Синдром Гийена-Барре (GBS) - редкое и потенциально опасное для жизни заболевание периферической нервной системы, которое приводит к быстро прогрессирующей мышечной слабости, потере сухожильных рефлексов и, иногда, к дыхательной недостаточности и вегетативной дисфункции1. Заболевание может проявлять выраженную гетерогенность в клиническом проявлении, течении и исходе. У 95 % пациентов GBS проявляется как монофазное заболевание, характеризующееся острой фазой, которая развивается в течение четырех недель, после чего следует период восстановления, который может длиться годами1. Различные подтипы заболевания классифицируются в зависимости от типов поражения нервных волокон и характера дегенерации нервов. Острая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (AIDP), наиболее распространенная форма GBS в Европе и Северной Америке, включает первичное повреждение миелиновой оболочки и компонентов Шванновских клеток, тогда как острая моторная аксональная нейропатия (AMAN) затрагивает мембраны нервных аксонов в узлах Ранвье1,2. Инфекции дыхательных путей или гастроэнтерит, вызванный Campylobacter jejuni-, предшествуют началу заболевания у большинства пациентов, а заболеваемость GBS может увеличиваться во время вспышек инфекционных заболеваний, как это описано для вируса Zika1,3. Совсем недавно было высказано предположение о связи между инфекцией SARS-CoV-2 и GBS, однако оно остается спорным4,5. Несмотря на доказанный положительный эффект плазмообмена и внутривенной иммуноглобулинотерапии, почти 20 % пациентов с GBS остаются тяжелыми инвалидами, а около 5 % умирают от респираторных проблем1.
Наше понимание иммуно-опосредованных механизмов, лежащих в основе различных подтипов заболевания, остается ограниченным. Патогенез заболевания, вероятно, является следствием аберрантного иммунного ответа, вызванного факторами окружающей среды, и до сих пор не было описано последовательных ассоциаций с определенными аллелями I или II класса человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)6-8. Считается, что при C. jejuni-ассоциированном AMAN патогенные аутоантитела, направленные против ганглиозидов - гликолипидов периферических нервов, - опосредуют повреждение нейронов посредством молекулярной мимикрии9,10. Однако антиганглиозидные антитела отсутствуют у большинства пациентов с GBS, особенно у лиц с вариантом AIDP, что позволяет предположить участие других иммуно-опосредованных механизмов. Центральная роль аутореактивных Т-клеток, нацеленных на антигены миелина, которые экспрессируются исключительно в периферических нервах (PNS-миелин) - а именно, периферический миелиновый белок 0 (P0), периферический миелиновый белок 2 (P2) и периферический миелиновый белок 22 (PMP22)11 - была установлена при экспериментальном аутоиммунном неврите, животной модели AIDP1. Дальнейшие наблюдения, описывающие инфильтрацию Т-клеток в нервы12,13 и измененное распределение подмножеств Т-клеток в крови пациентов с GBS14-21, позволяют предположить, что аутореактивные Т-клетки существуют и вносят свой вклад в патофизиологию заболевания у людей. Однако, несмотря на некоторые указания22-24, этот аспект остается в основном неясным.
Autoreactive T cells in patients with GBS
Для изучения аутореактивного Т-клеточного иммунитета у пациентов с GBS мы использовали экспериментальный подход, сочетающий скрининг in vitro, секвенирование одиночных клеток РНК (scRNA-seq), получение клонов отдельных Т-клеток и секвенирование TCR (расширенные данные рис. 1а). Скрининг in vitro проводили на тотальных Т-клетках памяти CD4+ и CD8+ из сопоставленных образцов крови острой и восстановительной стадий заболевания 15 пациентов с AIDP, которые имели различные потенциальные триггеры инфекции, включая SARS-CoV-2 (не COVID-19 и post-COVID-19 GBS) (расширенные таблицы 1 и 2). В качестве контроля мы получили образцы крови пациентов с AMAN (n = 4), пациентов с генетической демиелинизирующей болезнью Шарко-Мари-Тута (СМТ) типа 1 (СМТ1; n = 5) (Таблица 1 расширенных данных) и здоровых доноров, некоторые из которых ранее перенесли SARS-CoV-2-инфекцию (не-COVID-19 HD, n = 15; пост-COVID-19 HD, n = 6). Вкратце, популяции Т-клеток сортировали с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) в соответствии со стратегией калибровки, показанной в расширенных данных рис. 1b, маркировали карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловым эфиром (CFSE) и совместно культивировали с аутологичными моноцитами в присутствии или отсутствии выбранных антигенов PNS-миелина (P0, P2 и PMP22) или антигенов положительного контроля (вакцина против гриппа для CD4+ Т-клеток; вирус Эпштейна-Барра (EBV) или цитомегаловирус человека (CMV) для CD8+ Т-клеток). Самореактивные CD4+ Т-клетки памяти, нацеленные на один или несколько антигенов миелина ПНС, были выявлены у 12 из 15 пациентов с GBS на разных стадиях заболевания, но не у здоровых доноров (за исключением 2 из 21) (рис. 1а,б). Кроме того, аутореактивные Т-клетки отсутствовали у пациентов с AMAN и были выявлены у одного из пяти пациентов с CMT1 (расширенные данные рис. 2а). Аутореактивный ответ был направлен против одного или двух само-антигенов у 10 из 15 пациентов с GBS, в то время как только у двух пациентов с GBS наблюдалась широкая аутореактивность против всех трех ПНС-антигенов (рис. 1б). P2 был иммунодоминантной мишенью, выявленной у десяти пациентов на разных стадиях заболевания, в то время как P0 или PMP22 были распознаны у шести пациентов (расширенные данные рис. 2б). Примечательно, что аутореактивные CD4+ Т-клетки были обнаружены у десяти из десяти пациентов с GBS, не входящих в группу COVID-19, но только у двух из пяти пациентов с GBS, прошедших группу COVID-19 (расширенные данные рис. 2c,d). У пациентов с GBS, не являющихся участниками COVID-19, P2 и, в меньшей степени, P0 были основными само-антигенами-мишенями в острой фазе заболевания, тогда как аутореактивный CD4+ T-ответ был значительно повышен против всех трех антигенов миелина ПНС в фазе восстановления (рис. 1c). И наоборот, CD4+ Т-клетки от пациентов с GBS, перенесших COVID-19, демонстрировали высокую фоновую пролиферацию в отрицательных контрольных культурах (без антигена). Этого не наблюдалось у здоровых доноров (n = 6), и, хотя у двух из пяти пациентов были выявлены Т-клетки, реагирующие на ПНС-миелин (расширенные данные рис. 2c,d), ответ не был значительным (рис. 1c).
Fig. 1: Ex vivo stimulation of memory CD4+ T cells from the blood of patients with GBS and healthy donors...
Само-реактивные Т-клетки памяти CD8+ были обнаружены только у 5 из 11 пациентов с AIDP и у 2 из 17 здоровых доноров (расширенные данные рис. 3a-c и расширенные данные табл. 2). В соответствии с наблюдениями в отношении CD4+ Т-клеток памяти, аутореактивный ответ CD8+ Т-клеток памяти был обнаружен в основном у пациентов с GBS, не перенесших COVID-19 (четыре из семи), а не после COVID-19 (один из четырех) (Расширенные данные, рис. 3c).
В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что ПНС-миелин-реактивные CD4+ Т-клетки памяти и редкие CD8+ Т-клетки памяти присутствуют в крови большинства пациентов с AIDP, но эти клетки редко встречаются у пациентов с AMAN или CMT1, а также у здоровых доноров.
Cytotoxic TH1 signature of autoreactive T cells
Чтобы получить представление о фенотипе и TCR-репертуаре аутореактивных CD4+ Т-клеток у пациентов с AIDP, мы объединили стимуляцию in vitro с scRNA-seq и парным TCRα и TCRβ (TCRα/β) анализа. Вкратце, CD4+ Т-клетки памяти от двух пациентов (PT2 и PT16) стимулировали in vitro антигенами PNS-миелина или гриппа, как описано выше. На 6-й день для каждого условия антиген-реактивные CFSElow и не реактивные CFSEhigh Т-клетки были отсортированы FACS и объединены в одну пробирку для анализа scRNA-seq, который выявил 1 980 клеток в культурах, стимулированных антигенами PNS-миелина, и 2 232 клетки в культурах, стимулированных антигенами гриппа. Непредвзятая кластеризация данных scRNA-seq выявила два разных кластера: один характеризуется экспрессией генов пролиферации и активации25,26, что соответствует состоянию, вызванному антигеном (антиген-реактивные клетки) (Дополнительная таблица 1), а второй включает низкую экспрессию маркеров пролиферации и активации, что характерно для не реактивных Т-клеток (рис. 2а). Кластеры ПНС-миелин- и грипп-реактивных Т-клеток состояли из 413 и 414 одиночных Т-клеток, включающих 209 и 242 одиночных TCRα/β клонотипа, соответственно (данные не показаны). Сравнение этих двух кластеров показало, что они сходны по высокой средней экспрессии генов TH1 и низкой экспрессии генов TH2 и TH17 (рис. 2б и дополнительная таблица 1). TH1-ассоциированные гены были обогащены только в кластерах антиген-реактивных клеток, в то время как TH2-подобная сигнатура была обнаружена в основном в не-реактивных клетках (рис. 2c). Примечательно, что в миелин-реактивных клетках ПНС уровень экспрессии генов, связанных с клеточной цитотоксичностью, был значительно выше, чем в грипп-реактивных клетках (рис. 2d и дополнительная таблица 1). Наконец, анализ обогащения набора генов подтвердил статус активации антиген-реактивных Т-клеток и выявил более высокие показатели обогащения генами, ранее ассоциированными с аутоиммунными состояниями, в ПНС-миелин-реактивных Т-клетках по сравнению с грипп-реактивными Т-клетками, которые, напротив, как и ожидалось, показали высокие профили экспрессии генов, связанных с инфекцией вируса гриппа (рис. 2е).
Fig. 2: scRNA-seq analysis of memory CD4+ T cells from patients with GBS.
...
Полученные данные свидетельствуют об уникальном фенотипе аутореактивных Т-клеток у пациентов с AIDP. Этот фенотип характеризуется в основном экспрессией TH1-подобных генов и маркеров цитотоксичности, а также экспрессией генов, которые ранее были связаны с аутоиммунитетом.
Characterization of autoreactive T cell clones
Для дальнейшего изучения аутореактивного Т-клеточного ответа у пациентов с GBS мы создали единичные Т-клеточные клоны, реагирующие на ПНС-миелин (n = 1 048; Дополнительная таблица 2), из фракций CFSElowCD25highICOS+ Т-клеток, полученных в результате скрининга in vitro, которые были дополнительно охарактеризованы по TCR-последовательностям, HLA-рестрикции и целевым эпитопам. Мы получили в общей сложности 987 клонов CD4+ Т-клеток от 13 пациентов со специфичностью против P0 (n = 312), P2 (n = 520) или PMP22 (n = 155) (рис. 3а), а также 55 клонов CD8+ Т-клеток от 6 пациентов, нацеленных на P0 (n = 8), P2 (n = 14) или PMP22 (n = 33) (расширенные данные рис. 3е). Аутореактивные CD4+ Т-клеточные клоны преимущественно экспрессировали провоспалительные цитокины интерферон-γ (IFNγ) и фактор некроза опухоли (TNF), а также цитотоксические маркеры гранзимы A и B (расширенные данные рис. 4a,b), что подтверждает на белковом уровне наши выводы, полученные в результате анализа scRNA-seq (рис. 2). Кроме того, мы определили состав TCRβ клонотипов аутореактивных Т-клеточных клонов, выявив 54 P0-реактивных, 88 P2-реактивных и 27 PMP22-реактивных уникальных клонотипов из 706 CD4+ Т-клеточных клонов (рис. 3а), а также 4 P0-реактивных, 7 P2-реактивных и 6 PMP22-реактивных уникальных клонотипов из 41 CD8+ Т-клеточного клона (расширенные данные рис. 3f). Следует отметить, что в некоторых случаях один и тот же TCRβ клонотип проявлял реактивность против P2 и P0 (CD4_19 и CD4_43) или PMP22 (CD4_136) (Дополнительная таблица 2). Более того, P0- и P2-реактивные сестринские Т-клеточные клоны, несущие те же TCRβ клонотипы, были выделены из совпадающих образцов крови четырех пациентов с GBS (рис. 3б и дополнительная таблица 2). Оба CD4+ и CD8+ аутореактивных Т-клеточных клона демонстрировали поликлональный TCR-репертуар, включая широкий спектр генов TCR Vβ даже у одного и того же человека (рис. 3c и расширенные данные рис. 3f и 4c).
Fig. 3: Characterization of autoreactive CD4+ T cell clones from patients with GBS.
Далее мы сравнили длину TCRB комплементарно-определяющей области 3 (CDR3β) клонотипов CD4+ Т-клеток, реагирующих на ПНС-миелин (n = 166), с SARS-CoV-2-специфичными (n = 92) у пост-COVID-19 пациентов с GBS или с таковыми из микробно-реактивных фракций CFSElow от здоровых доноров27,28. Анализ также проводился на суммарных CD4+ Т-клетках памяти, полученных ex vivo из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) пациентов с GBS, а также из общедоступных наборов данных от здоровых доноров или пациентов с другими аутоиммунными заболеваниями27-29 (дополнительная таблица 3). Примечательно, что длина CDR3β у ПНС-миелин-реактивных Т-клеток была короче, чем у вирусо- и бактерио-специфических или общих CD4+ Т-клеток памяти, что еще раз подтверждает самореактивную природу этих клеток, как сообщалось ранее30,31 (расширенные данные, рис. 4d).
Мы также охарактеризовали HLA-рестрикцию 110 P0-специфичных, 194 P2-специфичных и 83 PMP22-специфичных клонов CD4+ Т-клеток от 13 пациентов с различными HLA-гаплотипами (Дополнительная таблица 4), что соответствует 37, 64 и 19 TCRβ клонотипам. Это свидетельствует о преимущественном ограничении HLA-DR (85,8%, n = 91), при этом меньшинство клонотипов было ограничено HLA-DP (7,5%; n = 8) или HLA-DQ (8,5%; n = 9) (рис. 3d, e и дополнительная таблица 2). Наконец, мы успешно картировали эпитопную специфичность TCRb клонотипов, специфичных для P0 (n = 26) и P2 (n = 47) от девяти пациентов и PMP22 (n = 20) от пяти пациентов, что позволило распознать множество участков, в совокупности охватывающих всю длину последовательностей ПНС-миелина (рис. 3f и дополнительная таблица 2). Однако некоторые участки оказались иммунодоминантными и были выбраны несколькими клонотипами у пациентов с AIDP. В частности, 6 клонотипов из 4 от 9 пациентов распознали аминокислотную область P0 191-205, 17 клонотипов из 5 от 9 пациентов распознали аминокислотную область P2 1-15, а 8 клонотипов из 5 из 5 пациентов распознали аминокислотную область PMP22 81-100. При анализе клонов в связи с предыдущими триггерами вирусной инфекции, такими как вирус varicella-zoster (VZV) (PT1), SARS-CoV-2 (PT12, PT13 и PT14) или CMV (PT2 и PT3), не было выявлено никаких отличительных особенностей распознавания эпитопов (рис. 3f). При проверке на перекрестную реактивность ни один из P0-специфичных или P2-специфичных клонов (n = 52) от пациентов, прошедших курс лечения после COVID-19 (PT12 и PT14), не пролиферировал в ответ на антигены SARS-CoV-2 (расширенные данные, рис. 4e и дополнительная таблица 2). Однако при скрининге P2-специфичных (n = 14) или P0-специфичных (n = 18) клонов от пациентов с предшествующей CMV-инфекцией (PT2, n = 31; PT3, n = 1) большинство из них (n = 26) перекрестно реагировали с антигенами CMV (расширенные данные, рис. 4f). Более того, три из шести CMV-специфических клонов из PT2 пролиферировали в ответ на антигены P0 и P2 (расширенные данные рис. 4f и дополнительная таблица 2).
В целом, наши данные показывают, что Т-клетки, реагирующие на миелин ПНС у пациентов с AIDP, в основном ограничены HLA-DR, имеют поликлональный TCR-репертуар и короткую длину CDR3, распознают множество эпитопов само-антигенов, причем некоторые иммунодоминантные регионы являются мишенями для разных пациентов. Наши результаты также позволяют предположить, что предшествующие инфекционные агенты могут быть непосредственно вовлечены в развитие заболевания, вызывая само-реактивный Т-клеточный иммунитет у части пациентов с поствирусным AIDP.
TCRβ clonotypes in patients with GBS
Далее мы изучили частоту аутореактивных Т-клеток в крови пациентов с AIDP с помощью высокопроизводительного секвенирования TCRβ. В частности, мы сравнили TCR-последовательности наших хорошо охарактеризованных клонов аутореактивных Т-клеток с последовательностями CD4+ Т-клеток памяти, полученных непосредственно ex vivo из PBMCs тех же пациентов (n = 7) (Таблица 2 расширенных данных). У нескольких пациентов (PT1, PT2, PT4, PT5, PT7 и PT12) мы выявили TCRβ клонотипы, соответствующие клонам Т-клеток, специфичных для ПНС-миелина, от тех же пациентов (рис. 4а). В соответствии с результатами, полученными для отдельных клонов Т-клеток (рис. 3c), было обнаружено, что одни и те же аутореактивные клонотипы являются общими для образцов, полученных от одного и того же пациента в острый период и в период выздоровления, и их частота варьирует у каждого донора (рис. 3a). Далее автореактивные клонотипы были сопоставлены с TCRβ репертуаром CD4+ Т-клеток памяти ex vivo из PBMCs пациентов с AIDP (n = 10) (Таблица 2 расширенных данных). Это привело к идентификации 18 TCRβ клонотипов, реагирующих на миелин ПНС, которые были общими для нескольких пациентов с AIDP (n = 6; рис. 4b и дополнительная таблица 2) и которые не были обнаружены в ранее опубликованных нами наборах данных TCRβ памяти CD4+ T-клеток от 15 здоровых доноров27-29 (рис. 4b). В частности, два P0-специфических клонотипа были обнаружены, соответственно, у шести и пяти из десяти пациентов (60-50 %); два P2-специфических и один P0-специфический клонотип были выявлены у четырех пациентов; и, наконец, три P0-специфических, пять P2-специфических и пять PMP22-специфических клонотипов были общими для двух или трех пациентов (рис. 4c). Суммарная частота общих Р0-специфических клонотипов варьировала от 3,3 x 10-5 до 1,4 x 10-3 (медиана - 7,3 x 10-5), была несколько выше, чем у общих P2-специфических (диапазон - 2,8 x 10-5-1,7 x 10-4; медиана - 4 [ 10-5) и PMP22-специфических (диапазон - 6,5 x 10-6-9,3 x 10-6; медиана - 8,1 x 10-6) клонотипов у пациентов в острой фазе заболевания (рис. 4d).
Fig. 4: Clonotypic analysis of autoreactive T cells in patients with GBS...
Далее мы провели объективный анализ клонотипов TCRβ у пациентов с AIDP с помощью алгоритма "группировки взаимодействий лимфоцитов по паратопам" (GLIPH2), который группирует общие специфичности клонотипов на основе локального и глобального сходства32. Мы применили алгоритм GLIPH2 к репертуару TCRβ тотальных CD4+ Т-клеток памяти пациентов с GBS (n = 10) и антиген-реактивных Т-клеток, полученных, соответственно, с помощью высокопроизводительного секвенирования и scRNA-seq анализа, а также к опубликованным наборам данных TCRβ клеток памяти CD4+ Т от здоровых доноров27-29 (n = 9), включая наш эталонный набор известных клонотипов, специфичных для ПНС-миелина, полученных из отдельных клонов Т-клеток. Анализ выявил в общей сложности одиннадцать кластеров TCRβ специфичности, включающих PNS-миелин-специфичные клонотипы на основе глобального (n = 10) или локального (n = 1) сходства, каждый из которых включал по крайней мере четыре уникальных клонотипа от трех или более индивидуумов и демонстрировал значительную итоговую оценку GLIPH2 (рис. 5 расширенных данных и дополнительная таблица 5). Примечательно, что десять групп специфичности TCR (кластеры 2-11) были обнаружены исключительно у трех или более пациентов с GBS и включали P2-специфичные (n = 5) и P0-специфичные (n = 3) или PNS-миелин-реактивные (n = 2) клонотипы из scRNA-seq, тогда как кластер 1, включающий клонотипы с ранее ассоциированной реактивностью против себя и вирусных антигенов33-36, оказался общим для девяти пациентов и девяти здоровых доноров (рис. 4e и дополнительная таблица 5). Примечательно, что кластеры 8 и 9, включающие перекрестно-реактивные клонотипы P0 и CMV (Дополнительная таблица 2), были общими, соответственно, у восьми и четырех пациентов с GBS, но отсутствовали у здоровых доноров. Кроме того, четыре кластера GLIPH2 включали аутореактивные клонотипы, которые мы определили как общие у пациентов с AIDP (рис. 4b,e). Каждый кластер включал в себя различное количество клонотипов у каждого пациента, а их суммарная частота ex vivo в крови варьировала между 5,3 x 10-6 и 6,7 x 10-4 (рис. 4f,g). Кластер 1 не показал специфического обогащения у пациентов по сравнению со здоровыми донорами ни по количеству клонотипов, ни по суммарной частоте (рис. 4f,g).
В целом, полученные результаты подтверждают существование расширенных аутореактивных Т-клеток памяти CD4+ в крови пациентов с AIDP в начале заболевания и в период выздоровления, а также идентифицируют как общие, так и частные аутореактивные TCRβ клонотипы с общим сходством и специфичностью среди людей с AIDP.
Antigen recognition and HLA alleles
Далее мы исследовали потенциальную ассоциацию между публичными последовательностями аутореактивных TCRβ и полиморфизмами HLA. В частности, мы изучили связь между HLA-рестрикцией публичных аутореактивных TCRβ клонотипов и аллелями HLA класса II, носителями которых являются пациенты с AIDP, у которых был обнаружен конкретный TCRβ клонотип (Дополнительная таблица 4). Большинство открытых аутореактивных клонотипов были ограничены HLA-DR (n = 12), и только два были ограничены HLA-DP или HLA-DQ, соответственно; для четырех клонотипов HLA-рестрикция не была определена (Расширенные данные, рис. 6а). Сосредоточившись на HLA-DR-ограниченных, мы не выявили смещения в распределении аллелей HLA-DRB1 между пациентами, тогда как аллель HLA-DRB3 02:02:01:02 оказался общим для двух пациентов для пяти из шести P2-специфических и двух из пяти PMP22-специфических клонотипов, а аллель HLA-DRB4 01:03:01:01 был общим для двух пациентов для двух из шести P2-специфических клонотипов (расширенные данные рис. 6б). В соответствии с этим, при исследовании наличия смещения HLA-полиморфизмов в кластерах GLIPH2 мы обнаружили, что кластеры 2 и 3 имеют значительный уровень обогащения HLA, обусловленный аллелями HLA-DRB3 02 и HLA-DRB1 11, соответственно (Дополнительная таблица 5). Наконец, используя NetMHCIIpan37, мы провели анализ предсказания связывающей аффинности когнатного эпитопа для каждого публичного аутореактивного клонотипа по отношению к HLA-аллелям пациентов, у которых этот клонотип был идентифицирован. Этот анализ показал, что различные аллели HLA класса II связываются с пептидами в сходном диапазоне сродства (расширенные данные, рис. 6c).
Эти данные указывают на то, что существует относительно широкая вариабельность в проявлении антигена различными аллелями HLA, что может объяснить отсутствие последовательной ассоциации с определенными вариантами HLA II класса у пациентов с GBS6-8.
Autoreactivity in CSF and peripheral nerves
Для изучения аутореактивных Т-клеток вблизи тканевой иммунопатологии мы получили образец спинномозговой жидкости (СМЖ) от трех пациентов с AIDP в начале заболевания (Таблица 1 расширенных данных). Интратекальные CD4+ Т-клетки были обогащены и далее охарактеризованы по составу клонотипов с помощью высокопроизводительного секвенирования TCR, что привело к обнаружению 500-4 000 клонотипов в разных образцах (рис. 5а). Следует отметить, что мы выявили специфические для ПНС-миелина клонотипы в ЦСЖ двух из трех пациентов; в частности, один P2-специфический клонотип в PT10, а также четыре P0-специфических, пять P2-специфических и один PMP22-специфический клонотипы в PT11. У PT11 шесть из одиннадцати аутореактивных клонотипов, выявленных в CSF, были также обнаружены в крови (рис. 5b), и, что примечательно, семь из них были среди тех, которые описаны как общественные (public) у пациентов с AIDP (рис. 4b, дополнительная таблица 2). И наоборот, ни один из специфических для ПНС-миелина клонотипов не был обнаружен в опубликованном нами наборе данных TCRβ интратекальных CD4+ клеток пациентов с нарколепсией29.
Fig. 5: Identification of autoreactive CD4+ T cells in the CSF and peripheral nerves of patients with GBS.
Наконец, мы получили биоптат нерва от одного пациента с AIDP (PT16) в начале заболевания. После поликлональной экспансии in vitro инфильтрирующие нерв CD4+ Т-клетки были проанализированы на антигенную специфичность методом скрининга in vitro, который выявил существование Т-клеток, специфичных для P0 и PMP22, и, в меньшей степени, P2 (рис. 5c). Параллельно мы исследовали аутореактивность в центральной (CM) и эффекторной памяти (EM) популяциях CD4+ Т-клеток из крови того же пациента, что показало наличие ПНС-миелин-реактивных Т-клеток в обеих подгруппах с небольшим обогащением в популяции EM (рис. 5d). Для изучения взаимосвязи между аутореактивными Т-клетками в крови и нервной ткани мы определили TCRβ клонотип фракций CFSElow, полученных при стимуляции in vitro, получив 274 уникальные последовательности в PMP22-реактивных Т-клетках из биоптата нерва, а также 241 и 310 уникальных клонотипов, соответственно, в PNS-миелин-реактивных EM и CM CD4+ Т-клетках из крови. Мы выявили десять специфических для ПНС-миелина клонотипов, общих для нерв-инфильтрирующих и циркулирующих в крови Т-клеток. Примечательно, что семь и два клонотипа были обнаружены во фракциях CFSElow из СМ и ЭМ клеток, соответственно, в то время как один клонотип был идентифицирован в обеих фракциях (рис. 5е).
Для дальнейшего изучения наличия аутореактивных клонотипов в различных компартментах организма мы использовали алгоритм GLIPH2 для исследования репертуаров TCRβ клонотипов нервно-инфильтрирующих CD4+ T-клеток и CD4+ T-клеток, специфичных к миелину ПНС, из крови одного и того же пациента (PT16), а также общих CD4+ T-клеток из ЦСЖ пациентов с AIDP. В анализ был включен наш референсный набор данных известных клонотипов одиночных Т-клеток, специфичных для ПНС-миелина (дополнительная таблица 2). Мы идентифицировали один кластер GLIPH2, включающий один общественный клонотип, специфичный для PMP22 (CD4_149, Дополнительные таблицы 2 и 5), и охватывающий несколько клонотипов, сгруппированных по локальному сходству в нервно-инфильтрирующих (n = 43) и циркулирующих в крови CD4+ T-клетках памяти от одного и того же пациента (PT16), а также в CD4+ T-клетках, полученных из CSF от трех разных пациентов (PT10, n = 1; PT11, n = 1; PT12, n = 1) (рис. 5f и Дополнительная таблица 5).
В целом эти результаты свидетельствуют о существовании ПНС-миелин-реактивных Т-клеток в пораженной нервной ткани и в CSF, указывая на их потенциальное участие в иммунопатологии AIDP.
Discussion
В данном исследовании представлено систематическое описание CD4+ и CD8+ Т-клеток, нацеленных на антигены миелина P0, P2 и PMP22, в крови, CSF и нервной ткани хорошо охарактеризованной группы пациентов с GBS, имеющих демиелинизирующий вариант AIDP. Аутореактивные CD4+ Т-клетки памяти демонстрировали провоспалительный цитотоксический TH1-подобный фенотип и экспрессировали гены, ранее ассоциированные с аутоиммунитетом. В соответствии с предыдущими наблюдениями23, такие клетки распознавали в основном антигены P2 и, в меньшей степени, P0 в острой стадии заболевания, тогда как в период восстановления болезни они были широко направлены на несколько антигенов миелина ПНС. Эти белки ПНС-миелина необходимы для поддержания компактного миелина в периферических нервах38 и выступают в качестве мишеней для патогенных Т-клеток при экспериментальном аутоиммунном неврите1. Наши результаты также выявили общие для пациентов с AIDP самоэпитопы-мишени, которые, как известно, играют ключевую физиологическую роль. Например, значительная часть ответа CD4+ Т-клеток против P0 распознает его цитоплазматические 180-199 аминокислотные остатки, которые имеют решающее значение для целостности миелина39, подвержены точечным мутациям у пациентов с CMT40-42 и являются мишенью патогенных Т-клеток в спонтанной мышиной модели аутоиммунной периферической полиневропатии43,44. Хотя размер нашей выборки невелик, полученные нами данные свидетельствуют об отсутствии аутореактивного Т-клеточного ответа у пациентов с AMAN в начале заболевания, что позволяет предположить наличие иных иммунных механизмов, лежащих в основе заболевания. Обычно считается, что такие варианты аксональных заболеваний, как AMAN и Miller Fisher, опосредуются аутоантителами9,10; однако в будущих исследованиях следует глубже изучить этот аспект и проанализировать большую когорту пациентов.
Более того, мы описали поликлональный аутореактивный TCRβ репертуар у пациентов с AIDP, который содержит CDR3β последовательности, более короткие, чем у микроб-специфических или CD4+ Т-клеток общей памяти. Короткая длина CDR3β была связана с дегенеративными пептидными ответами45 и аутореактивным Т-клеточным иммунитетом30,31, это позволяет предположить, что это может быть общей чертой человеческого аутоиммунитета. Кроме того, в соответствии с предположением о том, что клонотипы с короткой длиной CDR3β с большей вероятностью будут общими для разных людей46, мы выявили высокую степень совместного использования как идентичных последовательностей, так и сходства мотивов в аутореактивных клонотипах у пациентов с AIDP, это указывает на существование общественных TCRβ клонотипов, ассоциированных с заболеванием. Примечательно, что анализ предсказаний выявил беспорядочное связывание пептидов с одинаковой аффинностью различными аллелями HLA класса II у пациентов с AIDP, имеющих общие аутореактивные TCRβ последовательности. Это указывает на относительно широкую вариабельность в отображении и распознавании антигенов, что может объяснить отсутствие последовательной ассоциации заболевания с определенными вариантами HLA II класса6-8. Применимы ли эти результаты к более широкому спектру клинических подтипов GBS, хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии (CIDP) или других аутоиммунных нейропатий, еще предстоит выяснить.
Хотя молекулярная мимикрия аутоантител в C. jejuni-ассоциированных случаях AMAN была в значительной степени описана, механизмы, лежащие в основе пост-инфекционной AIDP, остаются неясными9,10. Несмотря на то, что COVID-19-ассоциированный GBS демонстрирует классический AIDP-подобный демиелинизирующий фенотип, наши данные показывают, что лишь незначительная часть этих пациентов имеет аутореактивный Т-клеточный ответ против антигенов миелина ПНС, который не проявляет перекрестной реактивности к антигенам SARS-CoV-2. Это позволяет предположить, что у пациентов с GBS, перенесших атипичную пневмонию после COVID-19, определенную роль играют другие само-протеины47,48 или иммуно-опосредованные механизмы. В этой связи высокая степень способности Т-клеток к аутопролиферации, наблюдаемая в таких случаях, поддерживает потенциальный механизм случайного свидетеля49. Тем не менее, в случаях AIDP, связанных с первичной CMV-инфекцией, мы выявили Т-клетки, перекрестно реагирующие между собственными и вирусными антигенами, которые в некоторых случаях распознавали два разных антигена ПНС - миелиновый и CMV. Соответственно, клонотипы, направленные на два разных антигена ПНС-миелина, были выявлены у трех разных пациентов с AIDP, что свидетельствует о вырожденности TCR. Будущие исследования должны изучить этот аспект, который может оказаться особенно актуальным в связи с широко признанным пост-инфекционным происхождением GBS.
В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что некоторые вирусные инфекции вызывают активацию цитотоксических CD4+ Т-клеток, реагирующих на миелин ПНС, которые проникают в периферические нервы, приводя к местному воспалению и привлечению других иммунных клеток12,13, с последующей дестабилизацией миелина, распространением эпитопов и расширением иммунного ответа на дополнительные само-антигены на более поздних стадиях заболевания. Активация аутореактивных Т-клеток может поддерживаться на местном уровне за счет распознавания самоантигенов, представленных резидентными или инфильтрирующимися макрофагами50, или клетками Шванна, которые демонстрируют повышенную способность к переработке антигенов и увеличенную экспрессию MHC класса II в условиях воспаления51-53. В настоящее время неясно, существуют ли у пациентов с AIDP аутоантитела, направленные на белки миелина ПНС, и играют ли они роль в развитии заболевания, а также могут ли аутореактивные CD4+ Т-клетки способствовать выработке антител с помощью В-клеток54-60.
В целом, наши результаты дают полное описание аутореактивного Т-клеточного иммунитета у пациентов с AIDP и углубляют наше понимание основных механизмов, лежащих в основе иммунопатологии GBS. Наши выводы могут проложить путь к новым медицинским вмешательствам в самом начале возникновения симптомов для предотвращения прогрессирования заболевания и последующей заболеваемости и смертности.