часто используемых промышленных изделиях. [2, 5, 146, 147] Мы не нашли статей, оценивающих влияние BPF, TBBF или TBBPA на экспрессию белка BTB in vivo. Однако сообщалось, что аналоги BPA (BPS, BPF, BPAF, TBBPA) вызывают изменения в ткани семенников, эндокринной системе, сперматогенезе и стероидогенезе в мужской репродуктивной системе. [10, 13, 148] Исследования in vivo и in vitro показали, что аналоги BPA обладают сопоставимым или более высоким сродством связывания с рецептором эстрогена, связывания с белком G, или более мощной эндокринологической активностью, чем BPA, а комбинация двух BP может вызывать аддитивные вредные эффекты. [6, 10, 149-153] Эти данные позволяют предположить, что аналоги BPA могут оказывать вредное воздействие на фертильность млекопитающих. В данном систематическом обзоре мы нашли только одну статью, в которой оценивалось влияние BPAF и одну, в которой оценивалось влияние BPС на экспрессию белков BTB. Таким образом, необходимо изучить основные механизмы влияния аналогов BPА на репродуктивную систему, такие как дисрегуляция экспрессии белка BTB, чтобы оценить целесообразность использования аналогов BPА в повседневной жизни.

Для оценки исследований на животных мы использовали инструмент SYRCLE's RoB, адаптированную версию Кокрановского инструмента RoB.[33] Ни в одном из исследований не было представлено данных об ослеплении (blinding) групп на протяжении всего эксперимента и расчетов размера выборки, а в 7 из 13 исследований животные были распределены в экспериментальные группы случайным образом. Таким образом, первым ограничением данного систематического обзора стало потенциальное наличие предвзятости, связанной с неадекватной рандомизацией, отсутствием blinding и расчетом размера выборки. Такие основополагающие принципы, как рандомизация и blinding (в слепую), являются важнейшими для проведения и представления результатов научных исследований.[154] Размер выборки в значительной степени влияет на гипотезу и дизайн исследования, и не существует простого способа расчета адекватного размера выборки для получения точного заключения. [155] Поэтому ни одно из исследований не соответствует современному стандарту полного и прозрачного представления данных об исследованиях на животных.[154] Чтобы исправить ситуацию с оценкой предвзятости, в будущем исследователи могли бы использовать рекомендации, улучшающие представление данных об исследованиях и дизайн экспериментов на животных, например, рекомендации ARRIVE.[156]

Вторым ограничением является высокая неоднородность исследований. Мы обнаружили различия практически по всем факторам, использованным в каждом исследовании, таким как модель животного, возраст воздействия и сбора образцов, способ введения, методы оценки, доза, транспортное средство и продолжительность воздействия. Мы намеревались провести мета-анализ, но в большинстве исследований авторы не указывали стадию эпителиального цикла семенных канальцев. Эти стадии очень важны, поскольку стадийная локализация и экспрессия белков BTB тесно связаны с динамикой BTB. [46] Кроме того, было показано, что EDCs по-разному влияют на белки BTB в зависимости от стадий эпителиального цикла. [157] Таким образом, метаанализ может показать ошибочные результаты. Однако мы представили изменения в экспрессии белков BTB у животных, получавших BP, по сравнению с контрольной группой, как и сообщали авторы (табл. 2). В будущем, если будет проведено больше экспериментов in vivo и авторы опишут различные стадии эпителиального цикла, на которые влияют BPs, результаты будут более точными.

Наконец, необходимо отметить, что влияние BPs на межклеточные соединения наблюдается не только в гонадах. Например, BPA снижал экспрессию белков ZO-1, occludin и claudin-1 в эпителии толстой кишки мышей[158]. В сосудистых клетках BPA увеличивал экспрессию белков occludin и ZO-1. [159] Кроме того, высокие дозы TBBPA ингибировали межклеточную коммуникацию через GJs в эпителиальной линии клеток печени IAR20 in vitro.[160] BPA также влияет на TJs, участвующие в трансформации плазматической мембраны, что делает эпителиальные клетки матки восприимчивыми к прикреплению трофобластических клеток. Кроме того, TJs регулируют содержание и объем люминальной жидкости в матке. Перинатальное введение BPA одному или обоим родителям нарушало определенную экспрессию белков TJ (ZO-1, occludin, claudin-1, -3, -4 и -7), снижало соотношение экспрессии талина апикально/базально и Е-кадхерина апикально/латерально в эпителии матки и экспрессию Е-кадхерина в бластоцисте потомства, тем самым уменьшая количество мест имплантации. [161, 162] Однако молекулярные механизмы, используемые BPs и влияющие на экспрессию белков межклеточных соединений, до конца не выяснены.

Исходя из имеющихся данных, мы уверены, что не существует биологической модели, позволяющей оценить влияние BPs на белки BTB человека. Тем не менее, исследования in vivo на животных моделях являются наилучшим подходом к изучению влияния BPs на репродуктивную систему. К сожалению, имеющаяся информация скудна, а характеристики исследований разнообразны, включая дизайн, сроки, способ воздействия, используемые виды животных и дозы, что затрудняет получение глобальных выводов. Однако воздействие BPs влияет на экспрессию и локализацию белков BTB, что приводит к пагубным последствиям в мужской репродуктивной системе. Поэтому молекулярный механизм, определяющий последствия воздействия BPs на организмы, должен быть изучен в дальнейшем для оценки риска воздействия этих соединений на человека. Около 20 видов аналогов бисфенола используются в товарах повседневного спроса, и многие другие EDC присутствуют в окружающей среде. Учитывая все более широкое использование этих продуктов, необходимо оценить влияние на здоровье человека воздействия нескольких EDC, поскольку их действие может быть аддитивным, синергическим или антагонистическим. Кроме того, исходя из разнообразия доз, испытанных в статьях, описанных в данном обзоре (2,5 µг-100 mg/kg bw/d), и эффектов, вызываемых BPs в белках соединений в BTB, исследования по определению уровней безопасности BPs имеют принципиальное значение. Наконец, необходимо использовать животные модели, приближенные к физиологии человека, а использование "омических" технологий могло бы существенно ускорить получение результатов.