Дрожжи имеют множество преимуществ в качестве модельного организма, причем не только для LS. Большинство клеточных функций, таких как репликация ДНК или ферментативная деятельность, действительно сохраняются между дрожжами и человеком.²⁶ Кроме того, их быстрое размножение и устойчивость к различным условиям роста делают их удобными для работы в лаборатории и обеспечивают воспроизводимость экспериментов.

В 1996 году был опубликован полный геном дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Он содержит более 6000 генов.^{27, 28} Эти знания привели к идентификации нескольких дрожжевых гомологов генов человеческих болезней²⁹ и способствовали дальнейшему повышению роли дрожжей как организма для изучения человеческих болезней на молекулярном и фармакологическом уровне. Основное преимущество дрожжей перед моделями болезней заключается в том, что гомоплазматические варианты мтДНК могут быть легко введены в дрожжи, поскольку репликация мтДНК в дрожжах не зависит от синтеза белка и не требует последовательности начала репликации. Кроме того, дрожжи могут выживать в отсутствие мтДНК и могут быть трансформированы бактериальной плазмидной ДНК, несущей митохондриальный ген.^{30, 31} За прошедшие годы было создано несколько моделей дрожжей с митохондриальным дефицитом для изучения митохондриальных заболеваний; обзор представлен в Ref. [32]. В таблице 1 представлены опубликованные штаммы дрожжей с мутациями, вызывающими LS. Как видно, большинство представленных штаммов имеют мутации в комплексах OXPHOS I, IV и V и ограничены лишь несколькими генами, в основном человеческими SURF1 и MT-ATP6.

TABLE 1. Selection of scientific publications based on yeast models of Leigh syndrome.

Обширные исследования в S. cerevisiae, проведенные Kucharczyk et al., показали, что мутация гена MT-ATP6 m.9176T>G приводит к дефектам сборки комплекса V,³⁸ а мутации MT-ATP6 в позиции 8993^{39, 46} приводят к дефициту комплекса IV, что позволяет предположить наличие механизма регуляции функциональности комплекса V посредством экспрессии Cox1p.^{39, 40, 47} Однако в клетках человека эта особенность не наблюдалась.⁴⁸ Отсутствие консервативных эффектов подчеркивает важность интеграции различных инструментов для изучения патологий человека. Недавно Baranowska и др. ввели две новые LS-ассоциированные мутации MT-ATP6 (m.8950G>A, m.9025A>G) в дрожжи и продемонстрировали значительное снижение производства АТФ и роста.⁴¹

Спустя четыре года после открытия мутаций в факторе сборки SURF1 как основной причины дефицита комплекса IV (COX),^{49, 50} Barrientos et al. создали модель дефицита в S. cerevisiae, отредактировав гомолог SURF1 Shy1³⁴, и подтвердили его важность для сборки COX. Исходя из этого, дальнейшие исследования на дрожжах помогли понять путь сборки комплекса IV.^{35, 51-53}

Saccharomyces cerevisiae имеет ограничения в качестве инструмента для изучения митохондриальных заболеваний, поскольку не экспрессирует комплекс I OXPHOS. В отличие от этого, Yarrowia lipolytica, дрожжи семейства Dipodascaceae, были использованы для изучения мутаций LS, связанных с комплексом I. Однако до сих пор было введено лишь несколько мутаций (табл. 1). Сайт-направленный мутагенез гомологов NDUFS7 и NDUFS8, кодируемых ядерными клетками человека, позволил получить фенотип LS в дрожжах.⁴⁴ В то же время Y. lipolytica, несущая мутацию в гомологе NDUFS3 человека, не показала снижения активности или содержания комплекса I.⁴⁵

В целом, большинство дрожжей с LS показали ухудшение роста на неферментируемом углероде (Таблица 1). В целом, дрожжи представляют собой очень полезный инструмент для моделирования генетических дефектов LS и, в частности, для изучения биохимических последствий митохондриальных дефектов. За последние 30 лет исследования на S. cerevisiae позволили получить важные сведения о функции и сборке белков, мутации которых, как известно, вызывают LS Кроме того, дрожжи можно использовать для скрининга лекарств.^{54, 55} Однако с 2011 года новые подходы к изучению LS или NARP отсутствуют.

Животные, не являющиеся млекопитающими, широко используются для моделирования ряда редких генетических заболеваний; обзор приведен в работе [56]. [56]. Для LS большинство не-млекопитающих моделей было создано для дефицита комплекса I, и только несколько - для комплекса II (например, для гена SDH), комплекса IV (например, для гена SURF1) и комплекса V (например, для гена MT-ATP6) (табл. 2).

TABLE 2. Selection of scientific publications based on non-mammalian models of Leigh syndrome.

Burman и др. создали Drosophila melanogaster модель, несущую короткую внутрикадровую делецию в гене mt-nd2.⁵⁷ Полученные мухи демонстрировали более мягкий фенотип, чем нокаутные модели MT-Nd2 млекопитающих. Тем не менее, общая активность комплекса I и производство энергии были снижены, а поведенческий и гистологический анализы выявили признаки митохондриального заболевания. Используя эту модель, авторы нашли дополнительные доказательства роли субъединицы mt-nd2 в прокачке протонов. В 2016 году модель mt-nd2^del1 была использована для тестирования рапамицина в качестве потенциального средства лечения.⁵⁸ Wang и др. обнаружили, что рапамицин устраняет дефект отложения жира у мух mt-nd2^del1 и наблюдает независимое от аутофагии увеличение продолжительности жизни. Однако поведенческий фенотип не изменился в результате лечения.

Одной из самых ранних моделей LS, не относящихся к млекопитающим, были две модели Drosophila melanogaster с пост-транскрипционным нокдауном surf1 по всему телу (Actin5C-GAL4) или по мозгу (elav-GAL4).⁶³ Авторы обнаружили фенотип, сходный с человеческим. В основном у этих плодовых мушек наблюдалось нарушение развития и локомоции, вызванной светом. Однако серьезные двигательные дефекты наблюдались только у мух с нокдауном Actin5C-GAL4 surf1. Напротив, мухи с нокдауном surf1 elav-GAL4 имели более продолжительную жизнь, чем контрольные особи, хотя у них были нарушены зрительные реакции, вероятно, из-за изменений в нескольких зрительных цепях.⁶³ Совсем недавно, используя технологию редактирования генов CRISPR/Cas9, Haroon и др. создали два делеционных штамма surf1-/- рыбок данио (Danio rerio), которые обнаруживали многие фенотипические признаки LS.⁷⁰ Они также обнаружили изменение индукции окислительного стресса и метаболизма глутатиона после обработки азидом натрия, ингибитором комплекса IV. Поразительно, что эта реакция была менее выраженной после профилактического лечения cysteamine bitartrate (Cyst-BIT) или N-acetylcysteine (NAC) - тиолсодержащими реагентами, которые могут представлять собой перспективные лекарственные кандидаты для лечения SURF1-ассоциированного LS и дефицита COX.⁷⁰

В 2006 году Celotto et al. обнаружили мутацию mt-atp6 в мутантном штамме Drosophila sesB1 (ant1). Их анализ показал, что эти мухи повторяют многие симптомы LS. Кроме того, авторы продемонстрировали, что нормальное дыхание может происходить, несмотря на дефекты в активности АТФ-синтазы.⁶⁵ Позже, в 2019 году, эта модель также использовалась для изучения сна и циркадной функции при митохондриальных энцефаломиопатиях^.66

В целом, модели млекопитающих животных имеют ряд преимуществ перед не-млекопитающими животными (описаны в разделе 2.1.2) для моделирования заболеваний. Их более тесная связь с человеком позволяет проводить более детальный анализ познания, движения и развития. Однако, как недавно отмечали Mukherjee et al.⁷¹ , выбор подходящей животной модели, способной воспроизводить патологию так же, как и у человека, имеет решающее значение. Кроме того, несмотря на постоянно развивающиеся методы создания трансгенных моделей животных, ученые сталкиваются лишь с некоторыми успехами и многими препятствиями, когда дело доходит до моделирования LS или митохондриальных заболеваний в целом; обзор приведен в работе [72].

Наиболее известной моделью LS у млекопитающих является нокаутная мышь Ndufs4 (табл. 3). Ndufs4 - ядерный ген, кодирующий вспомогательную субъединицу NADH-дегидрогеназы S4 комплекса OXPHOS I. На сегодняшний день несколько мутаций этого гена могут вызывать LS или дефицит митохондриального комплекса I у человека (OMIM № 252010), обзор которых приведен в работах [99, 100]. В 2008 году Kruse и др^.74 впервые опубликовали данные о гомо- и гетерозиготных нокаутных мышах Ndufs4. У этих мышей наблюдались симптомы, сходные с теми, что наблюдаются у пациентов с дефицитом комплекса I (CI). Позже были получены дополнительные нокаутные мыши Ndufs4 с тканеспецифическими нокаутами, в основном в мозге, сердце и скелетных мышцах (табл. 3). Lagrue et al.⁸⁵ использовали другой подход для имитации дефицита CI, подавляя функцию CI у молодых мышей с помощью 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридина (MPTP). Хотя у мышей наблюдались повышенный уровень лактата и дегенерация стриато-нигральной сети, как это бывает при LS, у них не было характерных симптомов LS.

TABLE 3. Selection of scientific publications based on mammalian models of Leigh syndrome.

SURF1 (Pig) Knockout IV Крайне тяжелый фенотип, характеризующийся задержкой роста/арестом, неуспеваемостью, постоянным тремором, множественными дефектами деятельности комплексов I, II и IV, скромными невропатологическими изменениями в ранней постнатальной фазе, микроглиозом HP: 0001508, HP:0001510, HP:0011968, HP:0001999, HP:0100022, HP:0000508, HP:0004305, HP:0008347, HP:0002344, HP:0410263 [98]

В 2003 г. была опубликована работа о нокаутной мыши Surf1.⁸⁷ Однако авторы смогли лишь частично имитировать фенотип LS человека в своей модели. Фактически, отличительная черта LS, поражение базальных ганглиев и ствола мозга, отсутствовала у нокаутных мышей Surf1. В 2018 году Quadalti и др.⁹⁸ применили новый подход к моделированию дефицита COX, создав нокаутных по Surf1 свиней с помощью новых инструментов редактирования генов TALEN и CRISPR/Cas9. Хотя у этих свиней не наблюдалось дефицита COX, они страдали от серьезной задержки роста и умирали вскоре после рождения. Таким образом, эта модель не полностью отображала человеческий фенотип LS, связанный с SURF1, но указывала на наличие серьезных особенностей развития, которые могут быть связаны с общим патогенезом LS.

Solute carrier (SLC) представляют собой суперсемейство из 55 семейств генов с общим количеством более 360 белок-кодирующих генов.¹⁰¹ Мутации в генах, принадлежащих к семействам SLC19 и SLC25¹⁰² и семейству SLC39, ассоциированы с LS.¹³ В 2017 году Terzenidou et al. создали модель мыши, несущую нонсенс-мутацию в высоко консервативном гене Slc25a46, что привело к потере функции белка. У мышей наблюдались некоторые типичные симптомы LS, такие как атаксия, судороги и ранняя летальность. На молекулярном уровне авторы обнаружили, что мутация негативно влияет на большую часть митохондриального интерактома в мозжечке⁹⁴.

В целом за последние десятилетия было создано множество различных моделей млекопитающих для изучения LS. Однако простое введение мутаций, связанных с LS, не всегда приводило к фенотипу, наблюдаемому у пациентов. Это усложняет изучение LS, поскольку, по-видимому, существует множество причин, лежащих в основе появления симптомов LS, что свидетельствует о сложности заболевания. В то же время некоторые модели, такие как нокаутные мыши Ndufs4, представляются надежной модельной системой и поэтому широко используются в сообществе, как показано в работе [100].

В целом, модели LS млекопитающих позволяют лучше понять, как конкретные мутации могут влиять на массу тела и питание, взаимодействие между различными органами (например, сердечной и нервной функциями), конкретные области мозга и регуляцию метаболитов. Кроме того, мышиные модели можно использовать для изучения токсичности и физиологии потенциальных лекарственных препаратов in vivo, что обеспечивает важную платформу для трансляционных исследований (табл. 3).

Получение первичных клеток, в основном фибробластов, из образцов биопсии кожи является обычной процедурой в процессе диагностики LS.¹⁴ Мы сосредоточились на публикациях, в которых первичные культуры клеток изучаются более подробно для исследования механизмов заболевания и лечения, а не только в диагностических целях (табл. 4).

TABLE 4. Selection of scientific publications based on primary cellular models of Leigh syndrome.

В 2007 году Koopman et al.¹⁰³ опубликовали исследование, в котором использовали 16 фибробластов, полученных от пациентов и несущих 16 различных ядерно-кодируемых мутаций комплекса I, и 6 контрольных линий фибробластов. Их целью было более детальное физиологическое и молекулярное изучение дефицита оксидоредуктазы NADH:убихинона у человека. Основные эксперименты были направлены на сравнение морфологии митохондрий и уровня реактивных видов кислорода (ROS). По мнению авторов, фибробласты пациентов с дефицитом CI можно было разделить на два класса, причем в классе I наблюдались более фрагментированные митохондрии после окрашивания родамином ¹²³ в живых клетках и более высокий уровень ROS по сравнению с классом II. В последующем исследовании с теми же линиями фибробластов были всесторонне изучены мембранный потенциал митохондрий (Δ ψ), запасы кальция и производство АТФ.¹⁰⁴ Авторы обнаружили сниженное содержание кальция в ЭР и сниженное производство АТФ в митохондриальном матриксе CI-дефицитных фибробластов, а также деполяризованный Δ ψ). Десять лет спустя Iannetti et al.106 использовали три ранее изученных фибробласта пациентов, несущих мутации NDUFS7-p.V112M, NDUFS8-p.R94C и NDUFV1-p.R59X/p.T423M103 в условиях культуры клеток, содержащих пируват и глюкозу, без галактозы и с замещением. В то время как контрольные линии выживали, фибробласты пациентов погибали в безглюкозной среде и восстанавливались только при добавлении пирувата и eNAD в дозозависимой манере. Авторы пришли к выводу, что eNAD восстанавливает Δ ψ), а пируват снижает уровень ROS.

Дальнейшие исследования дефицита комплекса I проводились на различных клеточных линиях, при этом наиболее предпочтительным типом клеток оставались фибробласты. Нокауты NDUFS4 были получены в первичных эмбриональных фибробластах мыши (MEFs), изокортикальных астроцитах и нейронах,¹¹¹ а также в клетках HEK293.¹¹² Несмотря на снижение функции CI и производства АТФ во всех типах клеток, Bird et al. смогли показать нарушение Δ ψ только в MEFs, но не в клетках нейронов, утверждая, что это может быть связано с ограничениями исследования.¹¹¹

Wojtala et al.¹⁰⁷ изучали продукцию ROS в фибробластах, полученных от пациентов, несущих мутации мтДНК (degrees of heteroplasmy) в MT-ND1 (100%), MT-ND3 (75%) и MT-ND5 (85%). На клеточных моделях они показали, что фосфорилирование белка p66Shc (который отсутствует у мышей) может активировать про-окислительный путь, который может быть ингибирован природным грибковым соединением hispidin.

Помимо дефицита COX, были изучены и другие клеточные модели LS. Дефицит COX изучался в 12 иммортализованных В-лимфоцитах, полученных от пациентов (с 15 различными мутациями SURF1), в работе Li et al.¹¹⁴ Преимущество этого исследования заключалось в менее инвазивном методе получения образцов пациентов. Сравнивая различные клеточные линии, авторы утверждали, что изученные миссенс-мутации ассоциируются с лучшим прогнозом заболевания по сравнению с нулевыми мутациями SURF1.

Кроме того, французско-канадский LS также изучался на фибробластах, несущих мутацию c.1119C>T в гене LRPPRC.¹¹⁰ Авторы не обнаружили увеличения продукции ROS, но обнаружили снижение Δ ψ, фрагментацию митохондриальной сети, нарушение OXPHOS-способности и повышенную чувствительность к Ca²⁺-индуцированному переходу проницаемости.

В целом, фибробласты, полученные от пациента, являются наиболее предпочтительным типом клеток человека для изучения патофизиологии и молекулярных механизмов LS. Преимущество клеток, полученных от пациента, заключается в том, что они несут всю генетическую информацию (как ядерную, так и митохондриальную) пациента и могут быть удобно культивированы. Однако фибробласты пациентов с LS не так сильно поражены, как клетки мышц или мозга. Однако эти другие типы клеток сложнее поддерживать в культуре, и их можно получить от пациентов только с помощью более инвазивных методов или для посмертных исследований. Тем не менее, в двух исследованиях были получены миобласты пациентов с LS, несущие мутации SURF1¹¹⁵ и ECHS1¹¹⁶. Мутация ECHS1 вызывает дефекты дыхательной цепи, и иммортализованные миобласты, полученные от пациентов, были всесторонне изучены.¹¹⁶ Миобласты, полученные от пациентов с мутацией SURF1, демонстрировали биоэнергетический дисбаланс в сторону гликолиза, нарушение клеточного цикла, повышенную пролиферацию и повышение регуляции протеасом.¹¹⁵ В заключение следует отметить, что клеточные модели, полученные от пациентов, относительно удобны для получения и были проанализированы с точки зрения пролиферации в различных составах ростовых сред и корреляции с уровнем гетероплазмии мтДНК. Их использование позволяет понять патогенность мутаций и выделить пораженные внутриклеточные пути.

Трансмитохондриальные клеточные гибриды (цибриды) получают путем слияния клеточной цитоплазмы без мтДНК (так называемых p0-клеток) с цитопластами другой клеточной линии. Этот метод был впервые описан King and Attardi в 1989 году¹¹⁷ и широко использовался в течение последующих 30 лет. Преимущество этого метода заключалось в том, что он позволял изучать LS и другие митохондриопатии на более надежной клеточной модели, чем первичные клетки, используя клеточные линии, которые можно было легко расширять в течение нескольких пассажей. Он также использовался для определения и подтверждения того, является ли митохондриопатия следствием генетического дефекта в мтДНК или nDNA. Всесторонний обзор цибридов в качестве модели заболевания при митохондриопатиях, включая преимущества и ограничения метода, приведен в обзоре, опубликованном в Ref. [118].

Для LS было создано множество цибридных линий для выявления дефицита комплексов I, IV и V. Самые ранние цибриды были созданы в начале 1990-х годов для дефицита COX. Tiranti et al.¹¹⁹ использовали цибриды, чтобы обнаружить, что мутации в nDNA вызывают дефицит COX. Они создали цибридную линию, несущую мтДНК пациента и здоровую nDNA (143BSCy.TK+), и другую клеточную линию, несущую nDNA пациента и здоровую мтДНК (SACy-Neor). Только в линии SACy-Neor были обнаружены дефекты COX, что позволило сделать вывод о том, что специфический дефицит COX у пациента был вызван мутациями nDNA. В последующем исследовании авторы смогли предположить, что дефицит COX у восьми пациентов был вызван мутациями в одном и том же гене, в результате слияния семи линий COX-негативных пациентов с предыдущей COX-негативной линией.¹²⁰ Год спустя эта гипотеза была подтверждена мутационным анализом, который выявил патогенные варианты в гене, кодирующем фактор сборки комплекса IV SURF1.⁴⁹

Для изучения биохимических эффектов мутации m.8993T>G MT-ATP6 Trounce et al. создали цибридную модель в 1994 году¹²¹ и измерили снижение максимального дыхания, а также уменьшение соотношения ADP/O. Кроме того, Manfredi и др.¹²² создали три цибрида, несущие мутацию m.8993T>G с разным уровнем гетероплазмии, и использовали добавление галактозы-олигомицина в среду для клеточной культуры для отбора клеток с разным уровнем гетероплазмии. Они обнаружили снижение мутантной нагрузки после 5 дней отбора и 1 дня восстановления. Другие мутации MT-ATP6 были изучены в цибридах. В 2009 году D'Aurelio опубликовал пять цибридных линий, несущих мутации m.8993T>G, m.8993T>C и m.9176T>G.¹⁷ Авторы обнаружили, что не только уровень гетероплазмии вносит вклад в тяжесть фенотипа LS, но и общий фон мтДНК, поскольку в этих цибридах было обнаружено несколько вариаций структурных генов других комплексов дыхательной цепи. Таким образом, важность секвенирования MT-ATP6 при подозрении на митохондриальное заболевание была подтверждена исследованиями Aure et al.¹²³ , Blanco-Grau et al.¹²⁴ и Lopez-Gallardo et al.¹²⁵ , в которых использовались цибридные модели с новыми мутациями MT-ATP6 (табл. 5).

TABLE 5. Selection of scientific publications based on trans-mitochondrial cybrids of Leigh syndrome.

Для изучения дефицита комплекса I были получены цибриды LS с мутациями в MT-ND1,^{130, 131} MT-ND2,¹²⁹ MT-ND3,¹⁴¹ MT-ND4,¹²⁶ MT-ND5,^{130, 133} и MT-ND6.^{127, 128, 130, 132, 142} Однако результаты этих исследований были неоднозначными, хотя некоторые мутации показали снижение активности CI^{127, 128, 130, 131, 133} или даже дефекты сборки,^{127, 129, 130} в недавнем исследовании Chen et al. не наблюдалось никаких серьезных метаболических дефектов в клетках, несмотря на снижение уровня АТФ¹³² (Таблица 5). Кроме того, интересный подход применили D'Aurelio et al., объединив две цибриды с мутациями в комплексе IV и III для изучения функциональной комплементации митохондрий¹³⁷.

Трансмитохондриальные цибриды были получены не только из клеток от пациентов, но и из клеток, полученных из мышиных моделей.^{143, 146, 147} Kirby et al.¹⁴⁴ создали мышиные трансмитохондриальные эмбриональные стволовые клетки (ESCs), несущие различные мутации в комплексе I и IV, и дифференцировали их в нейроны для моделирования нейродегенеративных эффектов мутаций мтДНК. Они показали, что мутации, приводящие к серьезным электрохимическим дефектам, также приводят к нарушению дифференцировки. В последующем исследовании Abramov и др.¹⁴⁵ сосредоточились на митохондриальном метаболизме этих пораженных линий нейронов и обнаружили увеличение Δ ψ и повышенное производство ROS в цибридах нейронов с мутацией в комплексе I, что привело к гибели клеток.

В заключение следует отметить, что трансмитохондриальные цибриды являются важными моделями для изучения LS и других митохондриальных заболеваний. В частности, создание цибрид стало современным подходом для подтверждения патогенности новых мутаций мтДНК, выявленных у пациентов, поскольку эти клетки можно использовать для анализа биохимических свойств и подтверждения генетической локализации дефекта.

Однако с развитием технологий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC), полученных от пациентов (см. раздел 2.3.1), цибридный подход используется все реже и может отойти на второй план в наборе инструментов для изучения заболеваний, связанных с митохондриями.

Для изучения дефицита комплекса I были получены цибриды LS с мутациями в MT-ND1,^{130, 131} MT-ND2,¹²⁹ MT-ND3,¹⁴¹ MT-ND4,¹²⁶ MT-ND5,^{130, 133} и MT-ND6.^{127, 128, 130, 132, 142} Однако результаты этих исследований были неоднозначными, хотя некоторые мутации показали снижение активности CI127, ^{128, 130, 131, 133} или даже дефекты сборки,^{127, 129, 130} в недавнем исследовании Chen et al. не наблюдалось никаких серьезных метаболических дефектов в клетках, несмотря на снижение уровня АТФ¹³² (Таблица 5). Кроме того, интересный подход применили D'Aurelio et al., объединив две цибриды с мутациями в комплексе IV и III для изучения функциональной комплементации митохондрий¹³⁷.

В 2006 году Takahashi and Yamanaka опубликовали новый метод перепрограммирования культур фибробластов в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSCs).¹⁴⁸ С тех пор началась новая эра моделирования заболеваний и поиска лекарств, что имеет важные последствия для LS.

Важно отметить, что во время стрессового процесса перепрограммирования клетки могут претерпевать геномные изменения, которые также могут влиять на мтДНК.¹⁴⁹ Это особенно важно для моделирования митохондриальных заболеваний, при которых генетический фон и уровень гетероплазмии являются критическими параметрами, определяющими фенотип и тяжесть заболевания. Несколько исследований показали, что варианты мтДНК могут изменяться в процессе перепрограммирования, как показано в работе [25]. [25]. Поэтому в дополнение к общему анализу контроля качества всех генерируемых клонов iPSC (включая кариотип, морфологию, плюрипотентность и анализ ДНК-отпечатков) становится очевидным, что тестирование последовательности мтДНК и гетероплазмии также должно быть включено, как рассмотрено в работах [150-153]. [150-153].

iPSCs в не-дифференцированном состоянии не представляют собой выбранную модель заболевания. На самом деле метаболизм плюрипотентных стволовых клеток в основном направлен на гликолиз, а не на OXPHOS.^{23, 154} Поэтому для создания модельных систем для митохондриальных заболеваний необходимо дифференцировать iPSC в определенные типы клеток. Возможность дифференцировать iPSCs в клеточные линии, которые сильно страдают при митохондриальных заболеваниях (например, нейроны или кардиомиоциты), дает наибольшее преимущество для изучения механизмов, лежащих в основе заболевания, и для скрининга лекарственных препаратов, как показано в работах [25, 152, 155]. [25, 152, 155].

В контексте LS первые модели iPSC были созданы в 2015 году на основе фибробластов, полученных от пациентов и несущих гетероплазматическую мутацию m.13513G>A MT-ND5 и гетероплазматическую и гомоплазматическую мутации m.8993T>G MT-ATP6.¹⁵⁶ Целью данного исследования было устранение присутствия мутации мтДНК для получения клеточных линий с исправленной функциональностью. Это было успешно достигнуто с помощью переноса ядер соматических клеток (SCNT), что продемонстрировало потенциал применения клеточной терапии при LS.

В 2017 году Lorenzи др.²² создали линии iPSCs для МТ-АТФ6-ассоциированного LS с мутацией m.9185T>C и дифференцировали их в neural progenitor cells (NPCs) и дофаминергические нейроны. В мутантных NPC они обнаружили аномально повышенный уровень Δ ψ, который они использовали в качестве показателя для высокопроизводительного скрининга лекарств. Они обнаружили, что ингибитор PDE5 аванафил способен снизить аномально повышенный потенциал митохондриальной мембраны (ПММ) в мутантных NPC и устранить дефекты кальциевой сигнализации как в мутантных NPC, так и в нейронах. В следующем году группа опубликовала еще несколько линий, несущих различные мутации MT-ATP6.^157-159

В период с 2016 по 2020 год Galera et al. опубликовали несколько линий LS iPSC, полученных от пациентов, несущих мутации в гене MT-ND5 (m.13513G>A)160-162 и гене MT-ATP6 (m.8993 T>G).¹⁶³ Для мутации MT-ND5 они обнаружили, что способность дифференцироваться в кардиомиоциты сильно зависит от степени мутации, что согласуется с выраженными симптомами кардиомиопатии у пациентов, несущих эту мутацию.¹⁶² Кроме того, они предположили, что iPSCs с более высокой степенью мутации могут благоприятствовать дифференцировке в нейроэктодермальную линию. В другом исследовании они дифференцировали те же самые iPSC в нейральные стволовые клетки и нейроны и наблюдали снижение функции OXPHOS и буферной способности кальция.¹⁶¹

Ген комплекса I NDUFS4, который был широко изучен в мышиных моделях (см. раздел 2.1.3), также был исследован в iPSCs. Две нокаутные линии iPSCs с NDUFS4 были получены с помощью редактирования генов CRISPR/Cas9.^{112, 164} Yoon и др. далее дифференцировали iPSCs в кардиомиоциты и смогли получить клеточный фенотип с более низким потенциалом митохондриальной мембраны, более высоким уровнем ROS и замедленным поглощением SERCA Ca²⁺.¹¹² В соответствии с этими результатами, Galera-Monge и др. дифференцировали линию iPSCs с NDUFS4-мутантом в нейрональную линию. Их нейроны NDUFS4-ko были функциональны, но демонстрировали повышенную гибель клеток и измененную регуляцию кальция.¹⁶¹

Авторы сравнили эффекты делеции Ndufs4 в мышах, клетках HEK293 и кардиомиоцитах, полученных из iPSC. Они наблюдали взаимодополняющие результаты, поскольку дефекты сердца мышей с Ndufs4-/= были воспроизведены в кардиомиоцитах, полученных из iPSC, что подтверждалось снижением натрий-(Nav1.5) и Ca2+-(SERCA2a) переходных процессов.¹¹² Они также предложили никотинамид рибозид (NR) в качестве потенциальной стратегии лечения LS.¹⁶⁵ Daneshgar et al. дифференцировали нокаутные iPSCs NDUFS4 в нейроны и органоиды мозга и обнаружили повышенную глутаматергическую excitotoxicity в провоспалительных условиях.1⁶⁴ Было обнаружено, что NPCs, несущие мутации в гене NDUFS4, имеют дефектную способность роста нейронов и нарушенную Δ ψ.¹⁶⁶

В целом, как подчеркивается в представленных здесь исследованиях (табл. 6), полученные от пациентов iPSCs представляют собой важную платформу для моделирования LS. В то же время во время перепрограммирования и после дифференцировки необходимо проводить всесторонний и трудоемкий анализ контроля качества, чтобы убедиться, что модель точно повторяет генетические характеристики пациента. iPSCs могут позволить создать модель заболевания, генетически близкую к пациенту, что дает множество преимуществ для углубления нашего понимания болезни и открытия инновационных и потенциально персонализированных вариантов лечения.

TABLE 6. Selection of scientific publications based on advanced cellular models of Leigh syndrome.

Органоиды - это самоорганизующиеся трехмерные (3D) кластеры клеток, воспроизводящие определенные аспекты структуры и функции человеческого органа. Они могут быть получены либо из соматических стволовых клеток, выделенных непосредственно от пациентов, либо путем дифференцировки плюрипотентных стволовых клеток. Последний способ наиболее широко используется для всех труднодоступных органов, таких как мозг. Дифференцировка основана на модуляции сигнальных путей, важных для развития ткани-мишени; обзор см. [180, 181].

В случае LS, поскольку специфические дефекты в основном затрагивают центральную нервную систему, органоидные модели в основном были сфокусированы на моделях мозга (табл. 6). Среди них для моделирования LS использовались как неуправляемые органоиды головного мозга^{166, 178} , так и регионарные управляемые органоиды коры¹⁶⁴ .

Inak и др. сгенерировали NPCs, дофаминергические нейроны и церебральные органоиды из iPSCs, полученных от пациентов с LS и несущих мутации c.530T>G и c.769G>A SURF1, и использовали технологию CRISPR/Cas9 для коррекции мутаций в iPSCs пациентов и, наоборот, для их внедрения в контрольные iPSCs, чтобы получить различные изогенные системы. Нейроны и органоиды головного мозга с мутацией SURF1 демонстрировали пониженное созревание нейронов и дефектную способность к росту нейронов. Дальнейший анализ выявил нарушение перехода от гликолиза к OXPHOS на уровне NPCs, что может быть патогенетической основой нарушенной морфологии в органоидах мутантов. Полученные данные подтверждают полезность использования bezafibrate для увеличения биогенеза митохондрий через PGC1α сигнализацию,¹⁶⁶ что, в свою очередь, улучшает способность нейронов к ветвлению. Таким образом, модуляция метаболизма клеток-предшественников может положительно повлиять на нейрогенез и потенциально улучшить аспекты нейроразвития LS.²¹ Эта особенность заболевания была использована для выявления потенциально пригодных для повторного использования лекарств на основе их способности исправлять дефекты морфогенеза в iPSC-произведенных нейронах и органоидах среднего мозга.¹⁸²

Romero-Morales и др. создали iPSC, несущие мутации в генах MT-ATP6/PDH (m.8993T>G/c.79delC), PDH (c.79delC) и DLD (c.100A>G). Они дифференцировали их в NPCs, нейронные розетки и церебральные органоиды. В отличие от 2D-культур нейронных клеток LS, которые практически не имели значительных различий в жизнеспособности и метаболизме по сравнению с контролем, 3D-органоиды головного мозга из нейронных клеток LD показали нарушение развития коры, нарушение митохондриальной сети и измененный метаболизм.¹⁷⁸ Это исследование подчеркивает потенциальное преимущество органоидных моделей по сравнению с 2D-культурами в воспроизведении некоторых сложных особенностей, наблюдаемых у пациентов с LS.

Эти два комплексных исследования органоидов LS продемонстрировали потенциал органоидных исследований в качестве растущей модельной платформы для LS. Для того чтобы сделать более точные выводы о влиянии мутаций, связанных с LS, на развитие органов и тканей, необходимы дополнительные органоидные модели. В контексте органоидов мозга необходимы инновационные подходы для включения кровеносных сосудов и иммунных клеток, таких как микроглия, что необходимо для решения нейровоспалительных аспектов, связанных с LS.¹⁸³ В целом, остается несколько вопросов относительно использования органоидов для моделирования LS и митохондриальных заболеваний, обзор которых см. в работе [25]. Текущие и будущие исследования, как мы надеемся, прольют новый свет на патологию LS и, возможно, определят новые мишени для вмешательства.

В этом обзоре мы рассказали о различных типах моделей заболеваний, доступных для LS. Учитывая сложность митохондриальных заболеваний в целом, разработка моделей заболеваний для LS была непростой задачей.¹³ Инновации в области методов редактирования генов, таких как CIRSPR/Cas9²³ и редактирование мтДНК¹⁸⁴ , играют важную роль в непрерывном развитии инновационных моделей заболеваний.

В начале 1990-х и 2000-х годов дрожжи были первым модельным организмом для LS. Благодаря ферментативному сходству с клетками человека и простоте редактирования мтДНК стало возможным изучать фундаментальные протеомные и функциональные аспекты LS. Однако были изучены только Shy1 (SURF1),^{35, 51} MT-ATP6,^{37, 38, 41, 43, 47, 185} и гены комплекса I^{44, 45}, которые представляют собой лишь небольшой процент генетических причин LS. Хотя дрожжи были предложены в качестве полезного инструмента для скрининга лекарственных препаратов против LS, этот подход не был активно использован в обзоре.^{54, 55} Следующими наиболее распространенными организмами для исследования LS являются небольшие не-млекопитающие животные, такие как Drosophila melanogaster,^{57, 59, 60, 63, 65-67} Caenorhabditis elegans,⁶⁸ или Danio rerio (zebrafish).⁷⁰ Все эти организмы в целом полезны для изучения нейродегенеративных заболеваний. В отличие от дрожжевых моделей, в течение многих лет были опубликованы модели не-млекопитающих с различными отредактированными генами (как nDNA, так и мтДНК). Кроме того, некоторые из этих видов лучше поддаются фенотипическому анализу, поскольку у них часто проявляются двигательные симптомы, такие как непереносимость физических нагрузок и мышечная слабость, которые наблюдаются и у пациентов.

Мыши генетически еще ближе к человеку, поэтому их широко использовали для изучения LS; обзор см. в статье [72]. [72]. Наиболее широко используемой моделью является нокаутная мышь Ndufs4⁷⁴ , которая демонстрирует фенотипические особенности, сходные с теми, что наблюдаются у пациентов. Однако чем сложнее организм, тем труднее моделировать заболевание. Например, некоторые мутации генов у мышей, призванные вызвать LS, не смогли этого сделать, вызвав аберрантные фенотипы, такие как увеличение продолжительности жизни, и зачастую вызывая больше вопросов, чем давая ответов.

LS в первую очередь поражает мозг, и неврологические симптомы схожи у всех пациентов.¹² Поэтому изучение LS в клеточных линиях нейронов - еще один подход к изучению этого заболевания. Поскольку линии нейронов невозможно получить от живых пациентов, инновационная разработка по перепрограммированию фибробластов в iPSCs,¹⁴⁸ которые (теоретически) могут быть дифференцированы в любую другую клеточную линию, изменила исследования LS. За последние 9 лет было опубликовано множество линий iPSC LS, в основном несущих мутации в MT-ATP6, SURF1 или генах, кодирующих структурные субъединицы или факторы сборки комплекса I. LS iPSC были использованы для получения дифференцированных клеток, таких как NPC, нейроны, астроциты, а также кардиомиоцитов и мышечных клеток. Кроме того, получение органоидов из iPSCs позволяет изучать влияние мутаций LS на развитие органов и тканей в контексте человека.²⁵ Таким образом, iPSCs могут проложить путь к персонализированной и мутационно-специфической медицине, а также к высокопроизводительному скринингу лекарств.

В данном обзоре литературы мы попытались представить всеобъемлющий обзор моделей заболеваний LS за последние 30 лет. Цель обзора - описать созданные модели и осветить их основные результаты. Мы показываем, как модели болезни LS развивались благодаря постоянному совершенствованию лабораторных методов. Ученые всего мира работали над выяснением механизмов, лежащих в основе LS, и разработкой новых методов лечения и терапии LS с использованием различных моделей. Этот обзор показывает, что сочетание различных модельных систем может дать нам глубокое понимание клеточных эффектов, вызываемых специфическими мутациями, и возникающих симптомов.

Если ядерные мутации можно легко ввести в организм с помощью технологии CRISPR/Cas9, то введение мутаций в мтДНК является более сложной задачей. Кроме того, уровень гетероплазмии мутаций мтДНК является критическим фактором, определяющим исход, симптомы и тяжесть заболевания. Поэтому генная инженерия мтДНК - еще одно направление исследований, направленных на разработку более совершенных моделей заболеваний и методов их лечения; обзор см. в статье [186].

В 2013 году Bacmanи др. представили mitoTALENs (mitochondria-targeted transcription activator-like effector nucleases) - сконструированную систему нуклеаз, нацеленных на митохондрии и способных распознавать специфические патогенные мутации в мтДНК живых клеток (цибридов) и органов мыши. Они были сконструированы таким образом, чтобы вызывать двунитевой разрыв (DSB), тем самым снижая уровень гетероплазмии только мутантных копий мтДНК.¹⁸⁷ В 2015 году та же лаборатория опубликовала mitoTALENS, специфичные для двух других мутаций, одна из которых m.13513G>A гена MT-ND5, ассоциированного с LS.¹⁸⁸ Однако группе не удалось свести мутационную нагрузку к нулю. Исследования продолжились, и в 2021 году группа Moraes и др. представила митохондриальные направленные мегануклеазы (mitoARCUS), которые были более специфичными и эффективными¹⁸⁹.

В 2020 году Mok и др. представили не содержащие РНК DddA-редакторы цитозиновых оснований (DdCBE), которые, в отличие от mitoTALENS и mitoARCUS, не вызывают двунитевых разрывов, но были способны напрямую исправлять мутации.¹⁸⁴ Однако возможны были только преобразования C*G в T*A. Эффективность варьировалась от 5 до 50 %, и часто наблюдались внецелевые эффекты.

Команды Minczuk et al. и Liu et al. смогли усовершенствовать метод, объединив его с цинковыми пальцами.¹⁹⁰ Например, Silva-Pinheiro et al. опубликовали библиотеку (названную MitoKO) точных редакторов оснований мтДНК, способных индуцировать преждевременные стоп-кодоны.¹⁹¹ В этом исследовании авторы провели редактирование оснований in vivo и ввели мутацию MT-ATP6 m.8096G>A в модель мыши. Позже они также использовали AAVs для доставки DdCBEs для редактирования мтДНК в ткани сердца живых мышей.¹⁹² Многообещающие результаты демонстрируют потенциал метода для разработки надежных моделей мтДНК-ассоциированных заболеваний млекопитающих, а также генотерапий против LS и других митохондриальных заболеваний. Недавно был опубликован протокол для библиотеки MitoKO193 , что делает этот метод более доступным для научного сообщества, что в будущем приведет к появлению большего количества модельных организмов, пониманию механизмов заболеваний и терапевтических решений.

Что касается влияния описанных здесь моделей и инструментов LS на ведение или лечение пациентов, то здесь были сделаны некоторые очень полезные открытия. Как уже говорилось ранее, лечение LS обычно включало только витамины, добавки или кетогенную диету.¹⁹⁴ Однако модель мыши Ndufs4, в частности, часто использовалась для тестирования потенциальных лекарств для лечения LS, например, ингибитора mTOR рапамицина (NCT03747328),¹⁹⁵ который был первоначально открыт на модели LS у дрозофилы (см. раздел 2.1.2 и таблицу 2). Другой ингибитор mTOR, ABI-009, в настоящее время исследуется в клинических испытаниях для лечения LS (NCT03747328). Поскольку разработки в области лечения редких заболеваний не очень прибыльны, для LS чаще всего проводятся исследования с открытой меткой, примером может служить исследование EPI743-12-002 (NCT02352896). Совсем недавно Европейское медицинское агентство (EMA) присвоило статус сиротского препарата Cannabidiol (EU/3/23/2800), который был изучен на мышиной модели Ndufs4⁷³ (см. табл. 3). Кроме того, Sildenafil также получил статус сиротского препарата от EMA (EU/3/23/2831) после обнаружения ингибиторов PDE5 в качестве перспективных лекарственных кандидатов в нейрональных прогениторных клетках, полученных от пациентов с LS.²² Nicotinamide riboside был предложен после исследований в iPSCs¹¹² (табл. 6) NDUFS4, но пока не имеет достаточных доклинических данных.¹⁶⁵ Соединения азола, такие как Talarazole и Sertaconazole, также были предложены в качестве потенциальных молекул для повторного использования в лечении LS.¹⁸²

Другим направлением лечения является генная заместительная терапия, которая изучалась на мышиной модели Ndufs4.¹⁹⁶ Кроме того, генная заместительная терапия с использованием вектора AAV9/hSURF1 (TGTX-102) у пациентов с LS с мутацией SURF1 получила обозначение сиротского препарата от EMA и FDA (EU/3/21/2531) после успешных исследований на нокаутных мышах Surf1.¹⁹⁷ В ближайшее время планируется провести клиническое исследование этой терапии.

В заключение следует отметить, что, несмотря на то, что адекватного лечения или излечения пациентов с LS до сих пор не существует, разработанные модели и инструменты LS широко используются для изучения потенциальных лекарств. В частности, разработка нокаутной мыши Ndufs4 и iPSC-моделей за последнее десятилетие привела к тестированию большего количества лекарств, даже на основе старых наблюдений. Это подчеркивает, что только глубокое и всестороннее понимание болезни и наличие достаточного количества инструментов позволит изучать и разрабатывать методы лечения, особенно для такого сложного митохондриального заболевания, как LS.