Ползователи:
СИНДРОМ GUILLAIN–BARRE



Роль аутореактивных Т клеток в нарушениях периферических нервных клеток

Autoreactive T cells target peripheral nerves in Guillain–Barre syndrome
L. Sukenikova, A. Mallone, B. Schreiner, et al.
Nature volume 626, pages160–168 (2024)

Guillain–Barre syndrome (GBS) is a rare heterogenous disorder of the peripheral nervous system, which is usually triggered by a preceding infection, and causes a potentially life-threatening progressive muscle weakness1. Although GBS is considered an autoimmune disease, the mechanisms that underlie its distinct clinical subtypes remain largely unknown. Here, by combining in vitro T cell screening, single-cell RNA sequencing and T cell receptor (TCR) sequencing, we identify autoreactive memory CD4+ cells, that show a cytotoxic T helper 1 (TH1)-like phenotype, and rare CD8+ T cells that target myelin antigens of the peripheral nerves in patients with the demyelinating disease variant. We characterized more than 1,000 autoreactive single T cell clones, which revealed a polyclonal TCR repertoire, short CDR3β lengths, preferential HLA-DR restrictions and recognition of immunodominant epitopes. We found that autoreactive TCRb clonotypes were expanded in the blood of the same patient at distinct disease stages and, notably, that they were shared in the blood and the cerebrospinal fluid across different patients with GBS, but not in control individuals. Finally, we identified myelin-reactive T cells in the nerve biopsy from one patient, which indicates that these cells contribute directly to disease pathophysiology. Collectively, our data provide clear evidence of autoreactive T cell immunity in a subset of patients with GBS, and open new perspectives in the field of inflammatory peripheral neuropathies, with potential impact for biomedical applications.
Синдром Гийена-Барре (GBS) - редкое и потенциально опасное для жизни заболевание периферической нервной системы, которое приводит к быстро прогрессирующей мышечной слабости, потере сухожильных рефлексов и, иногда, к дыхательной недостаточности и вегетативной дисфункции1. Заболевание может проявлять выраженную гетерогенность в клиническом проявлении, течении и исходе. У 95 % пациентов GBS проявляется как монофазное заболевание, характеризующееся острой фазой, которая развивается в течение четырех недель, после чего следует период восстановления, который может длиться годами1. Различные подтипы заболевания классифицируются в зависимости от типов поражения нервных волокон и характера дегенерации нервов. Острая воспалительная демиелинизирующая полинейропатия (AIDP), наиболее распространенная форма GBS в Европе и Северной Америке, включает первичное повреждение миелиновой оболочки и компонентов Шванновских клеток, тогда как острая моторная аксональная нейропатия (AMAN) затрагивает мембраны нервных аксонов в узлах Ранвье1,2. Инфекции дыхательных путей или гастроэнтерит, вызванный Campylobacter jejuni-, предшествуют началу заболевания у большинства пациентов, а заболеваемость GBS может увеличиваться во время вспышек инфекционных заболеваний, как это описано для вируса Zika1,3. Совсем недавно было высказано предположение о связи между инфекцией SARS-CoV-2 и GBS, однако оно остается спорным4,5. Несмотря на доказанный положительный эффект плазмообмена и внутривенной иммуноглобулинотерапии, почти 20 % пациентов с GBS остаются тяжелыми инвалидами, а около 5 % умирают от респираторных проблем1.
Наше понимание иммуно-опосредованных механизмов, лежащих в основе различных подтипов заболевания, остается ограниченным. Патогенез заболевания, вероятно, является следствием аберрантного иммунного ответа, вызванного факторами окружающей среды, и до сих пор не было описано последовательных ассоциаций с определенными аллелями I или II класса человеческого лейкоцитарного антигена (HLA)6-8. Считается, что при C. jejuni-ассоциированном AMAN патогенные аутоантитела, направленные против ганглиозидов - гликолипидов периферических нервов, - опосредуют повреждение нейронов посредством молекулярной мимикрии9,10. Однако антиганглиозидные антитела отсутствуют у большинства пациентов с GBS, особенно у лиц с вариантом AIDP, что позволяет предположить участие других иммуно-опосредованных механизмов. Центральная роль аутореактивных Т-клеток, нацеленных на антигены миелина, которые экспрессируются исключительно в периферических нервах (PNS-миелин) - а именно, периферический миелиновый белок 0 (P0), периферический миелиновый белок 2 (P2) и периферический миелиновый белок 22 (PMP22)11 - была установлена при экспериментальном аутоиммунном неврите, животной модели AIDP1. Дальнейшие наблюдения, описывающие инфильтрацию Т-клеток в нервы12,13 и измененное распределение подмножеств Т-клеток в крови пациентов с GBS14-21, позволяют предположить, что аутореактивные Т-клетки существуют и вносят свой вклад в патофизиологию заболевания у людей. Однако, несмотря на некоторые указания22-24, этот аспект остается в основном неясным.
Autoreactive T cells in patients with GBS


Для изучения аутореактивного Т-клеточного иммунитета у пациентов с GBS мы использовали экспериментальный подход, сочетающий скрининг in vitro, секвенирование одиночных клеток РНК (scRNA-seq), получение клонов отдельных Т-клеток и секвенирование TCR (расширенные данные рис. 1а). Скрининг in vitro проводили на тотальных Т-клетках памяти CD4+ и CD8+ из сопоставленных образцов крови острой и восстановительной стадий заболевания 15 пациентов с AIDP, которые имели различные потенциальные триггеры инфекции, включая SARS-CoV-2 (не COVID-19 и post-COVID-19 GBS) (расширенные таблицы 1 и 2). В качестве контроля мы получили образцы крови пациентов с AMAN (n = 4), пациентов с генетической демиелинизирующей болезнью Шарко-Мари-Тута (СМТ) типа 1 (СМТ1; n = 5) (Таблица 1 расширенных данных) и здоровых доноров, некоторые из которых ранее перенесли SARS-CoV-2-инфекцию (не-COVID-19 HD, n = 15; пост-COVID-19 HD, n = 6). Вкратце, популяции Т-клеток сортировали с помощью флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS) в соответствии со стратегией калибровки, показанной в расширенных данных рис. 1b, маркировали карбоксифлуоресцеин сукцинимидиловым эфиром (CFSE) и совместно культивировали с аутологичными моноцитами в присутствии или отсутствии выбранных антигенов PNS-миелина (P0, P2 и PMP22) или антигенов положительного контроля (вакцина против гриппа для CD4+ Т-клеток; вирус Эпштейна-Барра (EBV) или цитомегаловирус человека (CMV) для CD8+ Т-клеток). Самореактивные CD4+ Т-клетки памяти, нацеленные на один или несколько антигенов миелина ПНС, были выявлены у 12 из 15 пациентов с GBS на разных стадиях заболевания, но не у здоровых доноров (за исключением 2 из 21) (рис. 1а,б). Кроме того, аутореактивные Т-клетки отсутствовали у пациентов с AMAN и были выявлены у одного из пяти пациентов с CMT1 (расширенные данные рис. 2а). Аутореактивный ответ был направлен против одного или двух само-антигенов у 10 из 15 пациентов с GBS, в то время как только у двух пациентов с GBS наблюдалась широкая аутореактивность против всех трех ПНС-антигенов (рис. 1б). P2 был иммунодоминантной мишенью, выявленной у десяти пациентов на разных стадиях заболевания, в то время как P0 или PMP22 были распознаны у шести пациентов (расширенные данные рис. 2б). Примечательно, что аутореактивные CD4+ Т-клетки были обнаружены у десяти из десяти пациентов с GBS, не входящих в группу COVID-19, но только у двух из пяти пациентов с GBS, прошедших группу COVID-19 (расширенные данные рис. 2c,d). У пациентов с GBS, не являющихся участниками COVID-19, P2 и, в меньшей степени, P0 были основными само-антигенами-мишенями в острой фазе заболевания, тогда как аутореактивный CD4+ T-ответ был значительно повышен против всех трех антигенов миелина ПНС в фазе восстановления (рис. 1c). И наоборот, CD4+ Т-клетки от пациентов с GBS, перенесших COVID-19, демонстрировали высокую фоновую пролиферацию в отрицательных контрольных культурах (без антигена). Этого не наблюдалось у здоровых доноров (n = 6), и, хотя у двух из пяти пациентов были выявлены Т-клетки, реагирующие на ПНС-миелин (расширенные данные рис. 2c,d), ответ не был значительным (рис. 1c).

Fig. 1: Ex vivo stimulation of memory CD4+ T cells from the blood of patients with GBS and healthy donors...

Само-реактивные Т-клетки памяти CD8+ были обнаружены только у 5 из 11 пациентов с AIDP и у 2 из 17 здоровых доноров (расширенные данные рис. 3a-c и расширенные данные табл. 2). В соответствии с наблюдениями в отношении CD4+ Т-клеток памяти, аутореактивный ответ CD8+ Т-клеток памяти был обнаружен в основном у пациентов с GBS, не перенесших COVID-19 (четыре из семи), а не после COVID-19 (один из четырех) (Расширенные данные, рис. 3c).
В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что ПНС-миелин-реактивные CD4+ Т-клетки памяти и редкие CD8+ Т-клетки памяти присутствуют в крови большинства пациентов с AIDP, но эти клетки редко встречаются у пациентов с AMAN или CMT1, а также у здоровых доноров.
Cytotoxic TH1 signature of autoreactive T cells


Чтобы получить представление о фенотипе и TCR-репертуаре аутореактивных CD4+ Т-клеток у пациентов с AIDP, мы объединили стимуляцию in vitro с scRNA-seq и парным TCRα и TCRβ (TCRα/β) анализа. Вкратце, CD4+ Т-клетки памяти от двух пациентов (PT2 и PT16) стимулировали in vitro антигенами PNS-миелина или гриппа, как описано выше. На 6-й день для каждого условия антиген-реактивные CFSElow и не реактивные CFSEhigh Т-клетки были отсортированы FACS и объединены в одну пробирку для анализа scRNA-seq, который выявил 1 980 клеток в культурах, стимулированных антигенами PNS-миелина, и 2 232 клетки в культурах, стимулированных антигенами гриппа. Непредвзятая кластеризация данных scRNA-seq выявила два разных кластера: один характеризуется экспрессией генов пролиферации и активации25,26, что соответствует состоянию, вызванному антигеном (антиген-реактивные клетки) (Дополнительная таблица 1), а второй включает низкую экспрессию маркеров пролиферации и активации, что характерно для не реактивных Т-клеток (рис. 2а). Кластеры ПНС-миелин- и грипп-реактивных Т-клеток состояли из 413 и 414 одиночных Т-клеток, включающих 209 и 242 одиночных TCRα/β клонотипа, соответственно (данные не показаны). Сравнение этих двух кластеров показало, что они сходны по высокой средней экспрессии генов TH1 и низкой экспрессии генов TH2 и TH17 (рис. 2б и дополнительная таблица 1). TH1-ассоциированные гены были обогащены только в кластерах антиген-реактивных клеток, в то время как TH2-подобная сигнатура была обнаружена в основном в не-реактивных клетках (рис. 2c). Примечательно, что в миелин-реактивных клетках ПНС уровень экспрессии генов, связанных с клеточной цитотоксичностью, был значительно выше, чем в грипп-реактивных клетках (рис. 2d и дополнительная таблица 1). Наконец, анализ обогащения набора генов подтвердил статус активации антиген-реактивных Т-клеток и выявил более высокие показатели обогащения генами, ранее ассоциированными с аутоиммунными состояниями, в ПНС-миелин-реактивных Т-клетках по сравнению с грипп-реактивными Т-клетками, которые, напротив, как и ожидалось, показали высокие профили экспрессии генов, связанных с инфекцией вируса гриппа (рис. 2е).

Fig. 2: scRNA-seq analysis of memory CD4+ T cells from patients with GBS.

...
Полученные данные свидетельствуют об уникальном фенотипе аутореактивных Т-клеток у пациентов с AIDP. Этот фенотип характеризуется в основном экспрессией TH1-подобных генов и маркеров цитотоксичности, а также экспрессией генов, которые ранее были связаны с аутоиммунитетом.
Characterization of autoreactive T cell clones


Для дальнейшего изучения аутореактивного Т-клеточного ответа у пациентов с GBS мы создали единичные Т-клеточные клоны, реагирующие на ПНС-миелин (n = 1 048; Дополнительная таблица 2), из фракций CFSElowCD25highICOS+ Т-клеток, полученных в результате скрининга in vitro, которые были дополнительно охарактеризованы по TCR-последовательностям, HLA-рестрикции и целевым эпитопам. Мы получили в общей сложности 987 клонов CD4+ Т-клеток от 13 пациентов со специфичностью против P0 (n = 312), P2 (n = 520) или PMP22 (n = 155) (рис. 3а), а также 55 клонов CD8+ Т-клеток от 6 пациентов, нацеленных на P0 (n = 8), P2 (n = 14) или PMP22 (n = 33) (расширенные данные рис. 3е). Аутореактивные CD4+ Т-клеточные клоны преимущественно экспрессировали провоспалительные цитокины интерферон-γ (IFNγ) и фактор некроза опухоли (TNF), а также цитотоксические маркеры гранзимы A и B (расширенные данные рис. 4a,b), что подтверждает на белковом уровне наши выводы, полученные в результате анализа scRNA-seq (рис. 2). Кроме того, мы определили состав TCRβ клонотипов аутореактивных Т-клеточных клонов, выявив 54 P0-реактивных, 88 P2-реактивных и 27 PMP22-реактивных уникальных клонотипов из 706 CD4+ Т-клеточных клонов (рис. 3а), а также 4 P0-реактивных, 7 P2-реактивных и 6 PMP22-реактивных уникальных клонотипов из 41 CD8+ Т-клеточного клона (расширенные данные рис. 3f). Следует отметить, что в некоторых случаях один и тот же TCRβ клонотип проявлял реактивность против P2 и P0 (CD4_19 и CD4_43) или PMP22 (CD4_136) (Дополнительная таблица 2). Более того, P0- и P2-реактивные сестринские Т-клеточные клоны, несущие те же TCRβ клонотипы, были выделены из совпадающих образцов крови четырех пациентов с GBS (рис. 3б и дополнительная таблица 2). Оба CD4+ и CD8+ аутореактивных Т-клеточных клона демонстрировали поликлональный TCR-репертуар, включая широкий спектр генов TCR Vβ даже у одного и того же человека (рис. 3c и расширенные данные рис. 3f и 4c).

Fig. 3: Characterization of autoreactive CD4+ T cell clones from patients with GBS.

Далее мы сравнили длину TCRB комплементарно-определяющей области 3 (CDR3β) клонотипов CD4+ Т-клеток, реагирующих на ПНС-миелин (n = 166), с SARS-CoV-2-специфичными (n = 92) у пост-COVID-19 пациентов с GBS или с таковыми из микробно-реактивных фракций CFSElow от здоровых доноров27,28. Анализ также проводился на суммарных CD4+ Т-клетках памяти, полученных ex vivo из мононуклеарных клеток периферической крови (PBMCs) пациентов с GBS, а также из общедоступных наборов данных от здоровых доноров или пациентов с другими аутоиммунными заболеваниями27-29 (дополнительная таблица 3). Примечательно, что длина CDR3β у ПНС-миелин-реактивных Т-клеток была короче, чем у вирусо- и бактерио-специфических или общих CD4+ Т-клеток памяти, что еще раз подтверждает самореактивную природу этих клеток, как сообщалось ранее30,31 (расширенные данные, рис. 4d). Мы также охарактеризовали HLA-рестрикцию 110 P0-специфичных, 194 P2-специфичных и 83 PMP22-специфичных клонов CD4+ Т-клеток от 13 пациентов с различными HLA-гаплотипами (Дополнительная таблица 4), что соответствует 37, 64 и 19 TCRβ клонотипам. Это свидетельствует о преимущественном ограничении HLA-DR (85,8%, n = 91), при этом меньшинство клонотипов было ограничено HLA-DP (7,5%; n = 8) или HLA-DQ (8,5%; n = 9) (рис. 3d, e и дополнительная таблица 2). Наконец, мы успешно картировали эпитопную специфичность TCRb клонотипов, специфичных для P0 (n = 26) и P2 (n = 47) от девяти пациентов и PMP22 (n = 20) от пяти пациентов, что позволило распознать множество участков, в совокупности охватывающих всю длину последовательностей ПНС-миелина (рис. 3f и дополнительная таблица 2). Однако некоторые участки оказались иммунодоминантными и были выбраны несколькими клонотипами у пациентов с AIDP. В частности, 6 клонотипов из 4 от 9 пациентов распознали аминокислотную область P0 191-205, 17 клонотипов из 5 от 9 пациентов распознали аминокислотную область P2 1-15, а 8 клонотипов из 5 из 5 пациентов распознали аминокислотную область PMP22 81-100. При анализе клонов в связи с предыдущими триггерами вирусной инфекции, такими как вирус varicella-zoster (VZV) (PT1), SARS-CoV-2 (PT12, PT13 и PT14) или CMV (PT2 и PT3), не было выявлено никаких отличительных особенностей распознавания эпитопов (рис. 3f). При проверке на перекрестную реактивность ни один из P0-специфичных или P2-специфичных клонов (n = 52) от пациентов, прошедших курс лечения после COVID-19 (PT12 и PT14), не пролиферировал в ответ на антигены SARS-CoV-2 (расширенные данные, рис. 4e и дополнительная таблица 2). Однако при скрининге P2-специфичных (n = 14) или P0-специфичных (n = 18) клонов от пациентов с предшествующей CMV-инфекцией (PT2, n = 31; PT3, n = 1) большинство из них (n = 26) перекрестно реагировали с антигенами CMV (расширенные данные, рис. 4f). Более того, три из шести CMV-специфических клонов из PT2 пролиферировали в ответ на антигены P0 и P2 (расширенные данные рис. 4f и дополнительная таблица 2).
В целом, наши данные показывают, что Т-клетки, реагирующие на миелин ПНС у пациентов с AIDP, в основном ограничены HLA-DR, имеют поликлональный TCR-репертуар и короткую длину CDR3, распознают множество эпитопов само-антигенов, причем некоторые иммунодоминантные регионы являются мишенями для разных пациентов. Наши результаты также позволяют предположить, что предшествующие инфекционные агенты могут быть непосредственно вовлечены в развитие заболевания, вызывая само-реактивный Т-клеточный иммунитет у части пациентов с поствирусным AIDP.
TCRβ clonotypes in patients with GBS


Далее мы изучили частоту аутореактивных Т-клеток в крови пациентов с AIDP с помощью высокопроизводительного секвенирования TCRβ. В частности, мы сравнили TCR-последовательности наших хорошо охарактеризованных клонов аутореактивных Т-клеток с последовательностями CD4+ Т-клеток памяти, полученных непосредственно ex vivo из PBMCs тех же пациентов (n = 7) (Таблица 2 расширенных данных). У нескольких пациентов (PT1, PT2, PT4, PT5, PT7 и PT12) мы выявили TCRβ клонотипы, соответствующие клонам Т-клеток, специфичных для ПНС-миелина, от тех же пациентов (рис. 4а). В соответствии с результатами, полученными для отдельных клонов Т-клеток (рис. 3c), было обнаружено, что одни и те же аутореактивные клонотипы являются общими для образцов, полученных от одного и того же пациента в острый период и в период выздоровления, и их частота варьирует у каждого донора (рис. 3a). Далее автореактивные клонотипы были сопоставлены с TCRβ репертуаром CD4+ Т-клеток памяти ex vivo из PBMCs пациентов с AIDP (n = 10) (Таблица 2 расширенных данных). Это привело к идентификации 18 TCRβ клонотипов, реагирующих на миелин ПНС, которые были общими для нескольких пациентов с AIDP (n = 6; рис. 4b и дополнительная таблица 2) и которые не были обнаружены в ранее опубликованных нами наборах данных TCRβ памяти CD4+ T-клеток от 15 здоровых доноров27-29 (рис. 4b). В частности, два P0-специфических клонотипа были обнаружены, соответственно, у шести и пяти из десяти пациентов (60-50 %); два P2-специфических и один P0-специфический клонотип были выявлены у четырех пациентов; и, наконец, три P0-специфических, пять P2-специфических и пять PMP22-специфических клонотипов были общими для двух или трех пациентов (рис. 4c). Суммарная частота общих Р0-специфических клонотипов варьировала от 3,3 x 10-5 до 1,4 x 10-3 (медиана - 7,3 x 10-5), была несколько выше, чем у общих P2-специфических (диапазон - 2,8 x 10-5-1,7 x 10-4; медиана - 4 [ 10-5) и PMP22-специфических (диапазон - 6,5 x 10-6-9,3 x 10-6; медиана - 8,1 x 10-6) клонотипов у пациентов в острой фазе заболевания (рис. 4d).

Fig. 4: Clonotypic analysis of autoreactive T cells in patients with GBS...

Далее мы провели объективный анализ клонотипов TCRβ у пациентов с AIDP с помощью алгоритма "группировки взаимодействий лимфоцитов по паратопам" (GLIPH2), который группирует общие специфичности клонотипов на основе локального и глобального сходства32. Мы применили алгоритм GLIPH2 к репертуару TCRβ тотальных CD4+ Т-клеток памяти пациентов с GBS (n = 10) и антиген-реактивных Т-клеток, полученных, соответственно, с помощью высокопроизводительного секвенирования и scRNA-seq анализа, а также к опубликованным наборам данных TCRβ клеток памяти CD4+ Т от здоровых доноров27-29 (n = 9), включая наш эталонный набор известных клонотипов, специфичных для ПНС-миелина, полученных из отдельных клонов Т-клеток. Анализ выявил в общей сложности одиннадцать кластеров TCRβ специфичности, включающих PNS-миелин-специфичные клонотипы на основе глобального (n = 10) или локального (n = 1) сходства, каждый из которых включал по крайней мере четыре уникальных клонотипа от трех или более индивидуумов и демонстрировал значительную итоговую оценку GLIPH2 (рис. 5 расширенных данных и дополнительная таблица 5). Примечательно, что десять групп специфичности TCR (кластеры 2-11) были обнаружены исключительно у трех или более пациентов с GBS и включали P2-специфичные (n = 5) и P0-специфичные (n = 3) или PNS-миелин-реактивные (n = 2) клонотипы из scRNA-seq, тогда как кластер 1, включающий клонотипы с ранее ассоциированной реактивностью против себя и вирусных антигенов33-36, оказался общим для девяти пациентов и девяти здоровых доноров (рис. 4e и дополнительная таблица 5). Примечательно, что кластеры 8 и 9, включающие перекрестно-реактивные клонотипы P0 и CMV (Дополнительная таблица 2), были общими, соответственно, у восьми и четырех пациентов с GBS, но отсутствовали у здоровых доноров. Кроме того, четыре кластера GLIPH2 включали аутореактивные клонотипы, которые мы определили как общие у пациентов с AIDP (рис. 4b,e). Каждый кластер включал в себя различное количество клонотипов у каждого пациента, а их суммарная частота ex vivo в крови варьировала между 5,3 x 10-6 и 6,7 x 10-4 (рис. 4f,g). Кластер 1 не показал специфического обогащения у пациентов по сравнению со здоровыми донорами ни по количеству клонотипов, ни по суммарной частоте (рис. 4f,g).
В целом, полученные результаты подтверждают существование расширенных аутореактивных Т-клеток памяти CD4+ в крови пациентов с AIDP в начале заболевания и в период выздоровления, а также идентифицируют как общие, так и частные аутореактивные TCRβ клонотипы с общим сходством и специфичностью среди людей с AIDP.
Antigen recognition and HLA alleles


Далее мы исследовали потенциальную ассоциацию между публичными последовательностями аутореактивных TCRβ и полиморфизмами HLA. В частности, мы изучили связь между HLA-рестрикцией публичных аутореактивных TCRβ клонотипов и аллелями HLA класса II, носителями которых являются пациенты с AIDP, у которых был обнаружен конкретный TCRβ клонотип (Дополнительная таблица 4). Большинство открытых аутореактивных клонотипов были ограничены HLA-DR (n = 12), и только два были ограничены HLA-DP или HLA-DQ, соответственно; для четырех клонотипов HLA-рестрикция не была определена (Расширенные данные, рис. 6а). Сосредоточившись на HLA-DR-ограниченных, мы не выявили смещения в распределении аллелей HLA-DRB1 между пациентами, тогда как аллель HLA-DRB3 02:02:01:02 оказался общим для двух пациентов для пяти из шести P2-специфических и двух из пяти PMP22-специфических клонотипов, а аллель HLA-DRB4 01:03:01:01 был общим для двух пациентов для двух из шести P2-специфических клонотипов (расширенные данные рис. 6б). В соответствии с этим, при исследовании наличия смещения HLA-полиморфизмов в кластерах GLIPH2 мы обнаружили, что кластеры 2 и 3 имеют значительный уровень обогащения HLA, обусловленный аллелями HLA-DRB3 02 и HLA-DRB1 11, соответственно (Дополнительная таблица 5). Наконец, используя NetMHCIIpan37, мы провели анализ предсказания связывающей аффинности когнатного эпитопа для каждого публичного аутореактивного клонотипа по отношению к HLA-аллелям пациентов, у которых этот клонотип был идентифицирован. Этот анализ показал, что различные аллели HLA класса II связываются с пептидами в сходном диапазоне сродства (расширенные данные, рис. 6c).
Эти данные указывают на то, что существует относительно широкая вариабельность в проявлении антигена различными аллелями HLA, что может объяснить отсутствие последовательной ассоциации с определенными вариантами HLA II класса у пациентов с GBS6-8.
Autoreactivity in CSF and peripheral nerves


Для изучения аутореактивных Т-клеток вблизи тканевой иммунопатологии мы получили образец спинномозговой жидкости (СМЖ) от трех пациентов с AIDP в начале заболевания (Таблица 1 расширенных данных). Интратекальные CD4+ Т-клетки были обогащены и далее охарактеризованы по составу клонотипов с помощью высокопроизводительного секвенирования TCR, что привело к обнаружению 500-4 000 клонотипов в разных образцах (рис. 5а). Следует отметить, что мы выявили специфические для ПНС-миелина клонотипы в ЦСЖ двух из трех пациентов; в частности, один P2-специфический клонотип в PT10, а также четыре P0-специфических, пять P2-специфических и один PMP22-специфический клонотипы в PT11. У PT11 шесть из одиннадцати аутореактивных клонотипов, выявленных в CSF, были также обнаружены в крови (рис. 5b), и, что примечательно, семь из них были среди тех, которые описаны как общественные (public) у пациентов с AIDP (рис. 4b, дополнительная таблица 2). И наоборот, ни один из специфических для ПНС-миелина клонотипов не был обнаружен в опубликованном нами наборе данных TCRβ интратекальных CD4+ клеток пациентов с нарколепсией29.

Fig. 5: Identification of autoreactive CD4+ T cells in the CSF and peripheral nerves of patients with GBS.

Наконец, мы получили биоптат нерва от одного пациента с AIDP (PT16) в начале заболевания. После поликлональной экспансии in vitro инфильтрирующие нерв CD4+ Т-клетки были проанализированы на антигенную специфичность методом скрининга in vitro, который выявил существование Т-клеток, специфичных для P0 и PMP22, и, в меньшей степени, P2 (рис. 5c). Параллельно мы исследовали аутореактивность в центральной (CM) и эффекторной памяти (EM) популяциях CD4+ Т-клеток из крови того же пациента, что показало наличие ПНС-миелин-реактивных Т-клеток в обеих подгруппах с небольшим обогащением в популяции EM (рис. 5d). Для изучения взаимосвязи между аутореактивными Т-клетками в крови и нервной ткани мы определили TCRβ клонотип фракций CFSElow, полученных при стимуляции in vitro, получив 274 уникальные последовательности в PMP22-реактивных Т-клетках из биоптата нерва, а также 241 и 310 уникальных клонотипов, соответственно, в PNS-миелин-реактивных EM и CM CD4+ Т-клетках из крови. Мы выявили десять специфических для ПНС-миелина клонотипов, общих для нерв-инфильтрирующих и циркулирующих в крови Т-клеток. Примечательно, что семь и два клонотипа были обнаружены во фракциях CFSElow из СМ и ЭМ клеток, соответственно, в то время как один клонотип был идентифицирован в обеих фракциях (рис. 5е).
Для дальнейшего изучения наличия аутореактивных клонотипов в различных компартментах организма мы использовали алгоритм GLIPH2 для исследования репертуаров TCRβ клонотипов нервно-инфильтрирующих CD4+ T-клеток и CD4+ T-клеток, специфичных к миелину ПНС, из крови одного и того же пациента (PT16), а также общих CD4+ T-клеток из ЦСЖ пациентов с AIDP. В анализ был включен наш референсный набор данных известных клонотипов одиночных Т-клеток, специфичных для ПНС-миелина (дополнительная таблица 2). Мы идентифицировали один кластер GLIPH2, включающий один общественный клонотип, специфичный для PMP22 (CD4_149, Дополнительные таблицы 2 и 5), и охватывающий несколько клонотипов, сгруппированных по локальному сходству в нервно-инфильтрирующих (n = 43) и циркулирующих в крови CD4+ T-клетках памяти от одного и того же пациента (PT16), а также в CD4+ T-клетках, полученных из CSF от трех разных пациентов (PT10, n = 1; PT11, n = 1; PT12, n = 1) (рис. 5f и Дополнительная таблица 5).
В целом эти результаты свидетельствуют о существовании ПНС-миелин-реактивных Т-клеток в пораженной нервной ткани и в CSF, указывая на их потенциальное участие в иммунопатологии AIDP.
Discussion


В данном исследовании представлено систематическое описание CD4+ и CD8+ Т-клеток, нацеленных на антигены миелина P0, P2 и PMP22, в крови, CSF и нервной ткани хорошо охарактеризованной группы пациентов с GBS, имеющих демиелинизирующий вариант AIDP. Аутореактивные CD4+ Т-клетки памяти демонстрировали провоспалительный цитотоксический TH1-подобный фенотип и экспрессировали гены, ранее ассоциированные с аутоиммунитетом. В соответствии с предыдущими наблюдениями23, такие клетки распознавали в основном антигены P2 и, в меньшей степени, P0 в острой стадии заболевания, тогда как в период восстановления болезни они были широко направлены на несколько антигенов миелина ПНС. Эти белки ПНС-миелина необходимы для поддержания компактного миелина в периферических нервах38 и выступают в качестве мишеней для патогенных Т-клеток при экспериментальном аутоиммунном неврите1. Наши результаты также выявили общие для пациентов с AIDP самоэпитопы-мишени, которые, как известно, играют ключевую физиологическую роль. Например, значительная часть ответа CD4+ Т-клеток против P0 распознает его цитоплазматические 180-199 аминокислотные остатки, которые имеют решающее значение для целостности миелина39, подвержены точечным мутациям у пациентов с CMT40-42 и являются мишенью патогенных Т-клеток в спонтанной мышиной модели аутоиммунной периферической полиневропатии43,44. Хотя размер нашей выборки невелик, полученные нами данные свидетельствуют об отсутствии аутореактивного Т-клеточного ответа у пациентов с AMAN в начале заболевания, что позволяет предположить наличие иных иммунных механизмов, лежащих в основе заболевания. Обычно считается, что такие варианты аксональных заболеваний, как AMAN и Miller Fisher, опосредуются аутоантителами9,10; однако в будущих исследованиях следует глубже изучить этот аспект и проанализировать большую когорту пациентов.
Более того, мы описали поликлональный аутореактивный TCRβ репертуар у пациентов с AIDP, который содержит CDR3β последовательности, более короткие, чем у микроб-специфических или CD4+ Т-клеток общей памяти. Короткая длина CDR3β была связана с дегенеративными пептидными ответами45 и аутореактивным Т-клеточным иммунитетом30,31, это позволяет предположить, что это может быть общей чертой человеческого аутоиммунитета. Кроме того, в соответствии с предположением о том, что клонотипы с короткой длиной CDR3β с большей вероятностью будут общими для разных людей46, мы выявили высокую степень совместного использования как идентичных последовательностей, так и сходства мотивов в аутореактивных клонотипах у пациентов с AIDP, это указывает на существование общественных TCRβ клонотипов, ассоциированных с заболеванием. Примечательно, что анализ предсказаний выявил беспорядочное связывание пептидов с одинаковой аффинностью различными аллелями HLA класса II у пациентов с AIDP, имеющих общие аутореактивные TCRβ последовательности. Это указывает на относительно широкую вариабельность в отображении и распознавании антигенов, что может объяснить отсутствие последовательной ассоциации заболевания с определенными вариантами HLA II класса6-8. Применимы ли эти результаты к более широкому спектру клинических подтипов GBS, хронической воспалительной демиелинизирующей полинейропатии (CIDP) или других аутоиммунных нейропатий, еще предстоит выяснить.
Хотя молекулярная мимикрия аутоантител в C. jejuni-ассоциированных случаях AMAN была в значительной степени описана, механизмы, лежащие в основе пост-инфекционной AIDP, остаются неясными9,10. Несмотря на то, что COVID-19-ассоциированный GBS демонстрирует классический AIDP-подобный демиелинизирующий фенотип, наши данные показывают, что лишь незначительная часть этих пациентов имеет аутореактивный Т-клеточный ответ против антигенов миелина ПНС, который не проявляет перекрестной реактивности к антигенам SARS-CoV-2. Это позволяет предположить, что у пациентов с GBS, перенесших атипичную пневмонию после COVID-19, определенную роль играют другие само-протеины47,48 или иммуно-опосредованные механизмы. В этой связи высокая степень способности Т-клеток к аутопролиферации, наблюдаемая в таких случаях, поддерживает потенциальный механизм случайного свидетеля49. Тем не менее, в случаях AIDP, связанных с первичной CMV-инфекцией, мы выявили Т-клетки, перекрестно реагирующие между собственными и вирусными антигенами, которые в некоторых случаях распознавали два разных антигена ПНС - миелиновый и CMV. Соответственно, клонотипы, направленные на два разных антигена ПНС-миелина, были выявлены у трех разных пациентов с AIDP, что свидетельствует о вырожденности TCR. Будущие исследования должны изучить этот аспект, который может оказаться особенно актуальным в связи с широко признанным пост-инфекционным происхождением GBS.
В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что некоторые вирусные инфекции вызывают активацию цитотоксических CD4+ Т-клеток, реагирующих на миелин ПНС, которые проникают в периферические нервы, приводя к местному воспалению и привлечению других иммунных клеток12,13, с последующей дестабилизацией миелина, распространением эпитопов и расширением иммунного ответа на дополнительные само-антигены на более поздних стадиях заболевания. Активация аутореактивных Т-клеток может поддерживаться на местном уровне за счет распознавания самоантигенов, представленных резидентными или инфильтрирующимися макрофагами50, или клетками Шванна, которые демонстрируют повышенную способность к переработке антигенов и увеличенную экспрессию MHC класса II в условиях воспаления51-53. В настоящее время неясно, существуют ли у пациентов с AIDP аутоантитела, направленные на белки миелина ПНС, и играют ли они роль в развитии заболевания, а также могут ли аутореактивные CD4+ Т-клетки способствовать выработке антител с помощью В-клеток54-60.
В целом, наши результаты дают полное описание аутореактивного Т-клеточного иммунитета у пациентов с AIDP и углубляют наше понимание основных механизмов, лежащих в основе иммунопатологии GBS. Наши выводы могут проложить путь к новым медицинским вмешательствам в самом начале возникновения симптомов для предотвращения прогрессирования заболевания и последующей заболеваемости и смертности.