Посещений:
ВРОЖДЕННЫЕ НАРУШЕНИЯ РАЗВИТИЯ КОНЕЧНОСТЕЙ



Гентические основы

Genetic cold cases: lessons from solving complex congenital limb disorders
Guillaume Andrey and Denis Duboule
Genes Dev. 2023 Apr 1; 37(7-8): 261-276.

Congenital genetic disorders affecting limb morphology in humans and other mammals are particularly well described, due to both their rather high frequencies of occurrence and the ease of their detection when expressed as severe forms. In most cases, their molecular and cellular etiology remained unknown long after their initial description, often for several decades, and sometimes close to a century. Over the past 20 yr, however, experimental and conceptual advances in our understanding of gene regulation, in particular over large genomic distances, have allowed these cold cases to be reopened and, eventually, for some of them to be solved. These investigations led not only to the isolation of the culprit genes and mechanisms, but also to the understanding of the often complex regulatory processes that are disturbed in such mutant genetic configurations. Here, we present several cases in which dormant regulatory mutations have been retrieved from the archives, starting from a historical perspective up to their molecular explanations. While some cases remain open, waiting for new tools and/or concepts to bring their investigations to an end, the solutions to others have contributed to our understanding of particular features often found in the regulation of developmental genes and hence can be used as benchmarks to address the impact of noncoding variants in the future.
Врожденные генетические нарушения, влияющие на морфологию конечностей млекопитающих, многочисленны и уже давно описаны, систематизированы и регулярно классифицируются (например, Swanson 1976; Stoll et al. 1998; Mundlos and Horn 2014; Lam et al. 2020). У человека они особенно легко выявляются при ультразвуковом обследовании во время беременности или при рождении и могут влиять на всевозможные аспекты, включая длину и количество костей, их правильное строение или внутреннюю организацию. Молекулярный и геномный анализ таких врожденных аномалий конечностей позволил проиллюстрировать важность различных сигнальных путей и транскрипционных факторов для гармоничного эмбрионального развития этих структур (см. Mundlos and Horn 2014). Аналогичным образом, в результате генетических скринингов или других подходов, проведенных на мышах, было получено множество мутантов, демонстрирующих пороки развития конечностей, и, опять же, некоторые из них могут быть связаны с точными генетическими изменениями в определенных генах.
Однако ряд таких врожденных пороков развития конечностей либо оставался необъяснимым в течение нескольких десятилетий, либо изначально был связан с неправильной молекулярной этиологией. Основная причина существования таких генетических "холодных" случаев, а также трудности их решения в прошлом могут быть связаны с тем, как парные конечности появились в ходе эволюции тетрапод. Действительно, все ключевые сигнальные пути и генные регуляторные сети (GRN), реализуемые в ходе раннего развития конечностей, были кооптированы из прежних функций, которые они обычно выполняли в ходе развития основной оси тела. Как следствие, структурные мутации, влияющие либо на наличие, либо на структуру белков, в большинстве случаев приводят к тяжелым синдромам, что, вероятно, не позволяет довести развитие до конца. В некоторых случаях высокая плейотропность многих таких генов все же позволяла проявляться таким локализованным фенотипам благодаря топологической индивидуализации тканеспецифических регуляторных последовательностей и их отделенности от соответствующих генов-мишеней, что придавало им относительную генетическую независимость (de Laat and Duboule 2013 и ссылки на них). В настоящее время мы понимаем, что большинство генетических "холодных" случаев обусловлено более или менее сложными регуляторными мутациями, которые в течение многих лет не позволяли выявить их правильное молекулярное происхождение.
За последние 20 лет ряд технологических и концептуальных достижений кардинально изменил наши представления о регуляции генов развития. Одним из главных достижений стало открытие того, что энхансерные последовательности (Banerji et al. 1981; Schaffner 2015) могут работать на приличном расстоянии от целевого промотора (Spitz et al. 2003; Lettice et al. 2003), иногда представляя собой глобальную регуляторную единицу, такую как LCR - контрольная область глобинового локуса (Forrester et al. 1987; Grosveld et al. 1987; Higgs et al. 1990). Кроме того, плейотропная регуляция, которая часто встречается у важных генов развития, достигается за счет накопления энхансеров различной специфичности на больших "регуляторных ландшафтах" (Spitz et al. 2003), которые могут легко охватывать 1 Мб ДНК (Lettice et al. 2003). Интересно также, что регуляторные ландшафты часто совпадают с протяженностью "топологически ассоциированных доменов" (TADs) (Dixon et al. 2012; Nora et al. 2012; Sexton et al. 2012), т.е. субдоменов хроматина, определяемых повышенной частотой внутренних взаимодействий. В результате считается, что TADs ограничивают область действия энхансеров в данном трехмерном пространстве и, следовательно, могут предотвращать нежелательные регуляторные взаимодействия, например, с геном, расположенным за пределами данного TAD (например, Lupia'nez et al. 2015). TADs обычно разделены сериями сайтов связывания CTCF, которые выступают в роли "границ" (например, Despang et al. 2019; Anania et al. 2022), образуя большие петли в результате когезин-управляемого механизма экструзии хроматина (обзор см. в статье Mirny and Dekker 2022).
С учетом этих новых знаний могут быть заново открыты несколько генетических "холодных" (непонятных?) случаев. Здесь мы представляем ряд из них, некоторые из которых были успешно раскрыты, в то время как другие до сих пор остаются неясными. Помимо описания геномной природы соответствующих изменений, стоит задать вопрос о том, чему научили нас эти длительные и зачастую сложные исследования с точки зрения механизмов, лежащих в их основе, и могут ли эти механизмы быть перенесены в другие контексты развития. С эпистемологической точки зрения описанные ниже случаи показывают, насколько мощным является взаимодействие двух столь разных дисциплин, как фундаментальная молекулярная биология, с одной стороны, и "классическая" генетика человека и мыши, с другой, если оно происходит в нужное время и в единых теоретических рамках.
Ulnaless and mesomelic dysplasias: inverting the regulatory logic


В 1990 г. Davisson and Cattanach 1990) сообщили о полностью пенетрантной доминантной мутации у мышей, вызванной рентгеновским излучением, которую они картировали на хромосоме 2 с помощью генетических маркеров. Гомозиготных животных получить не удалось, а у гетерозиготных особей наблюдался тяжелый фенотип скелета конечностей - в частности, его средней части, zeugopod (лучевая и локтевая кости), с почти полным отсутствием локтевой кости; отсюда и название "Ulnaless" (Ul). Два года спустя Kantaputra et al. (1992) впервые сообщили о mesomelic dysplasia (MD; укороченная и плохо сформированная средняя часть скелета конечности), проанализировав пациентов с короткими конечностями. Спустя несколько лет они локализовали этот врожденный синдром на участке 2q24-2q32 человека (Fujimoto et al. 1998). Тем временем мышиный локус HoxD, один из четырех кластеров Hox-генов млекопитающих, был картирован на хромосоме 2 мыши в области, синтенной с человеческой 2q31 (Featherstone et al. 1988; Stubbs et al. 1990).
Было высказано предположение, что этот кластер генов Hox (первоначально называвшийся Hox-5) отвечает за рост и формирование зачатков конечностей (Dolle' et al. 1989), и вскоре эта гипотеза была подтверждена инактивацией гена (Dolle' et al. 1993). Однако полученные аномальные фенотипы конечностей были не очень сильными благодаря компенсаторному действию паралогичных генов, расположенных в кластере HoxA, которые также оказались функциональными в процессе развития конечностей (Haack and Gruss 1993; Zakany and Duboule 2007 и ссылки на них). Как следствие, мутация паралогичных генов Hoxa и Hoxd приводила к таким серьезным последствиям, как практически полный агенезис конечностей у плодов с двойной мутацией Hoxd13-Hoxa13 (Fromental-Ramain et al. 1996). Аналогичным образом в 1995 г. в лаборатории Capecchi (Davis et al. 1995) был зарегистрирован сильно выраженный фенотип мезомелической дисплазии у мышей, гомозиготных по двойному нокауту Hoxd11 и Hoxa11 - двух генов, необходимых для развития промежуточных частей конечностей - zeugopod. Мыши, несущие только три нулевых аллеля Hoxd11/Hoxa11, были поражены гораздо меньше, чем при полной потере функции обоих генов, что свидетельствует о том, что одной дозы генов Hox группы 11 было достаточно для достижения практически нормальной функции Hox11 в zeugopod. Это заметно контрастировало с полу-доминантностью мутации Ul, которая уже у гетерозиготных мышей приводила к появлению аномальных конечностей, сходных с теми, в которых полностью отсутствовала функция Hox11. Как следствие, потенциальная связь между этими двумя экспериментально полученными мезомелиями осталась незамеченной.
Однако для дальнейшей локализации мутации Ul относительно HoxD была создана высокоплотная генетическая карта хромосомы 2, на которой не было обнаружено ни одного события рекомбинации между Ul и HoxD, что свидетельствует о тесной связи между этими двумя локусами и повышает вероятность того, что Ul действительно аллелен HoxD, несмотря на их резкое фенотипическое несоответствие (Peichel et al. 1996). Анализ экспрессии генов Hoxd в Ul-мутантных эмбрионах подтвердил, что экспрессия этих генов аномальна в Ul-фоне; хотя активность некоторых генов, по-видимому, снижена, было отмечено поразительное усиление экспрессии терминальных Hoxd-генов (He'rault et al. 1997; Peichel et al. 1997), в частности Hoxd13, гена, необходимого для построения наиболее дистальных частей конечностей - аутоподов (кистей и стоп). В зачатках конечностей мутанта Ulb Hoxd13 эктопически экспрессировался в виде большого участка, расположенного точно в пределах будущих zeugopod костей , в то время как в области его нормальной экспрессии, включая будущие пальцы, его экспрессия была понижена. Таким образом, была выдвинута гипотеза о том, что эктопические белки HOXD13 негативно взаимодействуют с функцией Hox группы 11, что в определенной степени приводит к их совместной инактивации (He'rault et al. 1997). Однако как механизм, лежащий в основе этого потенциального усиления функции, зависящего от потери функции, так и структурная природа мутации Ulnaless оставались неизвестными.
В конце концов, в 2003 г. мутация Ulnaless была охарактеризована путем выяснения структуры регуляторных ландшафтов, окружающих кластер HoxD, благодаря идентификации точки разрыва в недавно обнаруженном гене Lunapark (Lnp). Это оказалась довольно небольшая инверсия, содержащая весь кластер HoxD, а также некоторые фланкирующие его области (Spitz et al. 2003). В 2013 г. было показано, что кластер HoxD зависит от бимодального типа регуляции в конечностях, причем с одной стороны генного кластера находятся аутоподиальные энхансеры, а с другой - zeugopodial (рис. 1А; Andrey et al. 2013). Соответственно, инверсия Ulnaless репозиционировала Hoxd13 рядом с zeugopodial энхансерами, а гены, обычно отвечающие на zeugopodial энхансеры, были репозиционированы в другую сторону, что привело к их пониженной регуляции (Spitz et al. 2003; Bolt et al. 2021). В результате близости энхансеров Hoxd13 и zeugopodial энхансеров ген транскрипционно активировался в будущих клетках предплечья, в той области развития, где он в норме отсутствует, что, вероятно, и обусловило фенотип мезомелии (рис. 1Б, стрелки на схемах слева). В то же время такое перемещение Hoxd13 на расстояние от большинства аутоподиальных энхансеров привело к снижению его регуляции в клетках будущих пальцев.



Figure 1. The mouse Ulnaless allele and a human mesomelic dysplasia. (A) Wild-type genetic configuration at the HoxD locus where the distal (digits) and proximal (arm/forearm) regulatory landscapes are split into two TADs-C-DOM (magenta) and T-DOM (green), respectively-that independently operate on the HoxD cluster, located in between. (Top) The distal/autopodial (magenta) versus proximal/zeugopodial (green) specificities of enhancers are shown on the limb bud schematics. Hoxd13 (thick vertical bar) poorly interacts with the proximal regulatory landscape (T-DOM) and thus is not stably expressed in proximal limbs and hence is specific for the distal aspect (scheme at the left). A control skeletal preparation is shown at the right. (hu) Humerus, (ra) radius, (ul) ulna. (B) In the mouse Ulnaless allele, a conservative inversion (blue arrows) repositions the entire cluster in the middle of the T-DOM, leading to ectopic enhancer-promoter contacts between Hoxd13 and proximal enhancers (green) and a consequent ectopic expression of Hoxd13 in the proximal limb (arrows in the scheme at the left). (Right) Ultimately, this expression leads to the mesomelic dysplasia phenotype, with reduced and ill-formed radius and ulna. Also, the cluster is now far from C-DOM and its digit enhancers (magenta), leading to a Hoxd13 loss of function in digits (scheme at the left). The inversion of the cluster leads to an inversion of the regulations. (C) A case of human mesomelic dysplasia Fryns type, where a duplicated and inverted HoxD cluster repositions one of the two copies of Hoxd13 in the C-DOM, directly in contact with proximal enhancers, likely leading to reduced and deformed radius and ulna (left and right arms in the right X-ray pictures). T-DOM and C-DOM enhancers and arrows, as well as the mouse fetus (left), are transparent, as they show the expected situations as inferred from data obtained in mice (see Bolt et al. 2021). Pictures in A and B are from Herault et al. (1997), and pictures in C are from Le Caignec et al. (2020).

Во всех зарегистрированных случаях мезомелической дисплазии человека, ассоциированной с 2q31, - типа Kantaputra (MDK) (Kantaputra et al. 2010) или типа Fryns (MDF; поражает только руки) (Le Caignec et al. 2020) - для объяснения дисплазии костей можно использовать одну и ту же объяснительную схему. Действительно, хромосомные перестройки, обнаруженные у этих пациентов, систематически указывают на повышенную регуляцию HOXD13 в клетках будущего предплечья, где этот ген не должен экспрессироваться (см. Bolt et al. 2021). В качестве примера можно привести одного пациента с MDF, несущего дуплицированную/инвертированную копию кластера HOXD, в результате чего HOXD13 оказывается вблизи zeugopodial энхансеров (рис. 1С; Le Caignec et al. 2020), что совпадает с тяжелой мезомелией обеих рук. Таким образом, структурное понимание регуляторной мутации Ul помогло объяснить структурные основы мезомелических дисплазий человека в 2q31. Однако оно не позволило однозначно доказать, что эктопические белки HOXD13 являются непосредственной причиной фенотипа, и не дало никакой информации о природе молекулярного механизма.
Эти вопросы удалось решить только после того, как технология CRISPR/Cas9 позволила реконструировать гипоморфный вариант мутации Ul с помощью сконструированной инверсии, размер которой был несколько больше. В результате удлинения инвертированного участка ДНК в инверсию было включено больше энхансеров, а значит, уменьшилось количество оставшихся на месте энхансеров (т.е. тех, которые могли нарушить регуляцию Hoxd13). Соответственно, сила Hoxd13 было гораздо слабее, и, следовательно, мутантные мыши имели менее тяжелые фенотипы. Поскольку их можно было выращивать как гомозиготное поголовье, были проведены дополнительные анализы (Bolt et al. 2021). Во-первых, направленная инактивация аллеля Hoxd13, содержащегося в инверсии, полностью устранила фенотип, показав, что патологический эффект действительно вызван исключительно эктопической экспрессией этого гена в будущих клетках zeugopod. Во-вторых, анализ одиночных клеток показал, что усиление функции Hoxd13 в клетках zeugopod вызывает умеренную транскрипционную даун-регуляцию генов Hox группы 11. Кроме того, было обнаружено, что эктопический белок HOXD13 занимает те участки связывания ДНК, которые обычно используются как Hoxa11, так и Hoxd11 для осуществления своей регуляторной функции в процессе формирования zeugopod, что свидетельствует о конкуренции с HOXD13 за эти участки связывания. Эти два аспекта в совокупности могут вызывать фенотип, фенокопирующий комбинированную потерю функции Hoxa11/Hoxd11 в клетках zeugopod.
Если мезомелическая дисплазия человека в области 2q31 связана с целым рядом сложных хромосомных перестроек (например, Dlugaszewska et al. 2006; Kantaputra et al. 2010; перечислены в Bolt et al. 2021), то мутация Ulnaless мыши является прототипическим примером простого генетического состояния, при котором ДНК не приобретается и не теряется, гены и энхансерные последовательности остаются нетронутыми, но изменение их относительной топологии оказывает серьезное влияние на важную морфологию. В данном случае изменяются только топологические отношения между различными элементами, каждый из которых сохраняет свою нормальную функцию, но в несоответствующем порядке, времени и пространстве.
The Liebenberg syndrome: a regulatory endoactivation


В 1973 г. южноафриканский ортопед F. Liebenberg впервые описал местную семью с аномалиями всех костных компонентов локтевого сустава, а также с различными неправильными формами костей запястья - все эти изменения передаются по аутосомно-доминантному типу (Liebenberg 1973). Однако только в 2012 и 2013 гг. было исследовано большее число семей с такими признаками и обнаружены структурные варианты вблизи локуса Pitx1 (Spielmann et al. 2012; Al-Qattan et al. 2013). Ген Pitx1 кодирует специфический для задней конечности паттерн-транскрипционный фактор (Lanctot et al. 1999), который, как было показано, направляет развитие зачатков задней конечности в сторону, характерную для ног (Szeto et al. 1999).
В 2012 г. Spielmann et al. (2012) дали подробное анатомическое описание этого генетического состояния, где назвали фенотип Liebenberg "гомеотической трансформацией руки в ногу". Они отметили, что "дистальный отдел плечевой кости напоминает дистальную головку бедренной кости, а проксимальный отдел локтевой кости - проксимальную головку большеберцовой кости"; также "плечевая кость имеет медиальный и латеральный мыщелки, разделенные межмыщелковой ямкой, напоминающей эпикондилы бедра в колене" и "...надколенник, сросшийся с дистальной головкой плечевой кости". Наконец, они отметили, что "суставная поверхность лучевой и локтевой костей была плоской и напоминала таковую у большеберцовой и малоберцовой костей". Кроме того, Spielmann et al. (2012) отметили, что организация костей запястья похожа на организацию костей лодыжки, а мягкие ткани кисти (сухожилия и мышцы) напоминают таковые на стопе.
Механистическая причина этой патологии была предложена на основе перестройки энхансера, который эктопически запускает экспрессию Pitx1 в развивающихся передних конечностях. Если в норме мРНК Pitx1 ограничена клетками зачатков задних конечностей, то эктопическая экспрессия должна была вызвать программу формирования ног в зачатках передних конечностей. Это было подтверждено принудительной транскрипцией Pitx1 в клетках зачатков передних конечностей, что привело к частичной трансформации руки в сторону морфологии, напоминающей ногу (DeLaurier et al. 2006; Spielmann et al. 2012). Это потенциальное объяснение вытекает из двух различных перекрывающихся делеций, связанных с синдромом Liebenberg, обе из которых удаляют гистоновый вариант, кодирующий ген H2afy, расположенный на 150 кб выше по течению от Pitx1 (рис. 2А). Эти делеции могли перенаправить предполагаемый энхансер конечности H2afy Hs1473 в сторону Pitx1, тем самым запустив его транскрипцию в развивающихся передних конечностях. Синдром Liebenberg также был вызван транслокацией, одна точка разрыва которой располагалась на 220 кб выше по течению от Pitx1, а другая - на хромосоме 18. Подобно делециям, эта хромосомная перестройка привела к тому, что два энхансера конечностей hs1464 и hs1440 оказались рядом с Pitx1.



Figure 2. Pitx1 regulation and the Liebenberg syndrome. (A) Wild-type organization of the Pitx1 locus, including the hs1473 (Pen) enhancer and the histone variant H2afy gene. A translocation breakpoint between chromosome 18 and 224 kb distal to Pitx1 is shown (arrow), as well as two similar deletions that were associated with Liebenberg syndrome patients (Spielmann et al. 2012). (B) In wild-type embryos, the Pitx1 locus adopts different configurations in forelimbs and hindlimbs. In forelimbs (red TAD structure above the locus), the locus disables the contacts between Pitx1 and the Pen enhancer (shadowed dot "Pitx1-Pen" on top), thus maintaining Pitx1 repressed. In hindlimbs (blue TAD structure below the locus), this enhancer-promoter contact is enforced (large arrow and black dot "Pitx1-Pen," below) and, consequently, Pitx1 is transcribed (blue limb bud in the embryo at the left). These two distinct configurations of the same locus determine the different arm and leg morphogeneses (drawings at the right). (C) In those mutations causing the Liebenberg syndrome, illustrated here with a deletion (del), an ectopic contact between the Pen enhancer and Pitx1 is formed in forelimb buds (large arrow and black dot "Pitx1-Pen" on top), similar to the situation in hindlimb bud cells (below). As a result, Pitx1 is expressed ectopically in forelimb buds (scheme at the left), and the development of the arm is altered, with several features resembling morphologies normally found in the legs such as an ectopic patella, a reduced olecranon, and a bowed radius (schemes at the right). In C, the "mutant" TAD structure is represented including the deletion (white space). In this case, the mutation suppresses the repression of Pitx1, leading to its endoactivation in forelimb bud cells. Micro-CT drawings at the right are taken from Kragesteen et al. (2018).

Развитие подходов chromosome conformation capture (3C) подтвердило, что частота физических взаимодействий энхансер-промотор в ядерном пространстве в целом коррелирует с их активностью (Dekker et al. 2002; Palstra et al. 2003). В дальнейшем это было подтверждено на уровне всего генома с помощью технологий capture промоторов в различных экспериментальных условиях in vivo (Javierre et al. 2016; Andrey et al. 2017; Freire-Pritchett et al. 2017). Кроме того, эксперименты с искусственным связыванием энхансеров и промоторов в локусе β-глобина показали, что петли хроматина важны для контроля экспрессии генов (Deng et al. 2014; Bartman et al. 2016). В локусе Pitx1 в развивающихся задних конечностях было обнаружено несколько контактов между Pitx1 и потенциальными энхансерами конечности на расстоянии 300 кб. Среди этих энхансеров была обнаружена последовательность Pen (или hs1473) (рис. 2Б), которая, как предполагалось ранее, стимулирует транскрипцию H2afy, а не Pitx1, но, как было показано, вносит вклад до 30% в экспрессию Pitx1, а ее делеция у мышей приводит к фенотипу косолапости (Kragesteen et al. 2018; Rouco et al. 2021). В связи с этим наблюдением возникла странная возможность того, что у пациентов с синдромом Либенберга именно перенаправление энхансера на свой собственный ген-мишень вызывает аномальную экспрессию последнего.
При введении конструкции Pen enhancer-reporter в экзогенный локус интенсивное окрашивание обнаруживалось как в задних, так и в передних зачатках конечностей, и не наблюдалась экспрессия, специфичная для задних конечностей. Аналогичный результат был получен при расположении сенсора lacZ рядом с последовательностью Pen, это свидетельствует о том, что регуляторный потенциал Pen не ограничивается клетками задней конечности и способен стимулировать экспрессию генов в зачатке передней конечности, что исключено при нормальном развитии. Таким образом, в делециях Liebenberg Pen эктопически управляет транскрипцией своего родственного (cognate) гена Pitx1 в несоответсивующей ткани, при этом появляются энхансерно-промоторные контакты, аналогичные тем, которые наблюдаются в клетках задней конечности (рис. 2С), - процесс, называемый "эндоактивацией" гена. Таким образом, в развивающихся передних конечностях мутанта Liebenberg энхансер Pen перестает быть изолированным от промотора Pitx1 и запускает эктопическую экспрессию, достаточную для возникновения глубоких морфологических изменений. Дополнительные генетические модификации локуса показали не только то, что абсолютное расстояние между промотором Pitx1 и Pen обеспечивает секвестрацию энхансера, но и то, что промотор H2afy способен ослаблять влияние энхансера Pen в зачатках передних конечностей (Kragesteen et al. 2019).
Спустя 50 лет после первого сообщения о синдроме Liebenberg были идентифицированы различные генетические элементы, участвующие в его молекулярной этиологии, и детально охарактеризованы различия в структуре и функции локуса Pitx1, наблюдаемые в контрольных и мутантных условиях. Однако точная причина (причины) того, что мешает Pitx1 реагировать на Pen в зачатках передних конечностей, до сих пор точно не установлена. Хотя и виновник, и орудие убийства известны, полного представления о том, как это происходит, пока нет.
Acheiropodia: same culprit, distinct modi operandi


Локус sonic hedgehog (Shh), связанный с ним регуляторный ландшафт длиной 1 Мб и несколько мутаций у мышей и человека стали богатым источником открытий, в частности, в области дальнодействующей регуляции генов. О локусе Shh и его значении для развития конечностей было сообщено в 1993 году (Riddle et al. 1993). Вскоре после этого ген SHH человека был картирован на хромосоме 7q36 (Marigo et al. 1995), рядом с локусом болезни полисиндактилии (Heutink et al. 1994; Tsukurov et al. 1994), но отдельно от него. Мышиный конгенный ген был картирован в синтенической области хромосомы 5, близкую к мутации гемимелические экстра-пальцы (Hx) - мутации, известной с 1967 года (см. Knudsen and Kochhar 2010). В 1996 г. направленная инактивация Shh привела к появлению мышей с фенотипом acheiropodia (Chiang et al. 1996), т.е. отсутствием как cheiros (рук), так и podos (ног) - состояние, гораздо более тяжелое, чем полидактилия, вызванная генами заболеваний, картированными вблизи Shh как у людей, так и у мышей, и поэтому эти состояния оставались причинно разделенными.
Однако в 1995 г. в связи с наблюдаемой передней эктопической экспрессией Shh в зачатках конечностей Hx была предложена возможность косвенного влияния мутации Hx на регуляцию Shh (Masuya et al. 1995), но первой явной регуляторной мутацией, непосредственно влияющей на Shh и вызывающей морфологическую аномалию конечности, стала вставка трансгена, приведшая к так называемому состоянию "снежного человека" (Ssq) (Sharpe et al. 1999). Исследователи предположили, что эта мутация затрагивает специфический регуляторный элемент конечности, контролирующий Shh на расстоянии, - гипотеза была навеяна ранее обнаруженным мозговым энхансером Shh, расположенным на расстоянии 260 кб от гена-мишени (Belloni et al. 1996). Точное картирование полудоминантной мутации Ssq у мыши выявило событие инсерции/дупликации в интроне 5 гена Lmbr1, расположенном на расстоянии ~1 Мб от Shh (рис. 3А,Б), в том же синтенном интервале, где находится точка разрыва транслокации, обнаруженная у пациента с полидактилией (Lettice et al. 2002). В том же исследовании цис-транс генетический тест с использованием Ssq показал, что данная мутация действует в цис-положении на ген Shh и, следовательно, сам ген Lmbr1 не вовлечен в различные аномальные фенотипы (Lettice et al. 2002).

Figure 3. Shh long-range limb regulation and acheiropodia. (A) Shh transcription in limb buds is controlled by a long-range interaction (green arrow) between the ZRS (green oval), which is localized within exon 5 of the Lmbr1 gene, at the boundary of the TAD (green; on top), and the Shh promoter (blue arrow) located at the other end of the TAD. Shh is transcribed in the posterior-distal part of the limb buds (scheme in the middle), leading to normal digit number and limb morphology (foreleg skeleton at the right). (sc) Scapula, (hu) humerus, (ra) radius, (ul) ulna. (B) In the mouse Sasquatch mutant, a duplication of the Lmbr1 intron containing the ZRS, together with a transgene insertion (enlargement below), induces an ectopic anterior Shh expression domain, leading to polydactyly. (C) A homozygous deletion within the Lmbr1 gene also containing the ZRS leads to acheiropodia in human patients (X-rays at the right), reproducing the phenotype obtained when the mouse ZRS is deleted. The human condition is thus likely due to a complete loss of function of Shh in limb buds (suggested in the scheme in the middle). (D) The same acheiropodia phenotype is observed in human patients where three CTCF binding sites close to the intact ZRS were included in a short indel. This deletion enables the binding reallocation of CTCF around SHH toward CTCF sites located closer, thus inducing an ectopic boundary (vertical arrow) forming a smaller TAD (green) and isolating the ZRS from the SHH promoter. This likely results in a loss of ZRS-SHH interaction in the limb buds and a full loss of SHH expression there (suggested in the scheme in the middle), accounting for the absence of distal extremities (pictures at the right). (E) The acheiropodia phenotype is also obtained in mice after a partial inversion (black arrows) of the Lmbr1 gene that relocates the ZRS in the neighboring TAD (red) by shifting the position of the boundary closer to Shh due to the presence of ectopic CTCF sites (vertical arrow). There again, the inability of the ZRS to contact Shh induces a full loss of Shh expression (scheme in the middle) and the concurrent phenotype (skeletal preparation at the right). (sc) Scapula, (hu) humerus, (vzg) fused zeugopod. In C-E, the same phenotypes are produced using totally different mechanisms. Pictures in A are from Symmons et al. (2016), and pictures in B are from Sharpe et al. (1999). Pictures in C are reprinted from Shamseldin et al. (2016) with permission from John Wiley and Sons. Pictures in D are from Ianakiev et al. (2001), © 2001, with permission from Elsevier. Pictures in E are from Symmons et al. (2016).

В 2003 г. был охарактеризован эволюционно консервативный энхансер Shh, специфичный для конечностей (ZRS), расположенный в интроне 5 Lmbr, и было показано, что несколько пациентов с полидактилией человека несут точечные мутации в этой последовательности ZRS. Кроме того, в конце концов, была установлена причина полидактилии Hx - одиночная замена G на A в ZRS (Lettice et al. 2003). Окончательная демонстрация того, что ZRS является единственным энхансером конечности, действующим на Shh, стала его направленная делеция у мышей, которая привела к фенотипу ахейроподии, сходному с тем, который возникает при инактивации самого Shh (Sagai et al. 2005). Соответственно, было установлено, что мутации ZRS, приводящие к полидактилии, вызывают усиление экспрессии Shh в передних отделах зачатков конечностей, что, вероятно, связано с его транскрипционной депрессией в этих передних клетках (Lettice et al. 2003).
Ахейроподия существует и в человеческой популяции. Впервые об этой крайне редкой врожденной ампутации всех конечностей было сообщено около века назад в бразильской семье, у четырех членов которой наблюдался полный агенезис кистей/пальцев, сопровождавшийся редукцией мышечных структур на конечностях длинных костей (Peacock 1929). Впоследствии, с конца 1950-х годов до 1975 года, было зарегистрировано несколько бразильских семей с аналогичными фенотипами. Было установлено, что передача заболевания происходит по аутосомно-рецессивному типу, и многие семьи были кровнородственными (Koehler et al. 1956; Freire-Maia et al. 1975). Однако, несмотря на столь впечатляющий аспект, генетическое происхождение этого порока развития у человека оставалось неизвестным до 2016 г., когда у пациента с ахейроподией, не связанного с этими бразильскими случаями, была обнаружена делеция в 7q36, содержащая экзоны 1-16 гена Lmbr1, т.е. включающая ZRS (Shamseldin et al. 2016) - фенотип полностью совпадает с делецией ZRS у мышей (рис. 3C; Sagai et al. 2005).
Однако удивительно, что у бразильских пациентов с сопоставимым фенотипом ахейроподии (рис. 3D; Ushiki et al. 2021) ZRS оказалась присутствующей и не модифицированной, и этот парадокс удалось разрешить только с помощью современных представлений, полученных на основе анализа трехмерного генома. Действительно, методы conformation capture хромосом и ДНК-FISH выявили как пространственную близость ZRS и гена Shh, так и присутствие этих двух последовательностей на обоих концах одного и того же TAD (Amano et al. 2009; Symmons et al. 2016; Williamson et al. 2016). Более того, релокализации пограничного элемента TAD между геном Shh и энхансером ZRS оказалось достаточно для блокирования их связи, что привело к появлению ахейроподии (рис. 3E, стрелка; Symmons et al. 2016). Это взаимодействие между ZRS и Shh, по-видимому, в значительной степени опосредовано несколькими CTCF, присутствующими на обеих границах TAD. Хотя удаление сайтов связывания CTCF вблизи ZRS не приводит к появлению аномального фенотипа конечности, оно вызывает снижение экспрессии Shh (Paliou et al. 2019; Williamson et al. 2019). Однако сочетание таких делеций CTCF с частичной потерей функции ZRS приводит к фенотипу, похожему на ахейроподию, что свидетельствует о необходимости CTCF-опосредованных энхансер-промоторных контактов для достижения нормальной экспрессии Shh (Paliou et al. 2019).
В бразильских семьях c ахейроподий обнаружена гомозиготная делеция, включающая три сайта CTCF, непосредственно ниже по течению от ZRS, который остается интактным (рис. 3D). Исходя из предыдущих знаний, отсутствие этих CTCF-сайтов не должно сильно нарушать взаимодействие SHH-ZRS. Однако потеря CTCF-сайтов способствовала перераспределению CTCF-взаимодействий с другими CTCF-сайтами, расположенными между SHH и ZRS, что привело к образованию новой якорной петли с участием промотора SHH. Эта новая петля образует эктопическую границу, отводя промотор SHH от ZRS, что приводит к появлению фенотипа ахейроподии (рис. 3D, стрелка; Ushiki et al. 2021). Важно отметить, что это геномное состояние не может быть воспроизведено у мышей, поскольку три сайта связывания CTCF, удаленные в локусе человека, не являются консервативными у грызунов (Ushiki et al. 2021). Действительно, в мышином локусе Shh распределение сайтов CTCF, участвующих в создании границы, совершенно иное.
Это долгое и извилистое исследование позволило сделать несколько важных выводов, касающихся тканеспецифической регуляции генов в процессе развития. Во-первых, энхансерные последовательности могут располагаться очень далеко от целевого промотора, если трехмерная структура генома позволяет или способствует продуктивным взаимодействиям. Как следствие, одни и те же тяжелые генетические нарушения могут быть получены разными способами, либо путем воздействия (удаления) на энхансерную последовательность, либо путем предотвращения ее взаимодействия с целевым промотором - один и тот же эффект достигается разными способами. Наконец, если структура/функция энхансера ZRS сама по себе хорошо сохранилась у позвоночных, то механизм ее контакта с целевым промотором может несколько различаться даже у млекопитающих, поскольку в конечном итоге важно, что взаимодействие происходит, а не то, как оно происходит.
Genomic commensalism at the Gremlin locus


Энхансер ZRS для Shh расположен в интроне 5 гена Lmbr1, который, вероятно, кодирует трансмембранный рецептор для lipocalin, и эта функция не связана напрямую с функцией, выполняемой гостевым энхансером. Эта ситуация практически уникальна, и у ряда генов, важных для развития позвоночных, один или несколько энхансеров находятся в интронах расположенных рядом генов, обычно не связанных по своим функциям (Borsari et al. 2021). Это часто приводило к путанице при попытке идентифицировать гены, на которые влияет та или иная регуляторная мутация, и примером тому может служить локус Gremlin1/Formin1 - крайний случай такого геномного комменсализма.
В 1985 году в лаборатории Phil Leder (Woychik et al. 1985) были получены трансгенные мыши с характерным фенотипом конечностей. Трансгенная вставка была картирована на хромосоме 2, рядом с двумя мутациями деформации конечностей (ldJ и ldOr), о которых ранее сообщалось в 1960 и 1962 годах (см. Vogt et al. 1992) и которые проявляли сходную деформацию конечностей. Тест на комплементацию показал, что вставка трансгена является аллельной, и поэтому новая мутация была названа ldHd (Woychik et al. 1985) (впоследствии ldTgHd). В 1990 г. в двух сопутствующих исследованиях, проведенных в той же лаборатории, был идентифицирован ген, присутствующий в этом локусе, и показано, что он нарушен в аллеле ldHd (Mass et al. 1990; Woychik et al. 1990). Первоначально этот ген был назван геном limb deformity (ld), а впоследствии переименован в Formin (Fmn1). Было показано, что он содержит ряд экзонов и продуцирует несколько изоформ белка, получивших общее название "формины" (Woychik et al. 1990; Wang et al. 1997).
У мышей, гомозиготных по аллелю ld, наблюдаются тяжелые пороки развития конечностей, в том числе синостоз zeugopod, а также олигосиндактилия или синдактилия пястных костей (см. Zeller et al. 1999). В таких мутантных зачатках конечностей нарушается дистальная эпителиально-мезенхимная сигнализация, которая в норме регулирует рост и развитие конечности (Haramis et al. 1995). Эта передача сигналов включает в себя пути Fgfs и Bmps, которые участвуют в создании и поддержании петли обратной связи SHH/FGF4, необходимой для осуществления роста и формирования структуры зачатка конечности (см. Zuniga and Zeller 2020). Неожиданно, однако, что ни один из этих пенетрантных фенотипов ldTgHd не наблюдался при инактивации некоторых изоформ гена Fmn1 путем гомологичной рекомбинации (Wynshaw-Boris et al. 1997; Chao et al. 1998), что заставляет усомниться в реальной функции гена Fmn1.
Этот парадокс был разрешен в 2003-2004 гг. после появления ряда новых наблюдений за структурной и функциональной организацией локуса Fmn1. Во-первых, секвенирование генома показало, что соседом Fmn1 является ген Gremlin (Grem1), расположенный всего в 40 кб от него и транскрибирующийся в противоположном направлении (рис. 4А, вверху; Khokha et al. 2003; Zuniga et al. 2004). Grem1 был выделен как член семейства белков, противодействующих передаче сигналов BMP (Hsu et al. 1998), и идентифицирован как мезенхимный сигнал в конечности, способный ретранслировать передачу сигналов Shh в апикальный эктодермальный гребень (AER), где экспрессируются BMP. Кроме того, трансплантация клеток, экспрессирующих Grem1, в конечности мутанта limb deformity восстанавливала прерванную в противном случае петлю SHH/FGF4 (Zu'niga et al. 1999). Во-вторых, инактивация Grem1 в эмбрионах мыши подтвердила его существенную роль в развитии конечности (Khokha et al. 2003; Michos et al. 2004), при этом не происходит правильного формирования функционального AER, что, в свою очередь, влияет на распространение экспрессии Shh из поляризующей области, что также наблюдалось в зачатках конечностей ld-мутантов (Michos et al. 2004). Кроме того, инактивация Grem1 влияет и на морфогенез других органов, например на индукцию метанефрических почек, что также сходно с мутацией ld.



Figure 4. Genomic commensalism at the Grem1 locus. (A) Organization of regulations at the mouse Grem1 locus, with Formin (Fmn1; blue) and Gremlin1 (Grem1; green) transcribed in opposing directions (arrows on the start sites). These two genes are present in a single TAD, but divided into several subTADs including a "Grem1 subTAD" (green triangles at the top). The limb deformity (ldTgHd) transgene integration is indicated at the top, as well as two other mutations (ldOr and ldJ) affecting the Grem1 coding sequences and splicing, respectively. Grem1 transcription is controlled by a global control region (GCR) as well as by several more distal enhancers (blue ovals), all located within the Fmn1 transcription unit. Below are depicted some deletions in mice that affect Grem1 transcription, with the severity of the phenotype suggested in the column at the right. Two deletions induce full loss of Grem1 expression [?1-24 and ?cis(10-24)], whereas the DeltaEC1(GCR) leads to a partial Grem1 loss of function only. The DeltaEC2 decreases the mRNA level but does not show any skeletal phenotype, whereas the deletion of the Fmn1 exon 9 (?Ex9) was reported to induce a severe Ld phenotype. (B) The organization of the human locus is virtually identical to the murine counterpart. A deletion within the Fmn1 gene, which removes the equivalent of murine enhancers 5-9 acting over Grem1 (del), induces oligosyndactyly and radio-ulnar synostosis; i.e., part of the Grem1 phenotype.

Окончательное подтверждение того, что мутации ld являются аллельными по отношению к Grem1, было получено с помощью комплементационных тестов, в которых мутантные мыши Grem1 скрещивались с аллелями ldJ, ldOR или ldln2 для проверки фенотипического восстановления (Khokha et al. 2003; Zuniga et al. 2004). Поскольку аллели не будут дополнять друг друга, Khokha et al. (2003) написали: "...мы склоняемся к идее, что картированные мутации ld влияют на Gremlin напрямую и что они расположены в цис-регуляторных элементах для экспрессии Gremlin". Этот общий вывод оказался верным для нескольких аллелей ld, включая трансгенные инсерции, которые действительно расположены в пределах фланкирующего Gremlin регуляторного ландшафта, перемежающегося внутри интронов Fmn1 (рис. 4А). Однако точный аллель ldJ, использованный для этого вывода (Khokha et al. 2003), сам по себе не является регуляторной мутацией, а представляет собой точечную мутацию, влияющую на сплайсинг РНК Gremlin, что приводит к укорочению белка (рис. 4А; Zuniga et al. 2004). Аналогичным образом аллель ldOR был охарактеризован как делеция ORF Gremlin, это указывает на то, что группа комплементации Gremlin охватывает как гены Fmn1, так и Gremlin1 (Zuniga et al. 2004). Мутации, расположенные либо внутри Gremlin и влияющие на его структуру, либо внутри гена Fmn1 и изменяющие регуляцию Grem1 на расстоянии, получили общее название ld-аллелей.
Важно отметить, что гены Grem1 и Fmn1 расположены в одном и том же TAD длиной 450 кб, разделенном на два субTAD Fmn1 и Grem1 (рис. 4, вверху; Malkmus et al. 2021). Ген Fmn1, в частности его 3' область, расположенная в "субTAD Grem1", наполнена регуляторными элементами, большинство из которых картируются на 180-килобайтном участке, делеция которого ранее серьезно нарушила экспрессию Grem1 в зачатках конечностей (del10-24 в Zuniga et al. 2004, 2012; переименован в delCis у Malkmus et al. 2021). По этому региону рассеяно до девяти регуляторных последовательностей, несколько из которых демонстрируют подмножество паттерна экспрессии Grem1 при использовании в качестве трансгенов (Malkmus et al. 2021), что свидетельствует о том, что ген Fmn1 является настоящим энхансером для соседнего с ним гена Grem1, представляя собой экстремальную ситуацию геномного регуляторного комменсализма. Частичная избыточность этих элементов была также продемонстрирована пространственно различающейся, но прогрессирующей потерей экспрессии Grem1 у мутантов ?EC1 (ранее называвшихся GCR) и &Delta:EC2, делегирующих только часть его энхансера (рис. 4А; Malkmus et al. 2021; Zuniga et al. 2004). Хотя функции нескольких таких энхансеров Grem1 в настоящее время расшифрованы, интересно отметить, что в исторической перспективе влияние на транскрипцию Grem1 инсерционных мутаций ldTgHd, с которых началась вся эта работа, до сих пор не выяснено.
Такое функциональное описание регуляции Fmn1-Grem1 помогло пролить свет на случай с пациентом с признаками олигосиндактилии четырех конечностей, радиально-ульнарным синостозом, потерей слуха и односторонней аплазией почек, у которого ранее был диагностирован порок развития кисти-ноги (Debeer 2004; Dimitrov et al. 2010, 2011). Геномный анализ выявил делецию длиной~250 кб, охватывающую 5' часть гена Fmn1 на хромосоме 15, и, следовательно, вероятной причиной этого состояния является регуляторная мутация в Grem1 (рис. 4В). Однако, хотя эта делеция и включает некоторые из интронных энхансеров Grem1 в Fmn1 (5-9), как описано в работе Malkmus et al. (2021), она не охватывает область, которая, как сообщалось ранее, является глобальной контрольной областью (GCR/EC1), участвующей в транскрипции Grem1 в мышиных конечностях (Zuniga et al. 2004). Кроме того, в то время как делеция у человека вызывает сильный фенотип, делеция у мышей большинства энхансеров, присутствующих в человеческой Del, не показала никаких явных фенотипических изменений (рис. 4В, ΔEC2), что свидетельствует о возможных различиях в дозовых эффектах у разных видов.
Вопрос о необходимости или адаптивной ценности расположения таких энхансерных последовательностей в интронах соседнего гена остается открытым. Хотя это особенно хорошо видно на примере локуса Grem1, практически идентичная ситуация существует в локусе глобина, где несколько глобиновых генов контролируются "суперэнхансером" - рядом мощных энхансеров, расположенных в нескольких интронах гена Nprl3 (Hughes et al. 2005). Такая своеобразная организация генома присутствует и у миног и, по-видимому, имеет давнее эволюционное происхождение, предшествующее разделению агнатостомов и гнатостомов (Miyata et al. 2020).
Одно из возможных объяснений заключается в том, что продолжающаяся транскрипция гена-хозяина может позволить этим регуляторным областям быть более легкодоступными, когда это функционально необходимо (Borsari et al. 2021). Кроме того, внутригенные энхансеры могут выступать в качестве альтернативных промоторов, способствуя образованию изоформ, представляющих потенциальный функциональный интерес (Kowalczyk et al. 2012). Это транскрипционное требование может пролить свет на эффект другой хромосомной перестройки в локусе Fmn1/Grem1, которая пока не согласуется с нашим современным функциональным пониманием регуляции Grem1. Действительно, при направленной делеции экзона 9 мышиного Fmn1, который, как предполагается, не содержит критических энхансеров Grem1, был получен четкий фенотип ld (Zhou et al. 2009). Северный блот-анализ показал отсутствие мРНК Fmn1 при использовании зондов, направленных против экзонов, расположенных выше по течению, что указывает на пагубное влияние этой делеции либо на продукцию мРНК Fmn, либо на ее стабилизацию (Zhou et al. 2009). С этой точки зрения потенциальное изменение транскрипции нисходящей части гена Fmn1 могло бы привести к ослаблению активности встроенного энхансера. Несмотря на правдоподобность такой возможности, для ее проверки потребуются функциональные тесты in vivo, поскольку подобные гипотезы были рассмотрены в других локусах с противоречивыми результатами (Anderson et al. 2016; Paliou et al. 2019). Топология локуса Fmn1/Grem1 может сделать его идеальной платформой для окончательного понимания этого вопроса, представляющего общий интерес для регуляторного генома.
Transposons and lncRNAs-novel tools to reopen cold cases?


Некоторые из "классических" спонтанных мутаций у мышей долгое время оставались "холодными случаями", причем не обязательно из-за отсутствия соответствующих технологий, а в основном из-за наших неполных знаний в отдельных аспектах регуляции генов. Например, возрастающее значение транспозонов и длинных некодирующих РНК (lncRNAs) как регуляторных факторов в процессе развития позволило вновь открыть несколько закрытых дел. Что касается важности транспозонов, то в качестве примера можно привести мутантных мышей Dactylaplasia (Dac). Мыши Dac были впервые описаны в 1981 году как аутосомно-доминантное заболевание, обусловленное двумя аллелями: мутантным геном (Dac) и аллелем-модификатором (mdac) (Chai 1981). У мутантных мышей дефект поддержания AER зачатка конечности приводит к потере фаланг, а также к укорочению или сращению пястных и плюсневых костей (Sidow et al. 1999).
В 1999 г., а затем в 2008 г. аллели Dac1J и Dac2J были постепенно картированы как интеграции транспозонов MusD в интервал Fgf8-Fbxw4 и в ген Fbxw4, соответственно (Sidow et al. 1999; Friedli et al. 2008), т.е. вблизи гена Fgf8, необходимого для правильного функционирования AER (Moon and Capecchi 2000). Аллель mdac, напротив, либо обеспечивает, либо исключает проявление фенотипа Dac у разных штаммов мышей и, по-видимому, модулируя экспрессию в AER транспозона MusD (Johnson et al. 1995; Kano et al. 2007). В итоге аллель mdac был картирован в повторяющемся участке хромосомы 13, где в пермиссивных аллелях, по-видимому, отсутствуют несколько генов KRAB-ZFP (Kano et al. 2007; http://archiv.ub.uni-heidelberg.de/volltextserver/12753/1/diss_AktasT_2011.pdf). Несмотря на то, что за последние десятилетия был достигнут определенный прогресс как в картировании, так и в изучении последствий мутации Dac для развития, молекулярный механизм, лежащий в основе патогенности транспозона, до сих пор не ясен. Правдоподобной гипотезой является то, что транспозон перехватывает локальную регуляцию Fgf8 для собственной транскрипции, что приводит к аномальному AER, как это было предложено Kano et al. (Crackower et al. 1998; Kano et al. 2007).
Аналогичным образом, мутация полудоминантной гемимелии (Dh) у мышей остается "холодным случаем" с тех пор, как она была описана в 1954 году (Carter 1954) и отнесена к группе "luxoid" мутаций, поражающих мышей (Grüneberg 1963; Searle 1964). У мутантных животных поражаются преаксиальные стороны задних конечностей, происходит потеря голени и передних пальцев вследствие уменьшения ширины зачатка конечности. Примечательно, что передние конечности в этом случае остаются нормальными, что в остальном является весьма плейотропным состоянием (Searle 1964; Lettice et al. 1999). Хотя мутация Dh была картирована вблизи локуса Engrailed1 (En1) (Martin et al. 1990), некоторые рекомбинационные события (четыре из 563, т.е. расстояние ~500-700 кб) позволили предположить, что она не является аллельной по отношению к последнему гену (Higgins et al. 1992). Кроме того, последующая направленная инактивация En1 выявила изменения в конечностях, весьма отличные от тех, которые были обнаружены у Dh-мутантных мышей (Wurst et al. 1994; Loomis et al. 1996), что в конечном итоге позволило исключить En1 из числа причин Dh-фенотипа.
Спустя 30 лет после того, как был решен случай мутации мыши Dh, было зарегистрировано три человеческих пациента с гемимелией - почти полным отсутствием голени, приводящим к укорочению ног, синдактилии и наличию ногтей на пальмарной стороне нескольких пальцев (рис. 5А; Allou et al. 2021) - редкий фенотип, вероятно, обусловленный проблемой организации дорсо-вентральной полярности конечностей. У этих людей были выявлены небольшие гомозиготные и перекрывающиеся делеции длиной 27-63 кб в 300 кб выше по течению от человеческого гена En1 (рис. 5Б; Allou et al. 2021), необходимого для дорсо-вентрального паттернинга зачатков конечностей (Loomis et al. 1996). Эти делеции не включали ни одной известной кодирующей последовательности, но включали lncRNA под названием Maenli (рис. 5Б), которая у мышей транскрибируется именно в эктодерме развивающихся зачатков конечностей, где работает En1 (рис. 5С; Loomis et al. 1996). Сопоставимый фенотип конечностей был обнаружен еще у одного пациента, у которого наблюдалась мутация с потерей функции в гене En1, что подтверждает предположение о связи между делетированной lncRNA и регуляцией En1 (рис. 5А, внизу; Allou et al. 2021).



Figure 5. Severe limb alterations associated with the lncRNA Maenli at the Engrailed1 locus. (A) Documentation of two patients with Engrailed1 (En1)-related loss-of-function phenotypes. Patients 3 and 4 display a strong hemimelia in their legs (X-ray pictures), as well as more distal defects. Patient 3 had an intact En1 gene, whereas patient 4 had a structural mutation within En1 and hence displayed the full range of En1-related phenotypes. In contrast, patients 1-3 had limb-specific phenotypes only, associated with regulatory mutations. (B) At the top is the wild-type En1 locus structure, including the Maenli lncRNA that lies within the same TAD as En1 (blue). In the middle is a scheme showing the genomic interval including the deletions found in the three human patients (including patient 3, shown in A). At the bottom are the schemes of the two targeted inactivations of Maenli-one deleting its transcription start site (TSS), while the other has an integration of three premature transcription termination signals (STOP). (C) At the top is a schematic of the ventral ectoderm-specific expression (in blue) of both En1 and Maenli in control limb buds, whereas all conditions shown in the bottom of B lead to a loss of En1 expression there. Pictures of patients are taken from Allou et al. (2021).

Изначально lncRNAs определялись как РНК длиной более 200 nt, обычно сплайсированные и не имеющие четкой открытой рамки считывания (Kopp and Mendell 2018; см. недавнее обновление их определения и классификации в Mattick et al. 2023). Они широко распространены среди млекопитающих и обычно плохо закрепляются в последовательности от одного вида к другому (Hon et al. 2017). Хотя в большинстве случаев их функция остается неясной (см. Bassett et al. 2014), некоторые из них участвуют в ключевых биологических процессах, включая регуляцию генов (Engreitz et al. 2016; Mattick et al. 2023). Например, было показано, что lncRNA Fendrr играет важную и обучающую роль в процессе дифференцировки боковой пластинки мезодермы и сердца (Grote et al. 2013). В отличие от этого, другие lncRNAs, по-видимому, достигают своих функций более пассивно, будучи транскрибируемыми, а не благодаря своим внутренним функциональным значениям, как это показано на локусе Hand2, где две lncRNAs Upperhand (Uph) и Handsdown (Hdn) необходимы для эмбриональной жизнеспособности и для контроля транскрипции Hand2 во время развития сердца (Anderson et al. 2016; Ritter et al. 2019). В то время как Uph может активировать сердечные энхансеры, транскрипция Hdn, как предполагается, контролирует трехмерные хроматиновые взаимодействия между Hand2 и его энхансерами. Аналогичным образом, стартовый сайт lncRNA Hotdog был вовлечен в запуск хроматиновых взаимодействий в локусе HoxD (Delpretti et al. 2013), что свидетельствует о том, что цис-активируемые lncRNAs могут действовать несколькими способами.
Способ действия Maenli был изучен на мышах после того, как была сконструирована делеция, удаляющая участок, гомологичный минимальному интервалу, удаленному у пациентов-людей. Эта делеция вызывает сопоставимый фенотип, затрагивающий дорсо-вентральную полярность конечностей, хотя гемимелия задней конечности, по-видимому, не наблюдалась. У таких мышей экспрессия En1 в зачатке конечности была практически полностью подавлена (рис. 5С; Allou et al. 2021). Аналогичный фенотип наблюдался и при введении сигналов терминации транскрипции сразу после стартового сайта, что приводило к блокированию транскрипции Maenli без удаления какого-либо участка локуса (рис. 5В). Таким образом, исследователи предположили, что сам по себе процесс транскрипции, независимо от того, что именно транскрибируется, может быть необходим для лицензирования регуляторного ландшафта En1 для активации. Отсутствие транскрипции Maenli приводит к неактивному ландшафту и одновременному отсутствию транскрипции En1.
Этот пример показывает, как ранее неаннотированная lncRNA, расположенная на расстоянии 300 кб от гена, известного своей ролью в формировании зачатков конечностей, может быть важна для тканеспецифической экспрессии этого гена в процессе развития, а также для выяснения тяжелого врожденного порока у человека. Это также позволяет предположить, что огромное количество не-кодирующих РНК, распределенных по геномам млекопитающих (Hon et al. 2017; Mattick et al. 2023), может позволить в будущем вновь открыть некоторые "холодные" генетические кейсы. В случае мышиной мутации Dh, которая также расположена вблизи En1 и демонстрирует сопоставимые изменения (хотя и отличные в ряде аспектов), до сих пор неясны как ее структурная природа, так и затронутый ген, а значит, и решение проблемы еще не найдено. Несомненно, эта проблема будет решена в ближайшие несколько лет либо путем секвенирования мутантной хромосомы Dh, либо в ожидании появления новой омической технологии, которая укажет на возможный механизм. В качестве альтернативы можно выделить новых пациентов с гемимелией, картирующейся в этом хромосомном интервале и не вовлекающей напрямую ни ген Maenli, ни ген En1.
Conclusion


Появление гомологичной рекомбинации в ES-клетках, постепенно замененной 30 лет спустя подходами на основе CRISPR/Cas9, позволило генетикам практически неограниченно производить направленные модификации генома млекопитающих, за исключением, пожалуй, некоторых очень крупных и сложных хромосомных перестроек. Однако, как следствие, на смену прежним техническим ограничениям пришли наши ограниченные возможности по представлению и планированию нужных модификаций для понимания того или иного биологического явления. В случае регуляции генов развития наши современные функциональные подходы (делеции/мутации энхансеров, трансгенез или инверсии) следуют нашей собственной логике и предубеждениям, которые не всегда применимы к миллионолетним эволюционным манипуляциям, формирующим различные локусы для адаптации их транскрипционного выхода в различных онтогенетических ситуациях.
В этом контексте неоценимый интерес представляет изучение как старых мутаций, полученных с помощью генетических скринингов или спонтанно возникающих в колониях животных, так и человеческих пациентов, демонстрирующих особенно яркие врожденные фенотипы, поскольку случайные события, происходящие независимо от всего экспериментального плана, часто позволяют по-новому взглянуть на различные вопросы, на которые необходимо найти ответ. В этой связи важно стараться по возможности заново открывать "холодные" генетические случаи. Тот факт, что эффекты многочисленных мутаций развития у мышей до сих пор не раскрыты, позволяет предположить, что они не связаны со структурными изменениями в известных генах. Вместо этого они, скорее всего, вмешиваются в сложные регуляторные механизмы, подобные тем, которые были продемонстрированы в описанных выше случаях. Многие из основных понятий, используемых сегодня для понимания дальнодействующей регуляции генов, вытекают из этого подхода.
Исследование полученных ранее мутаций или полученных в результате генетического скрининга или возникших спонтанно в колониях животных и у пациентов, обладающих особенно яркими врожденными фенотипами неоценимо в этом контексте, поскольку случайные события, возникающие независимо от всех экспериментальных подходов часто предоставляют новую информацию, помогающую ответить на важные вопросы. В этой связи, важно попытаться повторно открыть по возможности холодные генетические случаи. Тот факт, что многочисленные онтогенетические мутации у мышей пока не поняты указывает на то, что они не участвуют в структурных альтерациях известных генов, они скорее всего взаимодействуют со сложными регуляторными механизмами, такими как те, что были описаны в случаях, описанных выше. Многие из важных концепций используются сегодня для понимания широких рангов регуляции генов, исходя из этого подхода и даже одиночных случаев, которые помогут успешно пополнить этот, находящийся в разработке, набор знаний.