• Metabolomic profiling reveals maternal hyperglycemia impacts fetal metabolism

• Sorbitol accumulates in fetal tissues from hyperglycemic dams

• 13C-glucose tracing shows maternal hyperglycemia alters fetal nutrient sourcing

• Histidine-derived metabolites accumulate in late-stage fetal tissues

Mounting evidence suggests metabolism instructs stem cell fate decisions. However, how fetal metabolism changes during development and how altered maternal metabolism shapes fetal metabolism remain unexplored. We present a descriptive atlas of in vivo fetal murine metabolism during mid-to-late gestation in normal and diabetic pregnancy. Using 13C-glucose and liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS), we profiled the metabolism of fetal brains, hearts, livers, and placentas harvested from pregnant dams between embryonic days (E)10.5 and 18.5. Our analysis revealed metabolic features specific to a hyperglycemic environment and signatures that may denote developmental transitions during euglycemic development. We observed sorbitol accumulation in fetal tissues and altered neurotransmitter levels in fetal brains isolated from hyperglycemic dams. Tracing 13C-glucose revealed disparate fetal nutrient sourcing depending on maternal glycemic states. Regardless of glycemic state, histidine-derived metabolites accumulated in late-stage fetal tissues. Our rich dataset presents a comprehensive overview of in vivo fetal tissue metabolism and alterations due to maternal hyperglycemia.

Питание матери и развитие плода неразделимы. Диетические мероприятия во время беременности способствуют укреплению здоровья матери и снижают частоту возникновения пороков развития плода. Например, добавки железа предотвращают внутриутробное ограничение роста во время беременности, а добавки фолиевой кислоты снижают частоту возникновения дефектов нервной трубки плода.^1,2 Однако мало что известно о том, как формируется метаболизм плода во время развития и как распространенные клинические состояния, влияющие на материнский метаболизм, влияют на развивающийся плод. Недавние исследования начали характеризовать метаболическую пластичность в предимплантационном эмбрионе мыши³ и компартментализацию в течение дней эмбриогенеза (E)9.5-13.5.⁴ Но метаболизм плода в середине и конце беременности, когда плод приближается к завершению формирования независимой системы кровообращения, остается неизученным.

Материнский диабет является растущей клинической проблемой в США и во всем мире: показатель заболеваемости диабетом среди беременных на 1000 живорожденных в США вырос с 47,6 в 2011 году до 63,5 в 2019 году.⁵ Эта неблагоприятная тенденция обусловлена увеличением частоты диабета беременных и диабета 2 типа у молодых пациенток до беременности. Материнская гипергликемия ассоциируется с 4-кратным увеличением риска врожденных пороков сердца и повышенным риском дефектов нейрального развития.^6-8 Ранее мы обнаружили, что высокий уровень глюкозы нарушает созревание сердца in vitro из-за избыточного метаболизма нуклеотидов.⁹ Однако влияние материнской гипергликемии на метаболизм развивающегося плода in vivo остается неизвестным и может пролить свет на причину врожденных пороков при диабетической беременности.

Замечательные исследования на мышах позволили получить все более детальное представление о развитии млекопитающих с точки зрения геномики и транскриптомики.^10-12 В данном исследовании мы добавили дополнительный слой к пониманию развития млекопитающих, оценив метаболический ландшафт развивающегося плода на многотканевом уровне и изучив, как материнская гипергликемия формирует этот ландшафт. Используя жидкостную хромато-масс-спектрометрию (LC-MS) и [U-13C]глюкозу, мы измерили метаболический профиль тканей плода (плаценты, сердца, печени и мозга), взятых у беременных мышей в середине и конце беременности. Мы представляем обширный метаболомный атлас тканей плода, который дает представление о динамике на уровне метаболитов и использовании путей в условиях эугликемии и гипергликемии. Наш богатый набор данных позволяет выявить метаболические сигнатуры, отражающие влияние высокого уровня глюкозы внутриутробно на метаболизм тканей плода, и может быть использован для разработки улучшенных стратегий, направленных на удовлетворение потребностей плода в питании.

Для моделирования диабетической беременности мы использовали гипергликемическую мышь Akita, которая производит потомство с легким дефектом, но выживающее в период средней и поздней беременности. Эти мыши несут гетерозиготную мутацию в гене Ins2, что приводит к развитию диабета в зрелом возрасте.¹³ На фоне C57BL/6 плоды Akita были скрещены с самцами дикого типа для создания диабетической беременности, при которой плоды подвергаются воздействию гипергликемии.⁹ У потомства плодов Akita наблюдались некоторые дефекты сердца и нервной трубки, однако большинство дефектов были легкими, и большинство из них были пригодны для метаболомного анализа на основе LC-MS (рис. 1A и S1A).

Figure 1 . Metabolomic platform to assess fetal metabolism during mid-to-late gestation and diabetic pregnancy

(A) Images of fetuses harvested from wild-type (WT) and Akita (AK) dams at embryonic day 15.5 highlighting neural tube defect and single ventricle defect in fetuses from Akita dams.
(B) Schematic of experimental setup involving timed pregnancies in WT and AK dams, [U-13C]glucose infusion parameters, and tissues collected.
(C) Schematic of LC-MS-based metabolomic data analysis approach.
(D) Heatmap representation of targeted metabolite analysis across placenta, heart, liver, and brain in fetal tissues isolated from WT and AK dams across multiple time points during development. The plotted data represents Z score. Gray indicates not detected across fetal tissue set.
(E) The expected fraction of pathway carbons labeled normalized to the level of maternal glucose labeling. Fractional labeling of carbons from metabolites in a pathway (glycolysis, pentose phosphate pathway, TCA cycle) was averaged and weighted by the number of carbons per metabolite to indicate whole pathway labeling at different time points during mid-to-late gestation. Metabolites colored gray in the pathway panel were not measured. Data represented as mean ± SEM. Statistical analyses were performed using multiple two-tailed t tests with Holm-Sidak’s multiple-comparisons adjustment.
See also Figure S1 and Tables S1 and S2.

Мы поставили перед собой задачу составить карту метаболомного профиля тканей плода, собранных у беременных плодов Akita в сравнении с плодами дикого типа на протяжении всего развития, особенно в середине и конце беременности. Для достижения этой цели беременность мышей была исследована на стадиях E10.5, E12.5, E15.5 и E18.5. Плоды мышей дикого типа и диабетиков (Akita) голодали в течение ночи и получали [U-13C]глюкозу до сбора тканей плода для отслеживания прохождения 13C по метаболическим путям. После 3 ч инфузии трассирующего вещества метаболиты были выделены из рассеченной плаценты, мозга, сердца и печени плода (рис. 1В). Образцы материнской плазмы были собраны для измерения уровня глюкозы и анализа метаболитов методом LC-MS, чтобы убедиться в повышенном уровне глюкозы у плодов Akita и сходном обогащении 13C-глюкозой у плодов дикого типа и Akita (рис. S1B и S1C). В когорте беременных мышей E15.5 мы подтвердили, что не наблюдалось значительных изменений в весе мышей из-за ночного голодания у плодов дикого типа или Akita (рис. S1D). Кроме того, забор образцов материнской плазмы и серийные кесаревы сечения проводились в течение 4-часовой инфузии [U-13C]глюкозы, что позволило оценить динамику глюкозы, инсулина и маркировки. Уровни инсулина были сопоставимы между плодами дикого типа и плодами Akita в каждой временной точке введения трассирующего вещества, в то время как уровень глюкозы в крови показал больший ответ у плодов Akita по сравнению с плодами дикого типа через 3 ч вливания (рис. S1E). Временная динамика обогащения 13С-глюкозы в материнской плазме и тканях плода подтвердила, что (псевдо)устойчивое состояние было достигнуто в кровообращении и тканях плода как у плодов дикого типа, так и у плодов Akita через 3 ч после инфузии трассирующего вещества (рис. S1F и S1G).

Такая экспериментальная установка позволила получить высококачественный набор данных, содержащий три аналитических измерения в контексте развития: (1) стадия развития, (2) происхождение тканей плода и (3) гликемический статус матери. Наша система анализа данных включала целевую и не-целевую метаболомику, а также изотопное отслеживание по [U-13C]глюкозе, чтобы получить представление об использовании путей и источников питательных веществ (рис. 1С). Целевой анализ данных метаболомики включал перекрестные ссылки на библиотеку метаболитов, состоящую из 162 метаболитов (Таблица S1). По всем тканям, срокам беременности и материнскому гликемическому состоянию мы получили комплексную количественную оценку уровней метаболитов для дальнейшего анализа (рис. 1D). Кроме того, мы измерили изотопологи каждого метаболита, чтобы получить дальнейшее представление о метаболических потоках (Таблица S2). Анализ фракционного обогащения 13C показал, что активность на разных стадиях развития и метаболических путях неодинакова (рис. 1E). Во всех тканях плода гликолитические метаболиты в основном мечены между E10.5 и E15.5, но мечение гликолитических метаболитов резко снижается в тканях плода E18.5. Гликолитические метаболиты в печени и мозге плодов E18.5 от плодов дикого типа были значительно менее мечеными, чем у плодов от плодов Akita, это указывает на растущие различия в источниках этих промежуточных продуктов в зависимости от гликемического состояния матери. Обогащение pentose phosphate pathway (PPP) 13C указывает на пик активности на разных стадиях развития для разных тканей: активность PPP в плаценте и печени достигает пика на ст. E10.5, в то время как в сердце и мозге она достигает пика на ст. E12.5 и E15.5. В пул метаболитов цикла tricarboxylic acid (TCA) вносят вклад многочисленные питательные вещества. Таким образом, обогащение глюкозы 13С указывает на прямой и косвенный вклад глюкозы в цикл TCA. Ткани плода от матерей дикого типа были значительно более мечеными на ранних стадиях E10.5 и E12.5, но к E18.5 мечение в тканях плода от матерей Akita обогнало аналоги дикого типа, что указывает на устойчивый катаболизм глюкозы при развитии гипергликемии.

Мы провели двусторонний ANOVA анализ с контролем частоты ложных обнаружений (FDR), чтобы выявить значительное количество различий в наших целевых наборах данных метаболомики (Рисунок S2; Таблица S3). При ближайшем рассмотрении метаболизма глюкозы этот набор данных выявил заметно повышенный уровень Sorbitol в тканях плода, полученных от плода Akita по сравнению с плодами дикого типа (Рисунок 2А). Сорбитол образуется из глюкозы под действием aldose reductase в рамках polyol пути (рис. 2В). Чтобы оценить степень накопления сорбитола в тканях плода, собранных от плодов Akita по сравнению с плодами дикого типа, мы определили увеличение уровня сорбитола по сравнению с тканями плода ст. E10.5 от плодов дикого типа. Мы наблюдали повышение уровня сорбитола в плаценте, сердце, печени и мозге плода, подвергшегося воздействию материнской гипергликемии. Мозг плода, выделенный от плодов Akita в возрасте E15,5 и E18,5, в частности, показал наибольшее накопление сорбитола по сравнению со ст. E10,5 мозгом плода, выделенным от плодов дикого типа (рис. 2C). Накопление сорбитола у взрослых пациентов с диабетом может привести к осмотическому стрессу тканей и способствует повреждению инсулин-независимых тканей, таких как сетчатка, почки и нервы.¹⁴ Наши данные показали, что плоды, подверженные материнской гипергликемии, не защищены от накопления сорбитола, и предположили, что накопление сорбитола во время развития плода может способствовать более высокой частоте пороков развития, наблюдаемых при диабетической беременности.

Нам было интересно узнать, как материнская гипергликемия изменяет более широкий метаболизм плода. Мы наблюдали изменения в уровне аминокислот в тканях плода, собранных от плодов дикого типа и плодов Akita (рис. 3А). На разных этапах развития большинство аминокислот в сердцах плодов, полученных от плодов Akita, снижались в меньшей степени по сравнению с сердцами плодов, полученных от плодов дикого типа, в то время как в печени и мозге плодов Akita наблюдалась более выраженная тенденция к повышению. Наиболее примечательно, что уровни аспартата в мозге плода имели различную динамику в течение всего периода развития плодов, полученных от плодов дикого типа и плодов Akita (Рисунок 3B). В мозге плодов, выделенных от плодов дикого типа, уровень аспартата увеличивался примерно в 2 раза со ст. E10.5 до E12.5; однако в мозге плодов, выделенных от плодов Akita, уровень аспартата оставался неизменным с E10.5 до E12.5 и вместо этого увеличивался примерно в 2 раза между E12.5 и E15.5 (рис. 3B). Эти изменения контрастируют с уровнем asparagine в мозге плода, который оставался неизменным в течение всего периода развития и в разных условиях (рис. 3В). Уровни глутамата и glutamate-derived gamma-aminobutyric acid (GABA) также отличались в мозге плода, полученного от дикого типа и плода Akita (Рисунок 3C). Уровни глутамата и GABA были ниже в мозге плода E10.5 и E12.5, выделенном от плода Akita, по сравнению с мозгом плода E10.5 и E12.5, выделенным от плода дикого типа. Уровень GABA также был ниже в мозге плодов E12.5, выделенных от плодов Akita без анестезии или ночного голодания (рис. S3A). Отслеживая ¹³C через синтез GABA, мы наблюдали сходную маркировку M + 2 GABA, нормированную на M + 2 глутамата, в мозге плода E12.5 от плодов дикого типа и плодов Akita (рис. S3B). Более низкие уровни этих нейротрансмиттеров могут способствовать более высокой частоте врожденных дефектов мозга, наблюдаемых у плодов, подверженных материнской гипергликемии.¹⁵

Отслеживание [U-¹³C]глюкозы через центральный углеродный метаболизм показало, как ткани плода получают строительные блоки биомассы. Используя принцип, согласно которому доля ¹³C-метки метаболита не может быть больше, чем доля его стабильного источника ¹³C, мы проследили ¹³C на двух различных уровнях: (1) на уровне всего организма, что позволяет выявить потоки обмена питательных веществ, и (2) на уровне тканей, что позволяет выявить потоки через метаболические пути. На уровне всего организма мы рассматривали кровеносную систему плода как связанную с материнской циркуляцией через путь от плаценты к печени, сердцу и мозгу (Рисунок 4A).^16,17 Мы наблюдали, что семь незаменимых аминокислот (Asp, Asn, Glu, Gln, Pro, Ser и Gly) были ¹³C-мечены у плодов, и из этих семи аспартат и глицин не были мечены в материнской плазме (Рисунок 4B). Таким образом, аспартат и глицин полностью синтезировались тканями плода. Метаболизм матери и плода способствовал образованию 5 аминокислот (Asn, Glu, Gln, Pro и Ser) в организме плода, а 13 других аминокислот были полностью получены от плода. Восходящий тренд маркировки глутамата по пути кровообращения у плодов E15.5 и E18.5 подразумевает, что каждая ткань плода производит свой собственный глутамат, в то время как пик маркировки серина в печени подразумевает, что сердце и мозг не обязательно производят свой собственный серин и зависят от поступления серина из печени. Аналогичным образом, пролин из плаценты может поступать в ткани плода в возрасте E10,5 до того, как печень и мозг разовьют способность к синтезу пролина, что подтверждается у плодов ст. E15,5. Временное развитие мечения аспарагина показало, что биосинтез аспарагина в печени плода, выделенного от плодов дикого типа, начинается в E18.5, тогда как в печени плода, выделенного от плодов Akita, он начинается раньше, в E15.5 (рис. S4A).

На тканевом уровне отслеживание ¹³C выявило метаболические пути, ответственные за маркировку аминокислот (Рисунок 4C). Тканевые метаболиты могут получать ¹³С через материнско-плодный транспорт [U-¹³C]глюкозы через плаценту и посредством транспорта других циркулирующих метаболитов, которые самки производят из [U-¹³C]глюкозы.^18,19 Плодный аспартат был мечен в той же или меньшей степени, чем малат, аналог оксалоацетата, который является прямым предшественником аспартата, но более мечен, чем аспартат плазмы (Рисунок 4D). Маркировка фетального глутамата была неизменно выше, чем маркировка глутамата плазмы и фетального глутамина, но сопоставима с маркировкой тканевого α-кетоглутарата (рис. 4E и S4B). Учитывая, что источник мечения (т.е. глюкоза) находится в стабильном состоянии и что пул продуктов не может быть более меченым, чем его пул предшественников, эти наблюдения предполагают, что плодные ткани de novo синтезируют аспартат и глутамат через anaplerosis и цикл ТСА.

Мы попытались определить, является ли ¹³C-метка в гликолитических промежуточных продуктах плодной ткани прямым или косвенным источником глюкозы. В других центральных углеродных метаболических путях прогрессивное мечение отдельных пулов метаболитов однозначно указывало на то, как ¹³C перемещается по каждому пути (рис. S4C и S4D). Однако маркировка гликолитических метаболитов демонстрировала более немонотонные профили. Поскольку циркулирующий лактат является еще одним источником углерода с высоким потоком, мы рассмотрели три сценария, которые приводят к различной маркировке ¹³С: основной источник(и) углерода - (1) глюкоза плазмы, (2) и глюкоза плазмы, и лактат, и (3) лактат плазмы (рис. 4F и S4E).²⁰ Кроме того, мы рассмотрели возможность поступления не-меченого гексозофосфата в результате glycogenolysis.²¹ В плаценте гликолитическое мечение отражало вклад как глюкозы плазмы, так и лактата плазмы, которые были помечены у плода в середине и конце беременности (рис. 4G и S4F). С другой стороны, в печени плодов дикого типа и плодов Akita наблюдались не сопоставимые сигнатуры гликолитического мечения. В E10.5 и E12.5 печень плодов дикого типа демонстрировала восходящий градиент маркировки гликолиза, что указывает на глюконеогенез из ¹³C-меченого лактата и, возможно, разбавление ¹³C-меченой гексозы гликогенолизом (рис. 4G и S4G). Однако в печени плода, полученной от плодов Akita в середине и конце беременности, уровень мечения глюкозы ¹³C был выше и более сходен с уровнем мечения глюкозы в материнском кровообращении. В целом, материнская гипергликемия не только изменяет источник углеродных оснований у плодов, но и поддерживает вклад глюкозы в биосинтез аминокислот на поздних сроках беременности.

Нуклеотиды очень востребованы во время быстрого деления клеток, однако они недоступны через кровообращение. Поэтому мы изучили, как ткани плода управляют биосинтезом нуклеотидов. Мы наблюдали специфическое для тканей плода увеличение количества нуклеотидов в сердце, печени и мозге - но не в плаценте - на ст. E12.5, E15.5 и E18.5 по сравнению с E10.5 (рис. 5A и S5A). Нуклеозидные монофосфаты и дифосфаты, но не нуклеозидные трифосфаты, повышены в тканях мозга плода на ст. E15.5 и E18.5 по сравнению с E10.5. Однако почти все измеренные нуклеотиды повышены в тканях печени плода E12.5-E18.5 по сравнению со ст. E10.5. Специфические нуклеотиды, такие как инозинмонофосфат (IMP), аденозиндифосфат (ADP) и аденозинтрифосфат (ATP), но не аденозинмонофосфат (AMP), цитидинмонофосфат (CMP), гуанозинмонофосфат (GMP) или уридинмонофосфат (UMP), были наиболее повышены в тканях сердца плода на ст. E15.5 и E18.5 по сравнению с E10.5. Нам было интересно выяснить, как изменяется метаболизм пуринов и пиримидинов в тканях плода на протяжении среднего и позднего сроков беременности. В плаценте и сердце плода уровни пулов AMP и UMP не увеличивались на тех стадиях развития, которые мы измеряли (рис. 5B и 5C). Однако в печени и мозге плода уровни пулов AMP и UMP увеличивались (рис. 5B и 5C). Кроме того, обогащение ¹³C в AMP и UMP последовательно снижалось в тканях плода по мере увеличения срока эмбриона, независимо от изменений на уровне пулов (рис. 5D и 5E). Аналогично, уменьшение мечения наблюдалось для IMP и GMP независимо от тенденций на уровне пулов (рис. S5B-S5G).

Несмотря на равномерную процедуру инфузии ¹³С-глюкозы, обогащение нуклеотидов ¹³С снижалось от середины к концу беременности (рис. 5A и S5A). Мечение нуклеотидов, которое не достигало изотопного устойчивого состояния за 3 ч, указывало на скорость оборота нуклеотидов. Таким образом, снижение мечения, совпадающее с уровнем или уменьшением размеров пула, предполагало замедление потоков биосинтеза нуклеотидов из вводимого источника глюкозы. Мы наблюдали, что биосинтез нуклеотидов из вводимого источника глюкозы в плаценте и сердце начинал замедляться на более ранних стадиях развития (т.е. E10.5 или E12.5), чем в печени и мозге (т.е. E15.5 или позже).

Мы расширили нашу аналитическую платформу для не-целевого исследования всех обнаруженных пиков LC-MS и выявления метаболических сигнатур, характеризующих переходный период развития. Мы сравнили не-целевые данные из плацент E18,5 и E10,5, полученных от плодов дикого типа и плодов Akita (Таблица S4), используя платформу MetaboAnalyst.²² В результате анализа метаболизм гистидина был признан метаболическим путем с самым высоким нормализованным баллом обогащения и значимостью в плацентах E18,5 по сравнению с плацентами E10,5, полученными от плодов дикого типа (Рисунок 6A). Аналогичные результаты были получены при сравнении плацентарных метаболитов плодов, полученных от плодов Akita (Рисунок S6A). Учитывая значительное обогащение метаболизма гистидина в плацентах поздних сроков по сравнению с E10.5, мы решили более тщательно изучить этот путь в тканях плода и на протяжении средней и поздней беременности. Гистамин образуется из гистидина, который может катаболизироваться как до urocanate, так и до гистамина (рис. 6B). Мы обнаружили, что уровень гистидина в пуле не соответствует общей тенденции в тканях плода и, более того, снижается в сердце и мозге плода, выделенных от плодов дикого типа (Рисунок 6C). Однако на стадии E18.5 мы наблюдали накопление гистидин-производных метаболитов в тканях плаценты, сердца, печени и мозга плода (рис. 6D-6F). В частности, мы наблюдали резкое накопление гистидин-производных метаболитов, гистамина и имидазол-4-ацетата (рис. 6E и 6F). Эти сигналы, выявленные в ходе не-целевого анализа, были подтверждены химическими стандартами (рис. S6B). Увеличение количества гистидин-производных метаболитов в возрасте E18.5 также наблюдалось в материнском кровообращении (Рисунок S6C), что подчеркивает взаимодействие между материнским и плодным метаболизмом. Чтобы выяснить, способствовало ли ночное голодание плода изменениям, наблюдаемым в метаболитах катаболизма гистидина, мы провели метаболомные измерения на основе LC-MS в тканях плода E12.5 и E18.5, взятых от плода дикого типа и плода Akita без голодания, без анестезии или инфузии трассирующих веществ. В этом невозмущенном состоянии мы снова наблюдали значительное увеличение гистидин-производных метаболитов, особенно гистамина и имидазол-4-ацетата, в тканях поздних стадий развития плода независимо от гликемического состояния, предполагая, что поразительное увеличение метаболизма гистидина в тканях поздних стадий развития плода не является эффектом ночного голодания плодов (Рисунок S6D). Интересно, что повышенный уровень гистамина в плазме крови был обнаружен у женщин во время преждевременных родов по сравнению со срочными родами.²³

Наш обширный набор метаболомных данных представляет собой первую углубленную оценку метаболизма тканей плода in vivo в середине и конце беременности в контексте как материнской эугликемии, так и гипергликемии. Изучение относительных уровней пула метаболитов в тканях плода выявило повышенные уровни токсичного метаболита сорбитола, образующегося из глюкозы, во всех исследованных тканях плода с гипергликемией (рис. 2). Эти данные свидетельствуют о том, что ткани плода не защищены от накопления сорбитола при развитии в условиях материнской гипергликемии. Неконтролируемый высокий уровень глюкозы в крови у пациентов с диабетом, как известно, приводит к накоплению сорбитола и повреждению в инсулин-независимых тканях, таких как сетчатка, почки и нервы.¹⁴ Ранние исследования намекали на накопление сорбитола в печени и плаценте плода крыс, подвергшихся воздействию материнской гипергликемии, а также в нейроэктодермальных тканях.^24,25 Хотя производство сорбитола в плаценте хорошо документировано при нормальной беременности у нескольких видов животных и человека, данные о временном изменении количества или концентрации сорбитола на разных стадиях беременности скудны.^26-28 Теперь мы представляем более полное представление на временное изменение уровня сорбитола, охватывающий несколько стадий развития и тканей плода. Хотя физиологическая роль полиолового пути при нормальной беременности недостаточно изучена и еще предстоит исследовать, этот путь был связан с окислительно-восстановительным дисбалансом при диабете.²⁹ Наши данные метаболомики in vivo подтверждают, что у плодов мышей с диабетом наблюдается 3-5-кратное накопление сорбитола по сравнению с плодами мышей дикого типа. В дальнейших исследованиях необходимо выяснить, как такое накопление сорбитола влияет на развитие плода. Ингибиторы фермента, продуцирующего сорбитол, альдозоредуктазы, используются в клинике для лечения диабетической нейропатии.³⁰ Прошлые исследования с использованием ингибиторов альдозоредуктазы на культивируемых плодах крыс привели к снижению уровня сорбитола без эффекта на предотвращение задержки роста и дисморфогенеза, вызванных высоким содержанием глюкозы.³¹ Однако потребуются дополнительные исследования, чтобы проверить, можно ли использовать ингибиторы альдозоредуктазы для снижения уровня сорбитола у плода in vivo и предотвращает ли это некоторые из дефектов развития, связанных с материнской гипергликемией.

Кроме того, наш анализ относительных уровней пула метаболитов у плода в период средне-позднего срока беременности выявил измененные тенденции в уровнях аминокислот в головном мозге плода (Рисунок 3). Хотя в каждой анализируемой ткани наблюдались уникальные тенденции изменения уровня аминокислот на протяжении среднего и позднего сроков беременности, мы выделили эти тенденции в мозге, учитывая важную роль некоторых аминокислот как нейротрансмиттеров в формировании мозговых сетей.³² На данный момент мы не знаем, связано ли снижение уровня GABA в мозге плода от плода Akita с уменьшением ее производства или усилением деградации, поэтому необходимы дальнейшие исследования для изучения механистических аспектов этой наблюдаемой тенденции. Кроме того, несмотря на растущее понимание важности глутаматергической системы для развития и функционирования мозга³³ , существует недостаток информации о том, как метаболические аномалии влияют на эти системы. Поэтому наши данные о том, что уровни аминокислотных нейротрансмиттеров, таких как аспартат, глутамат и GABA, различаются в мозге плода, выделенного от плодов с гипергликемией, предполагают последующие исследования, изучающие, могут ли эти изменения способствовать более высокой частоте врожденных дефектов мозга, возникающих в условиях материнской гипергликемии.

Помимо понимания динамики на уровне пула метаболитов, мы использовали информацию о ¹³C-мечении для изучения использования центрального углеродного пути в тканях плода, а также источников питательных веществ. Например, мы обнаружили, что различия в маркировке питательных веществ плода и плазмы крови ¹³C-глюкозой, вводимой плоду, позволяют определить, поступает ли конкретное питательное вещество через материнскую циркуляцию или синтезируется плодом. В результате проведенного анализа мы обнаружили, что в тканях плода синтез аспартата и глутамата происходит на протяжении всего периода беременности, однако биосинтез пролина становится более заметным на поздних стадиях развития печени и мозга. Кроме того, наши данные свидетельствуют о том, что ткани печени плода получают углеродные основы из другого источника, чем циркулирующая глюкоза, но в меньшей степени в случае материнской гипергликемии, при которой у плода формируется зависимость от глюкозы. В связи с этим возникает важный вопрос об источниках углерода в организме развивающегося плода, особенно в возрасте E10.5. В условиях эугликемии плод получает углеродные основы гибко, через расщепление гликогена или из лактата через глюконеогенез. Дополнение наших исследований дополнительными экспериментами по мечению, включающими другие меченые питательные вещества, такие как ¹³C-лактат, представляет собой логичное будущее направление, которое поможет прояснить альтернативные источники углерода, на которые полагаются печень и сердце плода E10.5 от плодов с эугликемией и гипергликемией. Тем не менее, этот интересный сдвиг в источниках углерода у плодов с гипергликемией подчеркивает метаболическую пластичность и адаптацию тканей плода при изменении питательной микросреды.

Нецелевой анализ нашего большого набора данных показал поразительное накопление гистидин-производных метаболитов, включая гистамин и имидазол-4-ацетат, в тканях плода и материнской плазме на ст. E18.5 (рис. 6). Интересно, что повышенный уровень гистамина в плазме крови был обнаружен у женщин во время преждевременных родов по сравнению со срочными родами.²³ Эти метаболиты представляют особый интерес, учитывая их потенциальную роль в стимулировании родов. Резкое повышение уровня гистидин-производных метаболитов, которое мы наблюдали при переходе плода на позднюю стадию E18.5, подчеркивает, как мало известно о потенциальной роли метаболизма в модуляции переходных процессов развития.

В целом, представленный здесь ресурс данных поможет выдвинуть новые гипотезы для дальнейшего тестирования, которые приведут к более глубокому пониманию механики, связывающей метаболизм с переходами клеточной судьбы. Например, в будущих исследованиях следует выяснить, являются ли метаболиты, повышенные в тканях плода во время диабетической беременности, причиной увеличения частоты врожденных дефектов, а также определить, являются ли резкие колебания метаболитов определяющими важные переходы в развитии. Лучшее понимание того, как материнский метаболизм влияет на метаболизм и развитие плода, будет иметь решающее значение для разработки стратегий, способствующих укреплению здоровья матери и решению неотложной клинической проблемы диабетической беременности.

Хотя развитие мышей не полностью имитирует развитие человека, мы ожидаем, что наш набор метаболомных данных послужит ценным дополнением к обширным исследованиям, рассматривающим развитие через призму геномики и транскриптомики. В связи с характером наших экспериментов, требующих тщательного определения сроков беременности, мы решили оптимизировать нашу платформу для проведения инфузий в хвостовую вену, что ограничило наши возможности по проведению более длительных инфузий и, следовательно, ограничило количество метаболитов, включающих ¹³C-метку из [U-¹³C]глюкозы. Учитывая количество мышей, с инъекциями в этом исследовании, и количество собранных плодов, мы сосредоточили наш экспериментальный подход на использовании одного изотопно меченного питательного вещества, [U-¹³C]глюкозы, и сборе четырех тканей на каждый вскрытый плод. Использование дополнительных трассеров, таких как ¹³C-глютамин и ¹³C-лактат, в будущих исследованиях обеспечит дополнительные уровни для оценки использования пути. Тестирование дополнительных эмбриональных дней за пределами 4 репрезентативных стадий, которые мы оценили в этом исследовании, обеспечит более точное выявление метаболических сетей плода. Несмотря на нормализацию образцов, мы отмечаем, что в печени плода ст. E10.5 уровень многих метаболитов был значительно ниже по сравнению с образцами E12.5. Хотя эта разница не наблюдалась среди многих метаболитов, мы признаем, что может быть неясно, имеет ли эта тенденция биологическое значение или скорее отражает потенциальную недопредставленность уровней пула метаболитов. Мы признаем, что использование модели мыши Akita является одним из нескольких подходов, используемых для моделирования диабета у мышей. Мыши Akita имеют дисфункциональный инсулин из-за мутации в гене Ins2, который не способен снижать уровень глюкозы в крови, что приводит к большему повышению уровня глюкозы при параметрах инфузии глюкозы, использованных в данном исследовании. Хотя мышь Akita не идеально отражает все механистические особенности, которые могут характеризовать диабетическую беременность у человека, наша цель в данном исследовании заключалась в том, чтобы создать отправную точку для анализа влияния высокого уровня глюкозы внутриутробно на метаболизм развивающегося плода.