RASопатологии вызываются зародышевыми активирующими или нулевыми патогенными вариантами множества различных генов, кодирующих регуляторы или другие компоненты хорошо изученной, но очень сложной внутриклеточной сигнальной сети, составляющей RAS/MAPK-путь (Rauen, 2022) (Таблица 1). Патогенные варианты RAS/MAPK-пути, ассоциированные с RASопатиями, приводят к внутриклеточной активации или неправильной сигнализации конечных эффекторов этого пути, а именно ERK1 и ERK2 (также известных как MAPK3 и MAPK1, соответственно) (рис. 1). Многие варианты генов, ассоциированные с RASопатиями, уникальны, не встречаются при раке и активируют RAS/MAPK-путь в меньшей степени, чем те, которые ассоциированы с раком (Schubbert et al., 2007). Таким образом, RASопатологии как группа пролили свет на важность трансдукции сигнала RAS/MAPK и его регуляции не только при раке, но и в процессе развития.

RAS-путь является высоко контролируемым и важным для передачи внеклеточных стимулов для достижения соответствующих внутриклеточных ответов (Kiel et al., 2021). Он активируется многочисленными внеклеточными стимулами через различные рецепторы, включая рецепторные тирозинкиназы, цитокиновые рецепторы, рецепторы, связанные с G-белками, и рецепторы внеклеточного матрикса. RAS существует в виде семейства ГТФаз, наиболее изученными из которых являются KRAS, NRAS и HRAS. Соматические варианты в RAS или в других компонентах пути активируют эту жизненно важную клеточную сигнальную сеть, приводя к ее дисрегуляции, что в конечном итоге может привести к раку (Prior et al., 2020). Мутации KRAS - это генетические мутации, наиболее часто встречающиеся при раке человека, за ними следуют мутации NRAS (Papke and Der, 2017), в то время как мутации HRAS при раке человека встречаются редко. Эти гены кодируют три канонических белка RAS и, вместе с другими членами семейства RAS, при мутации могут вызывать RASопатологии (рис. 1). Поскольку все клетки млекопитающих зависят от передачи сигналов RAS в важнейших клеточных процессах, вполне понятно, что дисрегуляция этого сигнального пути может оказывать глубокое влияние на развитие. Путь RAS служит биохимическим центром передачи сигнала, который контролирует множество нижележащих эффекторных каскадов. Каскад эффекторов RAS/MAPK был первым сигнальным путем, который был идентифицирован ниже по течению от RAS (рис. 1) (Klomp et al., 2021). Другие эффекторные пути, расположенные ниже по течению от RAS, включают: фосфоинозитид-3-киназный путь (PI3K), который опосредует транскрипцию и антиапоптотическую активность через протеинкиназу AKT; стимулятор диссоциации гуанин-нуклеотидов RAL (RALGDS), который участвует в транскрипции, клеточном цикле, выживании клеток и транспорте везикул; каскад фосфолипазы Ce (PLCe), который контролирует кальциевую сигнализацию и активацию протеинкиназы C (PKC); TIAM1, который находится ниже по течению от RAS и регулирует сигнализацию RAC1; и RIN1, который важен для RAS-опосредованного эндоцитоза (Klomp et al. , 2021).

В своей простейшей форме RAS в активном состоянии вызывает фосфорилирование протеинкиназ RAF. Семейство протеинкиназ RAF включает в себя ARAF, BRAF и CRAF (также известную как RAF1). Все три киназы были обнаружены мутировавшими при различных RASопатиях: ARAF при CCLAs (Li et al., 2019), BRAF при CFC (Niihori et al., 2006; Rodriguez-Viciana et al., 2006) и CRAF при NS (Pandit et al., 2007; Razzaque et al., 2007). После активации RAF фосфорилирует и активирует MEK1 (кодируется геном MAP2K1) и MEK2 (кодируется геном MAP2K2). Как MAP2K1, так и MAP2K2 мутируют и вызывают CFC (Rodriguez-Viciana et al., 2006). Изоформы белков MEK1 и MEK2 - это треонин/тирозиновые киназы, которые имеют примерно 85 % одинаковых аминокислот (Wu et al., 1993), но, как известно, не являются избыточными по функции (Alessandrini et al., 1997; Brott et al., 1993). И MEK1, и MEK2 могут фосфорилировать и активировать киназы ERK1 и ERK2. Мутации ERK2 были определены как одна из причин NS (Motta et al., 2020). После фосфорилирования ERK1 и ERK2 являются конечными активированными киназами пути RAS/MAPK и фосфорилируют свои субстраты по остаткам серина/треонина, прилегающим к консенсусной последовательности пролина (рис. 1). Эти последовательности являются общими для других членов семейства MAPK-путей, включая путь c-Jun N-terminal kinase (JNK) и путь p38 (Lavoie et al., 2020). ERK1 и ERK2 фосфорилируют сотни нижележащих внутриклеточных и ядерных субстратов, которые в конечном итоге оказывают различное клеточное действие (Unal et al., 2017; Yoon and Seger, 2006). Субстраты ERK1/ERK2 включают ядерные компоненты, факторы транскрипции, мембранные белки и протеинкиназы, которые, в свою очередь, контролируют важнейшие клеточные функции, включая прогрессию клеточного цикла, дифференцировку и контроль клеточного роста. После активации RAS/MAPK-пути существует множество клеточных белков и петель обратной связи, которые негативно регулируют этот путь, чтобы затушить или инактивировать его (Lake et al., 2016). Некоторые из этих регуляторных компонентов пути включают белки, активирующие RAS GTPase (RASGAPs), белки sprouty (SPRY), белки, связанные с sprouty, белки-ингибиторы, супрессоры киназ и фосфатазы (Zaballos et al., 2019).

RASопатологии также обусловлены патогенетическими механизмами как канонического, так и неканонического путей RAS, которые приводят к общему последующему эффекту. Различные компоненты этих двух путей включают рецепторные тирозинкиназы, ГТФазы, RASGAPs, факторы обмена гуанина RAS (RASGEFs), киназы, scaffolding или адаптерные белки, убиквитин-лигазы, фосфатазы и ингибиторы пути (Таблица 1) (Tidyman and Rauen, 2016). Хотя мы еще не до конца понимаем, как функционирует RAS/MAPK-путь, он работает не линейно, как это изображено в его простейшей форме, а скорее как очень сложная сеть, включающая перекрестные связи и временно-пространственную активацию и регуляцию (Kiel et al., 2021). Именно эта сложность лежит в основе сложных синдромов RASопатий.

С патогенетической точки зрения, как группа заболеваний, RASопатологии уникальны, поскольку они основаны на пути (рис. 1). Хотя генетические варианты в генах, кодирующих различные компоненты RAS/MAPK-пути, приводят к патогенным изменениям и дисрегуляции пути различными способами, общим базовым биохимическим результатом, разделяемым всеми RASопатиями, является неправильная активация RAS/MAPK-пути и дисрегуляция пути. Эта общность обусловливает совпадающие фенотипические признаки (табл. 1), наблюдаемые при этих синдромах, и подчеркивает важную роль, которую RAS/MAPK-путь играет в нормальном эмбриональном и постнатальном развитии.

RASопатологии вызывают слабость и аномалии скелетных мышц Одним из основных фенотипических признаков RASопатий является клиническая гипотония, которая включает в себя мышечную слабость и снижение мышечной массы (рис. 2) (Stevenson et al., 2012). У пораженных новорожденных может наблюдаться гипотония, характеризующаяся отсутствием мышечного тонуса, мышечной слабостью, неспособностью поддерживать голову, нарушением моторных ориентиров и задержкой нервно-мышечного развития (табл. 1). В результате у многих младенцев могут возникать трудности с кормлением, которые часто требуют медицинского и/или хирургического вмешательства, что может привести к значительной заболеваемости (Gripp et al., 2019; Pierpont et al., 2014; Romano et al., 2010; Tidyman et al., 2011).

Большинство исследований аномальных особенностей скелетных мышц, связанных с RASопатиями, проводилось на людях с NF1 (Summers et al., 2015). У детей с NF1 отмечается уменьшение общего размера поперечного сечения мышц (Stevenson et al., 2005) и снижение массы сухой ткани (Dulai et al., 2007) по сравнению с контрольными лицами без патологии. Кроме того, у пациентов с NF1 было обнаружено значительное снижение силы нижней части тела по сравнению с контрольной группой, не имеющей противопоказаний по возрасту, о чем свидетельствуют функциональные тесты, включающие динамометрию с разгибанием бедра (вставка 1) и измерение пиковой силы при прыжке (Hockett et al., 2013; Johnson et al., 2012). У таких людей также заметно снижается сила мышц предплечья, что подтверждается динамометрией кистевого хвата (Souza et al., 2009). Более того, в большом исследовании, включавшем детей с NS, CFC, CS и NF1, у всех них была значительно снижена сила захвата кисти по сравнению с контрольной группой незатронутых сиблингов, причем наиболее выраженная мышечная слабость наблюдалась у детей с CS and CFC (Stevenson et al., 2012). В этом исследовании был сделан вывод о том, что, хотя мышечная сила может постепенно увеличиваться с возрастом и развитием, она не нормализуется в группах с синдромом RASopathies. Таким образом, хотя при клиническом осмотре предполагалось, что люди с RASopathies проявляют слабость, объективные исследования окончательно показали, что люди слабее, а следующие этапы исследований объяснили, почему.

Связь между скелетной миопатией и RASopathies впервые была выявлена в ранних сообщениях о случаях гипотонических младенцев с клиническими признаками, похожими на CS или CFC. Биопсия скелетных мышц у этих пациентов выявила увеличение количества интрафузальных мышечных волокон (вставка 1) или мышечных веретен (вставка 1), а также наличие в большинстве случаев мелких, атрофированных, экстрафузальных мышечных волокон (de Boode et al., 1996; Selcen et al., 2001; Stassou et al., 2005; van der Burgt et al., 2007). Эти гистологические данные, а также ослабленные мышцы, наблюдаемые у пациентов при клиническом осмотре, послужили поводом для более детального, систематического исследования скелетных мышц у пациентов с RASopathies, включая оценку биопсий мышц, полученных от когорты пациентов в возрасте от 11 недель до 8 лет с молекулярным диагнозом CS или CFC (Tidyman et al., 2011). Это исследование показало, что большинство биоптатов содержали чрезмерно мелкие мышечные волокна, составляющие в среднем лишь 66 % от среднего стандартного значения диаметра волокон у контрольных лиц без патологии (Tidyman et al., 2011), и выявило высокую степень вариабельности размера миофибрилл. Кроме того, в биоптатах мышц CS и CFC было обнаружено преобладание быстрых мышечных волокон второго типа (вставка 1), в среднем на 20 % больше волокон второго типа, чем среднее стандартное значение для возраста в общей популяции (Johnson et al., 1973). Однако в биоптатах мышц из этой когорты CS и CFC не было обнаружено ни избытка мышечных веретен, ни, что очень важно, каких-либо признаков дегенерации или регенерации мышечных волокон, характерных для дистрофических мышц. В соответствии с этим выводом биопсии мышц из когорты пациентов с NF1 в возрасте от 3 до 40 лет также не выявили признаков дегенерации или регенерации мышц, что позволяет предположить, что миопатия, связанная с RASопатиями, не является дегенеративной, как это может наблюдаться при дистрофиях (Summers et al., 2018a). Однако в когорте NF1 присутствовали мышечный фиброз и инфильтрирующие мононуклеарные клетки, свидетельствующие о воспалении. Еще одним подтверждением фенотипической вариабельности, наблюдаемой среди синдромов RASopathies, является высокий уровень накопления внутриклеточных липидов в биоптатах мышц NF1, чего не наблюдалось в биоптатах CS или CFC (Summers et al., 2018a; Tidyman et al., 2011). Чтобы понять механизмы, с помощью которых дисрегуляция активации RAS/MAPK-пути приводит к таким аномалиям скелетных мышц при RASопатиях, нам необходимо лучше понять биохимическую роль RAS/MAPK-пути в нормальном развитии скелетных мышц.

Скелетные мышцы формируются во время эмбрионального развития млекопитающих в результате процесса, называемого миогенезом. Этот процесс был изучен на примере птичьих и млекопитающих модельных систем. Большинство скелетных мышц в процессе эмбрионального развития происходит из параксиальной мезодермы (вставка 1). Эта мезодермальная ткань сегментируется на отдельные участки ткани, называемые сомитами, которые примыкают к нервной трубке и хорде (Buckingham et al., 2003). Вентральная часть каждого сомита, склеротом, участвует в формировании хряща и кости. Дорсальная часть, называемая дермомиотомом, формирует дерму и является источником клеток-предшественников мышц (MPC) (Buckingham et al., 2003). По мере созревания сомитов клетки в медиальной части дермомиотома удлиняются и формируют первую мускулатуру, называемую миотомом (Gros et al., 2005). MPCs и миоциты из сомитов на уровне конечностей мигрируют, следуя дорсальным и вентральным путями, для формирования мускулатуры конечностей (Christ and Ordahl, 1995). Во время своей первоначальной миграции и в процессе развития мышечной массы конечности эти клетки подвергаются обширной пролиферации по мере развития отдельных мышц конечности. Впоследствии MPCs необратимо превращаются в мышечные клетки, называемые миобластами (вставка 1; рис. 3) (Tajbakhsh et al., 2009). Миобласты продолжают пролиферировать, а затем начинают дифференцироваться, образуя постмитотические мышечные клетки, или миоциты. Миоциты - это одноядерные клетки, которые продолжают свою миграцию и в конечном итоге сливаются вместе, образуя многоядерные, незрелые мышечные волокна, или миотрубки. Во время позднего эмбрионального и постнатального развития миотрубки созревают, группируются и подвергаются гипертрофии, образуя зрелые мышечные волокна, или миофибриллы (Bentzinger et al., 2012). Во время эмбрионального развития мышечная масса увеличивается преимущественно за счет пролиферации миобластов, тогда как на более поздних стадиях развития и у взрослого человека рост мышц происходит в основном за счет гипертрофии мышечных волокон (Bentzinger et al., 2012).



Fig. 3.

RAS/MAPK signaling effects on the stages of skeletal myogenesis. RAS/MAPK pathway signaling stimulates proliferation of muscle precursor cells (MPCs) and myoblasts, and inhibits terminal differentiation of myoblasts and the formation of myotubes. MPCs are irreversibly determined to become proliferating myoblasts. Decreased signaling of the RAS/MAPK pathway induces myoblasts to differentiate, forming post-mitotic muscle cells known as myocytes. Myocytes eventually fuse together to form multinucleated immature muscle fibers, known as myotubes. Shown here are the temporal protein expression patterns of transcription factors that coordinate myogenesis. These transcription factors include PAX3 and PAX7, MyoD, MYF5, myogenin (MYOG), MRF4 and myocyte enhancer factor 2 (MEF2). Current research using mouse models for neurofibromatosis type 1 (NF1), Costello syndrome (CS) and cardio-facio-cutaneous syndrome (CFC) have demonstrated inhibition of myoblast differentiation in vitro, as well as a decrease in the number of MyoD- and Myog-expressing cells, which are markers for differentiation during embryonic skeletal muscle formation. This is indicated by a pink line and a downwards arrow (?) (Kossler et al., 2011; Maeda et al., 2021; Tidyman et al., 2021). Concomitant with this, RASopathy mouse models have demonstrated an increase in the number of cells expressing the PAX7 protein, which is a marker for muscle progenitor cells and myoblast proliferation, as indicated by a pink line and an upwards arrow (up).

Процесс миогенеза контролируется тесно скоординированной, временной экспрессией специфических транскрипционных факторов (рис. 3). Миогенез начинается в мезодерме сомитов с экспрессии paired гомеобокс-доменных транскрипционных факторов PAX3 и PAX7, которые индуцируют спецификацию МПК в миогенную линию (Buckingham, 2006; Relaix et al., 2005). Необратимая приверженность МПК к миогенной линии с последующей их дифференцировкой регулируется последовательной экспрессией набора специфических для мышц транскрипционных факторов, называемых миогенными регуляторными факторами (MRFs) (Buckingham and Rigby, 2007; Tapscott, 2005). MRFs состоят из четырех членов семейства транскрипционных факторов с основной спиралью-петлей-спиралью, которые включают MyoD (также известный как MYOD1), MYF5, миогенин (MYOG) и MRF4 (также известный как MYF6). Присутствие MYF5 и MyoD в клетках индуцирует переход MPCs в миобласты, вызывая их клеточное перепрограммирование и инициируя их дифференцировку (Cao et al., 2010; Davis et al., 1987). Последующая экспрессия генов MYOG (кодирующего миогенин) и MRF4 индуцирует переход миобластов в непролиферативные миоциты, которые сливаются и образуют многоядерные миотрубки, в конечном итоге превращающиеся в мышечные волокна (Bentzinger et al., 2012). Другим важным семейством транскрипционных факторов является фактор миоцитов 2 (MEF2), состоящий из четырех членов, кодируемых генами MEF2A, MEF2B, MEF2C и MEF2D. MEF2A и MEF2C экспрессируются на этой стадии развития скелетных мышц (Black and Olson, 1998). MRFs и MEF2 действуют совместно, регулируя экспрессию большинства специфических для мышц генов на протяжении всего последующего развития мышц, а также в зрелых мышцах (Bentzinger et al., 2012; Black and Olson, 1998; Molkentin and Olson, 1996).

Путь RAS/MAPK играет важную роль в развитии скелетных мышц, хотя степень его участия в этом процессе еще не до конца выяснена. Ранние исследования in vitro с использованием клеточных линий миобластов показали, что индуцированная факторами роста передача сигналов RAS/MAPK-пути необходима для пролиферации миобластов, а последующее снижение активности RAS-пути, вызванное отменой факторов роста, требуется для выхода из клеточного цикла и продолжения дифференцировки миобластов (Bennett and Tonks, 1997; Tortorella et al., 2001). Аналогичным образом, другие исследования in vitro показали, что избыточная экспрессия онкогенного RAS и конститутивно активная экспрессия онкогенных вариантов белков RAF1 и MEK1, которые активируют RAS/MAPK-путь, поддерживают миобласты в пролиферативном состоянии и подавляют дифференцировку миобластов (Dorman and Johnson, 1999; Konieczny et al., 1989; Olson et al., 1987; Weyman and Wolfman, 1998). Эти данные позволяют предположить, что сигнализация RAS/MAPK играет центральную роль в контроле пролиферации и дифференцировки MPCs и миобластов во время эмбрионального развития. Помимо онкогенных вариантов, активирующих RAS/MAPK-путь, было показано, что специфические синдромальные гетерозиготные генные мутации, ответственные за RASопатологии, включая варианты в HRAS, вызывающие CS, и варианты в BRAF, MAP2K1 или MAP2K2, вызывающие CFC, также подавляют дифференцировку миобластов in vitro (Tidyman et al., 2011). Установление того, что варианты RASопатий дисрегулируют миогенез в культуре, стало первым ключевым шагом к пониманию синдрома слабости. Однако использование мышиных моделей сыграло ключевую роль в определении механизмов, с помощью которых эти варианты RASопатий влияют на нормальное развитие скелетных мышц.

Большая часть нашего механистического понимания того, как RASопатии влияют на нормальное развитие мышц, была получена на мышиных моделях. К ним относятся мышиные модели NF1 (Brannan et al., 1994; Kolanczyk et al., 2007; Kossler et al., 2011; Sullivan et al., 2014; Summers et al., 2018b), CFC (Andreadi et al., 2012; Maeda et al., 2021) и CS (Chen et al., 2009; Tidyman et al., 2021), которые были использованы для изучения фенотипических характеристик и молекулярной этиологии скелетных миопатий, а также влияния дисрегуляции пути RAS/MAPK на развитие скелетных мышц при этих RASопатиях.

Интересно, что гетерозиготная нокаутная модель мыши NF1 (Nf1+/-), генокопирующая человеческий синдром NF1, который вызывается гетерозиготными мутациями в гене neurofibromin (NF1) (Cawthon et al., 1990; Viskochil et al., 1990; Wallace et al., 1990), не воспроизводит фенотип мышц, встречающийся у людей с NF1 (Brannan et al., 1994). Эта гетерозиготная (Nf1+/-) модель мышей воспроизводит очень немногие клинические признаки NF1, одним из которых является нарушение заживления костей. Мыши Nf1+/- имеют нормальный размер мышц и силу захвата передней конечности по сравнению с мышами дикого типа и не демонстрируют никаких аномалий скелетных мышц при гистологическом исследовании (Kossler et al., 2011; Sullivan et al., 2014). Напротив, гомозиготный нокаут Nf1 у мышей приводит к летальному исходу на 12,5-14 день эмбрионального развития из-за дефектов сердца и нервного гребня (Brannan et al., 1994). Чтобы обойти эту проблему, были сгенерированы два тканеспецифичных, условных, гомозиготных нокаутных мутанта Nf1, которые позволили исследователям изучить влияние потери NF1 на развитие скелетных мышц. В первом из этих мутантов трансген MyoD-Cre был использован для нокаута Nf1 именно в скелетных мышцах (Nf1^MyoD-/-). При втором мутанте Nf1 был нокаутирован под контролем трансгена Prx1-Cre (Nf1^Prx1-/-) специфическим для мезенхимных клеток конечностей образом (Kossler et al., 2011; Sullivan et al., 2014). Prx1 является энхансером в конечности, который управляет экспрессией рекомбиназы Cre в этой трансгенной модели мыши. В мышечно-специфической модели мышей с нокаутом Nf1^MyoD-/-, Nf1 был инактивирован в миобластах во время дифференцировки и оставался инактивированным во время последующего развития мышц (Sullivan et al., 2014). Мыши Nf1^MyoD-/- были маленькими при рождении по сравнению с контрольными сородичами, но не имели выраженных аномалий скелетной мускулатуры (Sullivan et al., 2014). Гистологическое исследование их мышц в возрасте 2, 4 и 6 дней не выявило различий в размерах миофибрилл по сравнению с таковыми у однопометников дикого типа, также у этих мышей не наблюдалось фиброза. Однако у них было отмечено значительное увеличение внутримиоцеллюлярных липидных отложений, что свидетельствует о глубоких изменениях в липидном обмене (Sullivan et al., 2014).

Напротив, модель мышей Nf1^Prx1-/-, в которой Nf1 условно нокаутирован на ранних стадиях развития в мезенхимных клетках зачатков конечностей, выживает и демонстрирует обширные дефекты скелетных мышц (Kossler et al., 2011). У мышей Nf1^Prx1-/- наблюдается снижение массы тела на 25 %, уменьшение массы трехглавой мышцы на 50 % и снижение силы мышц передних конечностей при хвате, а также накопление внутриклеточных липидных отложений по сравнению с таковыми у их собратьев дикого типа (Таблица 2). Кроме того, в мышцах мышей Nf1^Prx1-/- наблюдалось снижение общего количества мышечных волокон на единицу площади на ~50 %, что объяснялось распространенным фиброзом. Скоординированная экспрессия белков транскрипционных факторов MRF, MyoD и myogenin отвечает за дифференцировку миобластов и их последующее слияние в многоядерные миотрубки; таким образом, эти транскрипционные факторы используются в качестве молекулярных маркеров дифференцировки миобластов (Buckingham and Rigby, 2007; Tapscott, 2005). Изучение развития мышц между 12 и 14 днями эмбрионального развития у Nf1^Prx1-/- мышей выявило заметное снижение количества клеток, экспрессирующих MyoD и миогенин, в развивающихся мышцах задних конечностей (Kossler et al., 2011). Это свидетельствовало о нарушении миогенеза и снижении формирования мышечных волокон во время эмбрионального развития из-за потери функционального NF1 и вызванной этим неадекватной активации пути RAS/MAPK в этот критический период дифференцировки мышц. Это первое сообщение о подавленном формировании мышц in vivo из-за неправильной активации RAS/MAPK-пути в модели RASопатий. В подтверждение этого вывода сателлитные клетки (вставка 1), полученные от взрослых мышей Nf1^Prx1-/-, также демонстрируют сниженный уровень дифференцировки in vitro по сравнению с сателлитными клетками дикого типа (Kossler et al., 2011). Кроме того, лечение беременных самок, вынашивающих потомство Nf1^MyoD-/-, ингибитором MEK PD0325901 корректировало некоторые миопатические признаки у 3-дневных мышат (Summers et al., 2018b). Лечение PD0325901 привело к увеличению массы тела и снижению накопления липидов в мышцах у детенышей Nf1^MyoD-/- самок, получавших лечение, по сравнению с контрольной группой, не получавшей лечения. В отличие от этого, лечение 4-недельных Nf1^Prx1-/-мышей препаратом PD0325901 в течение 8 недель не привело к восстановлению каких-либо скелетных миопатий, включая мышечную массу, силу или накопление липидов в мышцах (Summers et al., 2018b).

Таблица 2 Сравнение фенотипов мышц в трех моделях мышей с RASопатиями

Два недавних исследования на моделях мышей CFC BrafL597V и CS HrasG12V позволили получить значительную клеточную и молекулярную информацию о роли пути RAS/MAPK в нормальном развитии скелетных мышц и о том, как активация этого пути при RASопатиях влияет на развитие скелетных мышц и вызывает скелетную миопатию (Maeda et al., 2021; Tidyman et al., 2021). Эти исследования также пролили свет на роль других внутриклеточных сигнальных путей, важных для развития скелетных мышц, и их взаимодействие с RAS/MAPK-сигнализацией. Модели мышей CFC BrafL597V и CS HrasG12V схожи в отношении их влияния на развитие скелетных мышц и возникающей скелетной миопатии, поэтому обе модели представлены и обсуждаются вместе. CFC вызывается активирующими гетерозиготными зародышевыми мутациями в генах BRAF, MAP2K1, MAP2K2 или реже в KRAS (Niihori et al., 2006; Rodriguez-Viciana et al., 2006). Модель мыши CFC BrafL597V (Andreadi et al., 2012) является носителем активирующего зародышевого гетерозиготного мутанта BRAF p.L597V, который приводит к промежуточному уровню активации RAS/MAPK-пути (Andreadi et al., 2012). Важно отметить, что этот вариант был зарегистрирован у лиц с клиническим диагнозом CFC и NS и ассоциирован с общим мягким фенотипом RASopathies, вероятно, из-за промежуточного уровня активации RAS/MAPK-пути (Pierpont et al., 2010; Sarkozy et al., 2009). Мышиная модель CFC BrafL597V воспроизводит многочисленные клинические характеристики людей с CFC, включая уменьшенный размер и вес тела, черепно-лицевую дисморфию, сердечные аномалии и скелетную миопатию (Andreadi et al., 2012; Maeda et al., 2021).

CS вызывается гетерозиготными зародышевыми активирующими вариантами в HRAS (Aoki et al., 2005). Наиболее распространенным миссенс-вариантом, ассоциированным с CS, является HRAS p.G12S, а вторым по частоте - p.G12A (Rauen, 2007). Миссенс-вариант HRAS ^p.G12V, хотя и встречается реже, также был зарегистрирован у людей с CS и обычно приводит к тяжелому фенотипу (Quezada and Gripp, 2007). Мышиная модель CS Hras^G12V содержит активирующую гетерозиготную мутацию Hras^G12V и точно повторяет типичные клинические признаки, связанные с CS, включая снижение веса при рождении, черепно-лицевую дисморфию, сердечные аномалии и предрасположенность к раку (Chen et al., 2009). Обе мышиные модели CS Hras^G12V и CFC Braf^L597V точно воспроизводят общую патогенетическую этиологию ассоциированных с ними синдромов RASопатий: активацию пути RAS/MAPK. Наши исследования показали примерно 3,2-кратное увеличение уровня фосфорилированного ERK (pERK) в скелетных мышцах у мышей CS Hras^G12V по сравнению с мышами дикого типа и 2,5-кратное увеличение уровня pERK в скелетных мышцах у мышей CFC Braf^L597V по сравнению с контролем (Таблица 2) (Maeda et al., 2021; Tidyman et al., 2021). Сравнение активации RAS/MAPK-пути между этими двумя моделями мышей дает некоторое представление о роли дисрегуляции RAS/MAPK-сигнализации в развитии скелетных мышц и скелетной миопатии. В обеих моделях наблюдается снижение массы тела и массы скелетных мышц по сравнению с однопометниками дикого типа, при этом у мышей CS Hras^G12V эта проблема выражена сильнее (табл. 2) (Maeda et al., 2021; Tidyman et al., 2021). У мышей CFC Braf^L597V и CS Hras^G12V в возрасте 1 месяца вес трехглавой мышцы составляет примерно 78 % и 56 %, соответственно, от веса мышей дикого типа. Аналогично, сила хвата передней конечности составляет 68 % и 52 %, соответственно, от таковой у мышей дикого типа в возрасте 1 месяца (табл. 2).

Основным гистопатологическим признаком, лежащим в основе уменьшения размера и силы скелетных мышц у этих мутантов, является заметно меньшая площадь поперечного сечения миофибрилл в моделях мышей CS и CFC по сравнению с контрольной группой дикого типа (Maeda et al., 2021; Tidyman et al., 2021). У мышей CFC Braf^L597V и CS Hras^G12V площадь поперечного сечения миофибрилл gastrocnemius составляет 76 % и 60 %, соответственно, от аналогичного показателя у мышей дикого типа. Интересно, что как медленные, так и быстрые типы мышечных волокон имеют эквивалентное уменьшение размера миофибрилл в моделях CS и CFC. Одно из заметных различий между моделями мышей CS Hras^G12V и CFC Braf^L597V заключается в том, что в мышце extensor digitorum longus нижней конечности мыши CS Hras^G12V на 76 % меньше мышечных волокон по сравнению с контрольной группой дикого типа в возрасте 1 месяца, тогда как у мыши CFC Braf^L597V различий не наблюдалось (табл. 2). Кроме того, в скелетных мышцах мышей CS и CFC отсутствовали липидные отложения по сравнению с мышцами дикого типа, что заметно контрастировало с моделью мышей NF1, в которой накопление липидов было повышенным (табл. 2) (Kossler et al., 2011).

Аналогично модели мышей Nf1^Prx1-/-, как в модели мышей CS Hras^G12V, так и в модели мышей CFC Braf^L597V наблюдается подавление миогенеза во время эмбрионального развития. У мышей CS Hras^G12V и CFC Braf^L597V наблюдается значительное увеличение количества Pax7-экспрессирующих клеток в развивающихся мышцах задней конечности на 14-й день эмбрионального развития. Это указывает на увеличение количества пролиферирующих MPCs и миобластов по сравнению с мышами дикого типа. Более того, у мышей CS Hras^G12V и CFC Braf^L597V в эмбриональных мышцах задних конечностей значительно меньше клеток, экспрессирующих MyoD и Myog, по сравнению с мышами дикого типа (Maeda et al., 2021; Tidyman et al., 2021). Поскольку факторы транскрипции MyoD и myogenin являются маркерами мышечной дифференцировки, снижение их экспрессии указывает на то, что активация пути RAS/MAPK во время эмбрионального развития подавляет дифференцировку и нарушает миогенез (табл. 2). В подтверждение этого вывода первичные клетки миобластов, полученные от неонатальных мышей CS Hras^G12V и CFC Braf^L597V, демонстрируют заметное снижение уровня белка тяжелой цепи миозина, что свидетельствует о дифференцировке миобластов, и уменьшение образования миотрубок in vitro по сравнению с миобластами от мышей дикого типа (Maeda et al., 2021; Tidyman et al., 2021). Этот результат также показывает, что ингибирование дифференцировки присуще клеткам миобластов CS и CFC и не зависит от условий in vivo. Важно отметить, что добавление ингибитора MEK PD03225901 к культурам миобластов CS Hras^G12V и CFC Braf^L597V устраняет этот дефект дифференцировки миобластов, приводя к такому же времени и степени дифференцировки миобластов и образования миотрубок, как и в культурах миобластов дикого типа (Maeda et al., 2021; Tidyman et al., 2021). Этот вывод подтверждает роль активации RAS/MAPK-пути как ответственного за подавление миогенной дифференцировки, наблюдаемое в этих моделях RASопатий, и указывает на возможность терапевтического пути для коррекции этого пути. Для дальнейшего исследования того, может ли ингибирование передачи сигналов RAS/MAPK in vivo исправить RAS-ассоциированную скелетную миопатию, 3-месячным взрослым мышам CS Hras^G12V вводили PD03225901 перорально в течение 28 дней (Tidyman et al., 2021). Это лечение устранило тяжелые миопатические фенотипы, наблюдаемые у мышей CS Hras^G12V, включая снижение мышечной массы, мышечной силы и площади поперечного сечения мышечных волокон, настолько, что не было зарегистрировано статистических различий в этих фенотипах между мышами CS Hras^G12V, получавшими лечение, и контрольной группой дикого типа.

Как в модели мышей CS Hras^G12V, так и в модели мышей CFC Braf^L597V наблюдается активация пути RAS/MAPK, о чем свидетельствует повышение уровня pERK в скелетных мышцах (Maeda et al., 2021; Tidyman et al., 2021). Уровень активации пути RAS/MAPK, определенный с помощью вестерн-блоттинга (вставка 1), у мыши CS Hras^G12V на 22 % выше, чем у мыши CFC Braf^L597V (табл. 2). Кроме того, скелетные мышцы мыши CS Hras^G12V демонстрируют значительное повышение активности PI3K/AKT-пути, о чем свидетельствует увеличение уровня фосфорилированного AKT в 3,6 раза по сравнению с мышцами дикого типа, тогда как у мыши CFC Braf^L597V этого не происходит (Maeda et al., 2021; Tidyman et al., 2021). Это различие объясняется тем, что HRAS действует как сигнальный узел, активирующий путь RAS/MAPK через белки RAF, а также напрямую активирующий путь PI3K/AKT. В отличие от этого, BRAF находится ниже по течению от RAS и, как известно, не взаимодействует напрямую с PI3K/AKT-путем. Активация PI3K/AKT-пути связана с гипертрофией и ростом скелетных мышц за счет активации mTOR и стимуляции катаболизма белков (Glass, 2010). Непонятно, что обнаружение уменьшения мышечной массы и атрофических миофибрилл у мыши CS Hras^G12V прямо противоположно ожидаемому, учитывая повышенный уровень сигнализации PI3K/AKT-пути у этой мыши. Неясно, почему ожидаемый положительный эффект активированного PI3K/AKT-пути на рост мышц не наблюдается у мышей CS. Вместо этого негативный эффект на рост мышц, вызванный активацией RAS/MAPK-пути, кажется доминирующим и может перекрывать гипертрофический эффект активации PI3K/AKT-пути, хотя механизм, лежащий в основе этого эффекта, еще предстоит изучить.

В дополнение к активации RAS/MAPK-пути, как в модели мышей CS Hras^G12V, так и в модели мышей CFC Braf^L597V наблюдается снижение активности p38 MAPK-пути (табл. 2) (Maeda et al., 2021; Tidyman et al., 2021). В модели CS активность пути p38 MAPK в скелетных мышцах мутантов снижена в 2,7 раза, а в модели CFC - в 1,5 раза по сравнению с контрольной мышцей дикого типа. Предполагается, что между путями RAS/MAPK и p38 MAPK существует перекрестное взаимодействие (Aksamitiene et al., 2012). Исследования in vitro в миогенных клеточных линиях крыс показали обратную корреляцию между активностью RAS/MAPK и p38 MAPK, что свидетельствует о взаимном ингибирующем перекрестном взаимодействии. Однако точный механизм этого взаимодействия остается неизвестным (Khurana and Dey, 2002). Путь p38 MAPK также является важным регулятором развития скелетных мышц. Активность этого пути необходима для экспрессии специфических для мышц генов на протяжении всего развития, а также во взрослой скелетной мышце (Keren et al., 2006; Lluis et al., 2006). Путь p38 MAPK также играет важную роль в регуляции транскрипционной активности двух основных мышечных факторов транскрипции, MyoD и MEF2, которые необходимы для экспрессии специфических для мышц генов (Bentzinger et al., 2012; Black and Olson, 1998; Molkentin et al., 1996). Было показано, что активность пути p38 MAPK необходима для полной транскрипционной активности MyoD (Lluis et al., 2005). MyoD димеризуется со своим ко-факторным белком E47 (кодируемым TCF3) для связывания с промоторной областью генов, специфичных для мышц (Tapscott, 2005). Фосфорилирование E47 на пути p38 MAPK способствует образованию этого димера и облегчает транскрипционную активность комплекса MyoD/E47 (Lluis et al., 2005, 2006). Второй основной класс мышечных транскрипционных факторов, MEF2, также фосфорилируется на пути p38 MAPK, что приводит к усилению его транскрипционной активности (Wu et al., 2000; Zhao et al., 1999). Важно отметить, что в скелетных мышцах 1-месячных мышей CS HrasG12V наблюдается 2,2-кратное снижение уровня фосфорилированного MEF2C по сравнению с мышцами мышей дикого типа (Tidyman et al., 2021). Кроме того, недавно было выдвинуто предположение, что MEF2 играет центральную роль в регуляции мышечной гипертрофии. Связывание MEF2 со специфическими для мышц генами приводит к увеличению размера миофибрилл. Предполагается, что взаимодействие MEF2 с ингибирующим мышечным регуляторным фактором MRF4 блокирует связывание MEF2 с его целевыми промоторами, вызывая тем самым атрофию мышц (Moretti et al., 2016; Schiaffino et al., 2018). Неизвестно, играет ли фосфорилирование MEF2 какую-то роль в этом взаимодействии. Однако, учитывая, что большинство специфических для мышц генов зависят от транскрипционных факторов MyoD и MEF2, снижение их активности, вызванное ингибированием p38 MAPK-пути RAS/MAPK, должно негативно сказаться на росте мышц (Zetser et al., 1999; Zhao et al., 1999).

RASopathies предоставляют уникальную возможность изучить и прояснить роль RAS/MAPK-сигнализации в развитии и росте скелетных мышц млекопитающих, а также в гомеостазе мышц взрослого человека. Изучая мышиные модели RASопатий NF1, CS и CFC, исследователи внесли вклад в выявление центральной роли RAS/MAPK-сигнализации в регуляции миогенеза, дисрегуляция которой приводит к новому типу скелетной миопатии, характеризующейся атрофией и гипоплазией миофибрилл, в случае мышиных моделей NF1 и CS. Размер миофибрилл - это высоко регулируемый процесс, который позволяет привести размер и силу мышц в соответствие с функциональными потребностями. Этот процесс является основополагающим для мышечной пластичности и гомеостаза. Модели мышиных RASопатий также показали, что взаимодействие между путями RAS/MAPK, PI3K/AKT и p38 MAPK регулирует развитие скелетных мышц и размер миофибрилл. Кроме того, как было обнаружено в моделях мышей CS Hras^G12V и CFC Braf^L597V, уровни активации RAS/MAPK-пути и тяжесть скелетной миопатии также коррелируют друг с другом.

Существует множество ключевых нерешенных вопросов, касающихся развития скелетных мышц и RASопатий. Изменяется ли при RASopathies популяция взрослых MPCs, известных как сателлитные клетки, учитывая, что пути RAS/MAPK и p38 MAPK, как было показано, являются важными медиаторами их функции и активации (Pawlikowski et al., 2017; Segales et al., 2016)? Также важно определить, существует ли механистическая связь между активированным RAS-путем, наблюдаемым в скелетных мышцах при RASопатиях, и склонностью RASопатий к раку мышц, известному как эмбриональная рабдомиосаркома. Эмбриональная рабдомиосаркома (ERMS), также известная как PAX fusion-negative rhabdomyosarcoma, - это саркома мягких тканей, которая, как считается, возникает из клеток предшественников скелетных мышц (Kashi et al., 2015). У многих людей с RASопатиями, включая NF1 (Evans et al., 2017), CS (Gripp, 2005) и NS (Kratz et al., 2011), ERMS может развиться в детстве. Недавние исследования показали, что рабдомиосаркома с активированным RAS-путем при воздействии ингибитора MEK индуцировала экспрессию транскрипционного фактора миогенина и дифференцировку скелетных мышц (Yohe et al., 2018). Эта интересная находка открывает возможность не только для лечения ERMS, связанных с RAS-путем, у людей с RASопатологией, но и для установления связи между онкогенезом эмбриональной рабдомиосаркомы и скелетной миопатией.

Наконец, мышиные модели RASопатий также позволили понять возможные будущие пути лечения скелетной миопатии, характерной для некоторых RASопатий. Например, было показано, что лечение мышей NF1 Nf1^Prx1-/- ингибитором MEK in utero корректирует аберрантный липидный обмен, связанный с NF1 (Summers et al., 2018b). Кроме того, лечение взрослых мышей CS Hras^G12V ингибитором MEK может полностью устранить некоторые из их первичных фенотипических аномалий, включая атрофические мышечные волокна, размер мышц и мышечную силу (Tidyman et al., 2021). Такое доклиническое моделирование дает дополнительные доказательства того, что ингибиторы MEK могут стать надежным способом лечения RASопатий и что клинические испытания являются оправданными.