Мутации зародышевой линии с потерей функции, затрагивающие гены, кодирующие белки репарации ДНК и передачи сигналов о повреждениях ДНК, часто лежат в основе дегенеративных прогероидных и/или предрасположенных к раку синдромов, таких как Ataxia telangiectasiaя, анемия Фанкони, пигментная ксеродерма, Li Fraumen и многих других [[1]]. Кроме того, многие из этих генов также подвержены спорадическим соматическим мутациям в подгруппе раковых опухолей различных типов, что, предположительно, способствует нестабильности генома и накоплению мутаций во время опухолевой прогрессии [[2]]. Однако до сих пор протеинкиназа Chk1 была заметным исключением. Несмотря на центральную роль в передаче сигналов о повреждениях ДНК, активации контрольных точек, репликации ДНК и репарации ДНК, ни одна зародышевая мутация, влияющая на Chk1, не была достоверно связана с заболеваниями человека. Сообщалось о трех предполагаемых зародышевых миссенс-мутациях Chk1 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/submitters/500026), однако в настоящее время они интерпретируются как "доброкачественные" или "неизвестной клинической значимости". Редкие гомозиготные мутации в Chk1 были также обнаружены в клиническом экзоме около двух тысяч человек с различными патологиями развития в высоко конфессиональной популяции, что позволило выявить несколько сотен генов-кандидатов [[3]]; однако, действительно ли эти мутации вызывают заболевание, остается неясным. Наконец, хотя Chk1 часто избыточно экспрессируется при раке, функционально подтвержденных соматических мутаций с усилением или ослаблением функции при раке человека или животных зарегистрировано не было [[4]].

Почему так происходит? Одна из возможностей заключается в том, что Chk1 просто слишком важен для жизнеспособности клеток, чтобы страдать от серьезных мутаций с потерей функции. Действительно, в большинстве типов клеток, где этот вопрос был прямо проверен, Chk1 оказался важным для пролиферации и выживания клеток, хотя его незаменимая молекулярная функция (функции) остается плохо определенной [[4]]. Тем более удивительно, что два недавних отчета [[5, 6]] показывают, что зародышевые мутации, влияющие на Chk1, связаны с нарушением фертильности у людей, и что эти мутации обеспечивают не потерю, а, наоборот, приобретение биологической функции мутантными белками Chk1.

Оба исследования начались с пациенток, которые после неспособности зачать ребенка естественным путем были направлены на экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО), но не смогли его провести из-за остановки зиготы, то есть когда оплодотворенная яйцеклетка не успевает пройти первое митотическое клеточное деление. Считается, что значительная часть случаев бесплодия у людей обусловлена генетическими факторами, однако в целом они не определены. Для выявления генетических причин неудач ЭКО Zhang et al. использовали секвенирование целых геномов для поиска потенциально патогенных мутаций у 29 пациентов с остановкой зиготы [[6]]. Из этой когорты семь пациентов из четырех независимых семей оказались гетерозиготными по четырем различным мутациям в С-концевом регуляторном домене Chk1 (рис. 1А). Каждая из этих мутаций происходит в недавно охарактеризованной структуре Chk1 [[7]], названной доменом KA1, который также был обнаружен в ряде других протеинкиназ [[8]]. Домены KA1 представляют собой небольшие компактные структуры, состоящие из центрального антипараллельного бета-листа с 5 нитями, фланкированного двумя короткими альфа-спиралями (Paung & Seeliger, 2018: рис. 1С, слева). Три мутации, идентифицированные Zhang et al., приводят к замене отдельных высоко консервативных аминокислот в конкретных элементах структуры KA1, Chk1: R379Q, Chk1: R420K, и Chk1: R442Q, в то время как четвертый приводит к сдвигу рамки считывания, Chk1: F441fs*, который заменяет С-концевые 35 аминокислот полипептида Chk1 на 14 аминокислот неродственной последовательности (рис. 1A; [[6]]). Важно отметить, что ни одна из этих мутаций Chk1 не была обнаружена ни у 300 фертильных контрольных женщин, ни в открытых базах данных известных патогенных мутаций человека [[6]].



Fig. 1 (A) Schematic diagram of the domain structure of human Chk1. The N-terminal half of the protein contains the serine-threonine kinase domain (grey), whilst the C-terminal 140 amino acids have recently been shown to form a KA1 (Kinase-Associated 1) domain (yellow; [[7]]). Separating the kinase and KA1 domains is a short serine-glutamine (SQ) cluster motif (blue) within which regulatory phosphorylation catalysed by the upstream kinase ATR leads to Chk1 activation in response to DNA damage and DNA synthesis inhibition [[4]]. This overall domain organization has been highly conserved during evolution and can be recognized in Chk1 homologues from vertebrates to yeast. The locations of the heritable gain-of function mutations within the KA1 domain reported by [[5]] and [[6]] are indicated. (B) Mechanism of Chk1 activation by KA1 domain mutations. It is known that the Chk1 KA1 domain can bind to and repress the catalytic activity of the cognate kinase domain [[7]]. It is probable that activating mutations within the KA1 domain enhance Chk1 catalytic and biological activity by weakening or disrupting this repressive effect (shown right). In some cases disruptive KA1 domain mutations have been shown to circumvent the requirement for activatory phosphorylation within the SQ motif [[10]], although that has not been explicitly tested for the gain-of-function mutations studied by [[5]] and [[6]]. (C) Location of the gain-of-function mutations within the Chk1 KA1 domain. On the left the central 5-stranded anti-parallel B-sheet (strands B1-5) flanked by two short alpha-helices α1 and α2) are oriented for clarity of visualization of the individual structural elements with the N- and C-termini of the polypeptide indicated in red. On the right this structure has been rotated 90^o leftwards to reveal the face that is shown docking against the Chk1 kinase domain in the AlphaFold prediction (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/O14757) together with the position of the individual mutations which are located in strands B1 (Chk1: R379Q), B5 (Chk1: F441fs*, Chk1: R442Q), and the loop joining strands B3 and B4 (Chk1: R420K). The mutation Chk1: F441fs* deletes the C-terminal 35 amino acids of the protein consisting of approximately half of strand B5, all of helix α2, and replaces them with an unrelated sequence 14 amino acids in length.

В своем исследовании Chen et al. проанализировали несколько бесплодных женщин в одной большой семье с помощью секвенирования экзома и обнаружили, что каждая из них была гетерозиготна по той же мутации Chk1: R442Q, выявленной Zhang et al., в то время как фертильные братья и сестры женщин были гомозиготны по аллелю дикого типа [[5]]. В обоих исследованиях были представлены достаточно большие родословные, чтобы показать, что по крайней мере Chk1: R442Q [[5]] и Chk1: R379Q [[6]] могут наследоваться аутосомно-доминантным путем через отцовскую передачу, это указывает на то, что они не нарушают фертильность мужчин. Последующие анализы в обоих исследованиях также подтвердили, что мРНК, кодирующая мутантный Chk1, экспрессируется в соматических клетках гетерозиготных особей [[5, 6]] и в ооцитах гетерозиготных самок, что предполагает материнскую трансляцию и депонирование мутантных белков Chk1 во время оогенеза. Таким образом, различные стадии мейоза, необходимые для образования зрелых ооцитов и сперматозоидов, успешно проходили как у самцов, так и у гетерозигот, несущих мутантные аллели Chk1.

Чтобы подтвердить, что мутации Chk1 действительно являются причиной остановки развития зиготы, в обоих исследованиях cRNA, кодирующие белки Chk1 дикого или мутантного типа, вводили в нормальные оплодотворенные мышиные ооциты с двумя отдельными про-ядрами (соответствующими фазе G2) и оценивали последующую частоту появления двуядерных бластоцист как меру эффективности первого митоза. Примечательно, что каждый из протестированных мутантов Chk1 существенно блокировал митоз, измеренный таким образом, что подтверждает их способность вызывать зиготический арест, тогда как эктопическая экспрессия Chk1 дикого типа не оказывала существенного влияния [[5, 6]]. В соматических клетках Chk1 обычно активируется только в условиях повреждения ДНК или стресса репликации, следовательно, одна из его ключевых функций заключается в блокировании начала митоза через арест в фазе G2 до тех пор, пока повреждение не будет восстановлено или репликация не завершится [[4]]. Таким образом, полученные результаты убедительно свидетельствуют о том, что эти мутации вызывают усиление функции Chk1, что делает мутантные белки более биологически активными, чем белки дикого типа, в отсутствие генотоксического стресса.

Дополнительные результаты подтвердили эту интерпретацию. Во-первых, трансфекция плазмид, кодирующих мутантные белки Chk1, в клетки человека HEK293 продемонстрировала четкие доказательства того, что они могут вызывать молекулярные изменения, соответствующие Chk1-опосредованному G2 аресту. В частности, экспрессия мутантов Chk1, но не Chk1 дикого типа, приводила к увеличению фосфорилирования серин 216 (S216) фосфатазы CDC25C и одновременному увеличению ингибирующего фосфорилирования треонина 14 (T14) и тирозина 15 (Y15) CDK1 [[6]]. Во время роста без повреждений CDC25C играет решающую роль в запуске митоза, удаляя ингибирующее фосфорилирование T14/Y15 из CDK1 и тем самым быстро увеличивая его каталитическую активность [[9]]. Однако в условиях повреждения активный Chk1 ингибирует это действие CDC25C, фосфорилируя S216, блокируя удаление T14/Y15 из CDK1 и задерживая клетки в G2 [[4]]. Примечательно, что совместная экспрессия мутантных форм CDC25C и CDK1, лишенных сайтов фосфорилирования S216 и T14/Y15, была способна отменить зиготический арест, индуцированный мутантами Chk1 в мышиных ооцитах, что убедительно свидетельствует о том, что это действительно ключевой молекулярный путь, задействованный in vivo [[6]].

Наконец, прямые измерения активности киназы Chk1 в обоих исследованиях показали, что мутантные белки Chk1 проявляли повышенную каталитическую активность in vitro по сравнению с диким типом [[5, 6]]. Хотя это увеличение было скромным, порядка нескольких раз, оно было сходно по масштабу с увеличением активности, о котором ранее сообщалось для конститутивно активных мутантов Chk1, несущих намеренно разрушающие мутации в домене KA1, которые мощно арестовывают соматические клетки в фазе G2 [[10]]. Хотя молекулярный механизм регуляции Chk1 в соматических клетках остается не до конца понятным, известно, что домен KA1 может связываться с киназным доменом и подавлять его каталитическую и биологическую активность [[4]]. Важно отметить, что структурные мутации, направленные на домен KA1, как было показано, подавляют биологическую активность Chk1 [[10]] и нарушают физическое взаимодействие между доменами KA1 и киназы [[7]]. Таким образом, весьма вероятно, что эти наследственные мутации Chk1 с усилением функции также частично или полностью нарушают этот механизм автоингибирования, делая мутантные белки Chk1 активными в отсутствие генотоксического стресса (рис. 1B).

Некоторые дополнительные новые структурные данные также подтверждают эту возможность. Хотя кристаллическая структура киназного домена Chk1, связанного с его когнатным доменом KA1, еще не известна, однако, с недавних пор доступная база данных AlphaFold Protein Structure Database предсказанных белковых структур (https://alphafold.ebi.ac.uk) предоставляет высоко достоверную модель внутримолекулярного комплекса. Интересно, что хотя вновь выявленные мутации распределены более чем по 60 аминокислотам линейной последовательности KA1 (рис. 1A), топологически они группируются на лицевой стороне структуры KA1, которая стыкуется с киназным доменом Chk1 в предсказанном комплексе (рис. 1C), что согласуется с идеей о том, что они могут ослабить или нарушить внутримолекулярное взаимодействие (https://alphafold.ebi.ac.uk/entry/O14757). К сожалению, алгоритм AlphaFold (пока) не поддерживает визуализацию структурных последствий отдельных мутаций, поэтому для подтверждения этого механизма потребуется дальнейшая биохимическая и структурная работа.

Ген Chk1 уже давно представляет интерес как мишень для разработки противораковых препаратов, и был разработан ряд селективных препаратов-ингибиторов Chk1, некоторые из которых в настоящее время проходят клинические испытания [[11]]. Важно отметить, что низкие концентрации двух ингибиторов Chk1, CCT244747 и PF477736, смогли спасти зиготический арест мышиных ооцитов, индуцированных для экспрессии экзогенного мутантного Chk1 [[5, 6]], при этом экспрессия ключевых генов развития и глобальные геномные транскрипционные изменения в развивающихся бластоцистах, очевидно, были нормальными. Удивительно, но имплантация таких "спасенных" мышиных бластоцист мышам-реципиентам приводила к рождению нормальных здоровых мышат с ожидаемой частотой, указывая на то, что у мышей, по крайней мере, если первоначальный Chk1-индуцированный арест зиготы может быть преодолен, последующее развитие может протекать нормально. Мало того, эти мыши достигали зрелого возраста без каких-либо признаков патологии и демонстрировали нормальную фертильность [[5, 6]].

Лечение ингибитором Chk1 также позволило человеческим зиготам, экспрессирующим эндогенный мутант Chk1, преодолеть зиготический арест in vitro и развиться в бластоцисты, которые демонстрировали нормальную экспрессию критических генов развития. Хотя вопрос о том, сохранят ли такие "спасенные" бластоцисты человека, как и их мышиные аналоги, полный потенциал развития, еще не был проверен, из некоторых "спасенных" бластоцист были получены линии плюрипотентных стволовых клеток с нормальными характеристиками [[6]]. Таким образом, эти результаты дают надежду на то, что лечение ингибиторами Chk1 может стать фармакологическим решением проблемы неудачного ЭКО у женщин, страдающих бесплодием, вызванным наследственными мутациями Chk1.

Примечательно, что особи, гетерозиготные по этим мутантам усиления функции Chk1, помимо бесплодия женщин, очевидно, нормально развиваются и являются здоровыми. Уже упоминалось, что мейоз у гетерозигот женского пола протекает нормально, несмотря на предполагаемую экспрессию мутантного Chk1, и что гетерозиготные зиготы, "спасенные" от остановки первого митоза путем обработки ингибитором Chk1, впоследствии делятся и развиваются, по-видимому, нормально, даже если они продолжают экспрессировать мутантный Chk1. Более того, самцы не страдают бесплодием, а поскольку унаследованный от отца геном экспрессируется уже на стадии 8-клеточной бластоцисты (рис. 2), очевидно, что подавляющее большинство последующих делений соматических клеток должно происходить нормально в зиготах, получивших мутантный аллель Chk1 jn спермиев. Вместе взятые, эти результаты означают, что первое митотическое деление в зиготе очень чувствительно к аресту в G2, опосредованному Chk1, но если этот барьер преодолевается, либо путем лечения ингибитором Chk1 в случае материнской передачи, либо когда экспрессия мутантного Chk1 задерживается, как в случае отцовской передачи, все последующие деления соматических клеток, очевидно, могут происходить нормально (рис. 2). Почему так происходит, совершенно неясно; одна из возможностей заключается в том, что механизм остановки G2 оплодотворенной зиготы просто гиперчувствителен к действию Chk1 по сравнению с более поздними делениями соматических клеток. Это может быть сделано для того, чтобы гарантировать, что любые спонтанные повреждения ДНК, возникающие во время первого митоза, не будут впоследствии переданы каждой последующей клетке эмбриона и, в конечном итоге, взрослого организма. В качестве альтернативы, поскольку механизмы, контролирующие начало митоза, очень сложны и включают многочисленные обратные связи и буферные компоненты [[9]], возможно, система инициации митоза может адаптироваться после первого митоза, чтобы обеспечить более высокий тонический уровень активности Chk1 в последующих делениях. Для того чтобы провести различие между этими возможностями, потребуется дальнейшая работа.



Fig. 2 Female-specific infertility caused by inherited gain-of-function mutant alleles of Chk1. In female heterozygotes mRNAs from both the wild-type (WT) and mutant (MUT) alleles of Chk1 are expressed and the cognate proteins are translated and deposited in the oocyte during oogenesis. Thus, mutant Chk1 protein is present (pink) and presumably active in the hours after fertilization leading up to the first zygotic mitosis which, in the great majority of cases, fails to occur. In contrast, when a normal oocyte from a Chk1 WT/ WT female is fertilized by a sperm bearing a Chk1 MUT allele from a male heterozygote, only WT Chk1 is present when the zygote undergoes the first mitosis, since sperm contribute little to the protein content of the oocyte. In such zygotes mutant Chk1 protein becomes expressed from the 8-cell blastocyst stage when paternal genome transcription commences (pink). Remarkably, the onset of mutant Chk1 protein expression in such zygotes is compatible with subsequent somatic cell divisions and normal development. This is also true in zygotes from female heterozygotes when the first zygotic mitosis is "rescued" by treatment with a selective Chk1 inhibitor drug. Please refer to the text for additional explanation.

Две мутации, изученные Zhang et al., возникли de novo, поскольку ни одна из них не присутствовала у родителей больных; однако в каждом исследовании также была зафиксирована передача мутантного аллеля Chk1 по отцовской линии - Chk1: R442Q и Chk1: R379Q, через несколько поколений в рамках крупных родословных [[5, 6]], что позволяет предположить, что такие мутации, вероятно, существуют с низкой частотой в человеческой популяции. Если это так, то это было бы примечательно, поскольку бесплодие у женщин, предположительно, обеспечило бы существенное селективное давление для устранения таких пагубных аллелей. Однако делетерирующие аллели могут сохраняться, если они дают селективное преимущество гетерозиготам, что иллюстрирует классический случай серповидно-клеточного признака, когда гетерозиготность по мутантному гемоглобину может давать частичную устойчивость к малярии [[12]]. Считается, что этой устойчивости было достаточно для сохранения мутантного аллеля в человеческих популяциях, живущих в малярийных регионах, несмотря на тяжелую серповидноклеточную анемию, которой страдают гомозиготы [[12]]. Очевидно, что ситуация с Chk1, передаваемым по отцовской линии: R379Q и Chk1: R442Q довольно сильно отличается; во-первых, эти аллели, очевидно, редки, обнаружены только при изучении индивидуумов, прошедших жесткий отбор на определенный фенотип, а именно женское бесплодие в результате остановки зиготы. Во-вторых, нет никаких доказательств того, что на гетерозиготы действует какое-либо внешнее селективное давление со стороны окружающей среды. Тем не менее, интересно, что эти аллели могут наделять мужчин-носителей какими-то трудно различимыми характеристиками, такими как увеличение продолжительности жизни или снижение заболеваемости раком, что могло бы позволить им сохраняться на протяжении многих поколений.