Cryoelectron microscopy (cryo-EM) has provided unprecedented insights into amyloid fibril structures, including those associated with disease. However, these structures represent the endpoints of long assembly processes, and their relationship to fibrils formed early in assembly is unknown. Consequently, whether different fibril architectures, with potentially different pathological properties, form during assembly remains unknown. Here, we used cryo-EM to determine structures of amyloid fibrils at different times during in vitro fibrillation of a disease-related variant of human islet amyloid polypeptide (IAPP-S20G). Strikingly, the fibrils formed in the lag, growth, and plateau phases have different structures, with new forms appearing and others disappearing as fibrillation proceeds. A time course with wild-type hIAPP also shows fibrils changing with time, suggesting that this is a general property of IAPP amyloid assembly. The observation of transiently populated fibril structures has implications for understanding amyloid assembly mechanisms with potential new insights into amyloid progression in disease.

Рост фибрилл IAPP-S20G in vitro проходил в спокойном режиме в стеклянных флаконах, что позволяло извлекать образцы для анализа в разные моменты времени. Aliquots (кратные числа) отбирали в разное время после начала сборки и измеряли флуоресценцию ThT из одного флакона, чтобы проследить за ходом сборки (рис. 2А, красная кривая). В использованных условиях (STAR Methods) t1/2 сборки амилоидных фибрилл составляет ~8 недель, с выраженными фазами задержки (0-4 недели), роста (4-12 недель) и плато (12-24 недели). Масс-спектрометрия показала отсутствие деградации пептида в течение этого периода времени (рис. S1). В каждой временной точке также определяли выход фибрилл путем гранулирования агрегированного материала и количественного определения концентрации IAPP-S20G в супернатанте с помощью аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC) (STAR Methods) (рис. 2А, синяя кривая). Интересно, что это свидетельствует о том, что ранние виды фибрилл не так эффективно мечены ThT, как те, что находятся на более поздних стадиях процесса сборки, при этом другие типы агрегатов не видны на негативных пятнах (Рисунок S2A).

nsEM-изображения нескольких реакций показали, что олигомеры или аморфные агрегаты не наблюдаются ни в одной временной точке во время агрегации (в данных условиях), а первые фибриллы видны между 2 и 3 неделями (обратите внимание, что олигомеры hIAPP бтолее ~50 кДа с упорядоченной структурой должны быть видны с помощью nsEM, используя микроскоп Tecnai F20 и детектор Ceta) (рис. S2A). Большинство этих ранних видов фибрилл были не скрученными (рис. 2B, 2C и S2). Внешний вид фибрилл начинает меняться примерно через 4 недели, после чего большинство наблюдаемых фибрилл имеют отчетливые, измеримые пересечения длиной ~33-50 нм (рис. 2C и S3). В нашем предыдущем исследовании48 именно в этот момент были обнаружены два полиморфа фибрилл IAPP-S20G (рис. 1A и 1B). В образцах, измеренных между 9 и 22 неделями, наблюдается бимодальное распределение типов фибрилл, с пиковыми расстояниями пересечения около 36-38 и 48-50 нм, одновременно с относительным истощением фибрилл с пересечениями между этими двумя длинами (рис. 2C и S3). Эти результаты были получены в ходе нескольких реакций (с биологическими повторами для разных временных точек, см. STAR Methods), что гарантирует воспроизводимость наблюдаемых изменений в морфологии и их корреляцию с ходом реакции. Во всех четырех реакциях, проведенных на 2-3 неделе, не менее 40 % (в среднем 55 % ± 15 %) наблюдаемых фибрилл были не скрученными, и в каждой реакции этот показатель снижался до менее 7 % (в среднем 5,2 % ± 1,6 %) во всех последующих временных точках (рис. S2 и S3).

Основываясь на этих данных, мы выбрали три отдельные временные точки для изучения структур фибрилл с высоким разрешением с помощью cryo-EM: 3 недели, представляющие позднюю лаг-фазу, 6 недель, представляющие фазу роста, и 22 недели, представляющие фазу плато (рис. 3A). Было собрано более 2 000 cryo-EM-видеороликов в разных областях сетки, чтобы получить максимальную выборку видов фибрилл, присутствующих в каждой временной точке. 2D-классификация сегментов фибрилл на основе cryo-EM изображений показала, что ~30% фибрилл в 3-недельном наборе данных демонстрируют ~21-нм кроссоверное расстояние, которое не является основным компонентом в 6- или 22-недельных наборах данных (рис. 3B и 3C), что согласуется с анализом изображений nsEM (рис. 2C). Оставшиеся сегменты фибрилл в 3-недельной временной точке (~70%) были не скрученными (обозначены серым цветом на рисунке 3) или не имели четких пересечений (обозначены белым цветом на рисунке 3). Очевидные морфологии фибрилл также отличались между 6- и 22-недельными популяциями фибрилл (рис. 3B и 3C). Набор данных за 6 недель был более полиморфным, с пересечениями на разных расстояниях (36, 40, 44 и 48 нм), в то время как только два из них наблюдались в наиболее населенных средних 2D-классах, полученных в 22 недели.

Одна растворимая форма фибрилл, представляющая примерно одну треть всех фибриллярных IAPP-S20G, полученных с помощью изображений, присутствовала в течение 3 недель (рис. 4A, см. также рис. S5A-S5I). Эти фибриллы дали cryo-EM карту с разрешением 3,0 Е (рис. 4B, 4C, S5F и S5G), содержащую ядро фибриллы 2PF с поперечным расстоянием 21 нм (рис. 3C), на котором можно построить атомную модель для остатков 12-37 каждой субъединицы (рис. 4D). Ядро организовано в виде двух тесно упакованных, симметричных цепей, каждая из которых имеет P-образную складку, которую мы назвали 2PFP. Интересно, что этот полиморф отличается от ранее опубликованной структуры IAPP-S20G 2PF (PDB: 6zrq)⁴⁸ (рис. 1B), которая имеет С-образную форму ядра, и в дальнейшем мы будем называть ее 2PFC. Она также отличается от S-образной структуры 2PF фибрилл WT IAPP (2PFS)^30,48,50 (рис. 1А). Несмотря на эти различия, 3-недельные фибриллы IAPP-S20G и WT IAPP имеют некоторые общие черты: они имеют сходную длину пересечения (21 против 25 нм), консервативный межсубъединичный интерфейс, включающий основную склонную к агрегации область IAPP (остатки 23-27), и сходную конформацию основы по остаткам 15-28 (рис. 4D). Однако в субъединичных складках IAPP-S20G 2PFP и IAPP-WT концы полипептидов упакованы по-разному, в основном в С-концевой области (остатки 28-37), которая удлинена в IAPP-S20G, но складывается обратно, образуя складку WT 2PFS.



Figure 4 Cryo-EM structure determination reveals that multiple IAPP-20G fibril polymorphs differentially populate the different phases of assembly

Pie chart of the fibril polymorph assignments from all the segments processed within the (A) 3-week, (E) 6-week, and (H) 22-week cryo-EM datasets of IAPP-S20G. The coloring matches the fibril polymorphs displayed throughout the figure and Figure 3, with gray representing unidentifiable fibril structures. Slice view of a layer of the final IAPP-S20G (B) 3-week, (F) 6-week, and (I) 22-week maps for each fibril polymorph, which were generated by averaging the central six slices, corresponding to an ~5 Е section of each map. Perpendicular views of the core and fibril surface of each of the deposited maps from the (C) 3-week, (G) 6-week, and (K) 22-week cryo-EM datasets.

(D) Superposition of a single layer of the 3-week IAPP-S20G 2PFP (PDB: 8awt, dark green) and the WT IAPP 2PFS (PDB: 6zrf,48 light green) structures showing that they share a conserved inter-protofilament interface (involving residues 23FGAIL,27 shown as sticks) and subunit core fold between residues 15–28 (highlighted blue/red). The location of the mutation S20G is highlighted on the 2PFP model.

(J) Zoomed section of the 22-week IAPP-S20G 2PFL map transparent to show modeling of an ordered water channel (red spheres) at the inter-protofilament interface. The colors used to denote each fibril type are consistent throughout all figures. See cryo-EM processing details in Figure S5 (3-week dataset), Figure S6 (6-week dataset), and Figure S9 (22-week dataset), respectively.

Оствшиеся 68% фибрилл в 3-недельной временной точке не имели отчетливых скручиваний и их структура (структуры) не могла быть разрешена путем спиральной реконструкции. Попытки 3D-классификации этих сегментов фибрилл с использованием в качестве шаблонов структуры IAPP-S20G 2PFP, цилиндров без особенностей или множества структур фибрилл IAPP-S20G, полученных в более поздние временные точки (см. ниже), не увенчались успехом (рис. S5H и S5I). Особенности 3-недельной популяции фибрилл были воспроизведены в cryo-EM данных второй реакции с IAPP-S20G (рис. S4A-S4D). Большинство фибрилл снова мало или совсем не скручены. Хотя в этом наборе данных было недостаточно частиц для того, чтобы разрешить структуру с высоким разрешением, аналогичные усредненные 2D-классы и 3D-карты классификации с более низким разрешением (рис. S4B и S4C) позволяют предположить, что 2PFP также присутствовал в качестве ранней структуры фибрилл в этой второй реакции. Эта конкретная реакция агрегации IAPP-S20G также была взята для cryo-EM в 22-недельной временной точке, описанной далее, что подтверждает значительное изменение структур фибрилл в процессе сборки при сравнении средних значений 2D классов в 3 и 22 недели из одного и того же раствора (рис. S4B).

Фибриллы, присутствующие через 6 недель, которые представляют собой фазу роста фибрилл (рис. 2A), разительно отличаются от тех, что наблюдались в 3-недельной временной точке (рис. 3). Почти все (82 %) фибриллы имеют явные перекресты и могут быть отнесены к определенному полиморфу, причем расстояние между перекрестами варьирует в пределах 36-50 нм. Более удивительно, что в отличие от единственной структуры, растворимой с высоким разрешением в течение 3 недель, в этот период времени можно было идентифицировать шесть различных полиморфов фибрилл (рис. 4E, 4F и S6). Единственная упорядоченная форма фибрилл в 3-недельном наборе данных, 2PFP, почти полностью исчезла, и лишь 1 % сегментов фибрилл в 6 недель имели расстояние пересечения ~20 нм, соответствующее 2PFP, и их было недостаточно для создания структуры 2PFP с высоким разрешением (рис. S6A и S6B). Однако четыре структуры фибрилл удалось установить с высоким разрешением (3,1-3,4 Е) (рис. 4G и S6C-S6H). Они показали наличие двух различных структурных семейств фибрилл: с L-образной складкой субъединицы (2PFL [30 %]) и с С-образной складкой, наблюдавшейся ранее.⁴⁸ Эти С-образные фибриллы включали одну с двумя протофиламентами (2PFC [30 %]), одну с тремя протофиламентами (3PFCU [10 %]) и одну с четырьмя протофиламентами (4PCCU [7 %]). Шестой полиморф, идентифицированный как вторая структура с четырьмя протофиламентами, был слишком редким (~4%) для определения структуры высокого разрешения в этом наборе данных (рис. S6F), но позже был обнаружен в 22-недельном наборе данных (4PFLU; см. ниже).

Два из полиморфов, наблюдаемых в течение 6 недель, идентичны тем, которые были обнаружены в нашем предыдущем исследовании⁴⁸ , а именно 2PFC и 3PFCU, и имеют общее консервативное ядро 2PF с С-образными складками субъединицы (рис. 4G, 5A, 5B и 1B). Полученные здесь карты с более высоким разрешением показали более высокую плотность пептидной основы, чем это было возможно на предыдущих картах с разрешением ~4 Е48 (рис. S7 против S8), и, соответственно, можно было построить атомные модели более высокого качества. Недавно обнаруженный полиморф 4PFCU имеет общие субъединицы с 2PFC и 3PFCU, но обладает четвертым, U-образным протофиламентом, который складывается как симметрично эквивалентный субъединице третьего протофиламента 3PFCU (рис. 4G и 5A). Эти три формы составляют C-линию полиморфов IAPP-S20G (рис. 5A), и в образце, находящемся в фазе роста, полиморф 2PFC в три раза более распространен, чем 3PFCU, который, в свою очередь, в 1,5 раза более распространен, чем 4PFCU (рис. 4F). Зная эту структуру 4PF, повторный анализ ранее опубликованного нами набора данных⁴⁸ выявил наличие небольшой популяции 4PFCU, которую ранее не удавалось определить (рис. S8). Это дает независимое подтверждение надежности и воспроизводимости процесса сборки IAPP-S20G.

Figure 5 Different IAPP-S20G fibril structures and subunit folds observed during the fibrillation time course

(A) Cartoon view of the seven unique IAPP-S20G fibril structures solved to high resolution. Peptide backbones are color coded in relation to the five different subunit folds present in the fibril assemblies (P, green; L, yellow; C, red; U, blue; and J, pink). The structures are grouped based on the fold of the 2PF core of the fibrils (P-lineage, green; L-lineage, yellow; and C-lineage, red).

(B) Ribbon view of the five distinct IAPP-S20G subunit folds, colored as in (A). The N- and C-terminal residues ordered in each structure are numbered.

(C) Superposition of the five different subunit folds, aligned on the structurally conserved sequence 20GNNFG24 for which the side chains are displayed as sticks.

(D) Superposition of 2PFL (yellow) and 2PFP (green), aligned on one of the peptide chains from each structure. The second chain of each fibril interacts on opposite sides of the superposed chain, highlight that the fibril architectures are very different.

(E) Superposition of one layer of each of the three L-lineage fibril structures, colored by structure (2PFL, yellow; 4PFLU, orange; and 4PFLJ, pink). The three structures share a conserved 2PF core (RMSD Ca atoms is 0.38 Е [54 atoms], 2PFL vs. 4PFLU and 0.44 Е [56 atoms], 2PFL vs. 4PFLJ).

(F) Superposition of one layer of each of the three C-lineage fibril structures, colored by structure (2PFC, red; 3PFCU, blue; and 4PFCU, purple). The three structures share a conserved 2PF core (RMSD Ca atoms is 0.39 Е [44 atoms], 2PFC vs. 3PFCU and 0.48 Е [40 atoms], 2PFC vs. 4PFCU). See also Figure S7 to see the fit of each displayed model into its respective cryo-EM map and Figure S10 for further images of the L-lineage 2PFL, 4PFLU, and 4PFLJ fibril assemblies. Both PyMol (Schrцdinger) and ChimeraX53 were used for making structure figures.

Оставшиеся два новых полиморфа IAPP-S20G в возрасте 6 недель представляют собой отдельное семейство структур, которое мы назвали линией L (рис. 5A). К ним относятся 2PFL (заселено 30 %) и незначительный (заселено 4 %) родственный вид 4PFLU (рис. 4F). L-образная складка, лежащая в основе ядра 2PFL в этих двух полиморфах, имеет другую конформацию, чем С- и U-образные субъединицы в структурах 2PFC, 3PFCU и 4PFCU (рис. 5A-5C). L-образная форма субъединицы наиболее похожа на P-образные фибриллы 2PFP, наблюдаемые в лаг-фазе, с небольшими различиями в загибании двух концов (рис. 5C). Однако фибриллы 2PFP и 2PFL структурно отличаются. Второй протофиламент укладывается с другой стороны от общей сердцевинной субъединицы L/P в каждой фибрилле, создавая совершенно разные межсубъединичные интерфейсы (рис. 5D).

При первом рассмотрении cryo-EM изображений 22-недельного образца фибриллы выглядели так же, как и в 6 недель, почти все фибриллы имели поперечник ~36 или ~48 нм (Рисунок 3A). Однако 2D-классификация показала, что образец 22 недель менее полиморфен, чем образец 6 недель (рис. 3B и 3C). Действительно, только три из шести полиморфов, наблюдавшихся в 6-недельном наборе данных, преобладали в 22-недельном наборе данных: 2PF^L (43%), 4PF^LU (19%) и 4PF^CU (15%), в то время как фибриллы 2PF^P, 2PF^C или 3PF^CU не были обнаружены (рис. 4H, 4I и S9). В этих наборах данных использовался детектор с энергетической фильтрацией, и разрешение cryo-EM карт было значительно улучшено до 2,2 ангстрем (A) для 2PF^L и 2,3 A для 4PF^CU (рис. 4J, 4K и S9), что позволило провести точное моделирование пептидов и непосредственно визуализировать направленность фибрилл (рис. S7). Упорядоченные молекулы воды (рис. 4J и S9D) помогают преодолеть полярный межпротофиламентный интерфейс 2PFL, что является лишь вторым подобным наблюдением упорядоченного канала растворителя внутри сердцевины фибрилл⁵⁴.

Наиболее поразительно то, что в 22-недельной временной точке доля фибрилл 2PF^L увеличивается (с 30 до 43 %), сопровождаясь увеличением количества фибрилл 4PF^LU (с 4 до 19 %), так что эти родственные формы фибрилл преобладают (в общей сложности 62 %) среди наблюдаемых фибрилл (рис. 4H и 4I). Увеличение доли сегментов фибрилл 4PF^LU позволило решить структуру этой формы фибрилл с разрешением 3,1 А (рис. 4K и S9K). В этой новой структуре ядро 2PF^L украшено двумя внешними цепями с упорядоченными остатками 21-37, конформация которых напоминает U-субъединицу, наблюдаемую в полиморфах 3PF^CU и 4PF^CU (рис. 5A). Карты низкого разрешения подтверждают присутствие всей U-складчатости, начиная с остатка 11, во внешних цепях этой фибриллярной структуры (рис. S10A и S10B). Примечательно, что дальнейшие структурные вариации существуют и в сегментах 4PF^L, причем незначительное подмножество (4PF^LJ) содержит альтернативную пептидную конформацию для двух цепей, фланкирующих одно и то же консервативное ядро 2PF^L (рис. 5A, S9H и S10). Фланкирующая J-образная субъединичная складка охватывает остатки 13-37 и отличается от всех других субъединичных складок IAPP-S20G, описанных до сих пор (рис. 5B и 5C). Эта четвертая, 22-недельная структура фибриллы IAPP-S20G составляет всего 2 % от общего числа сегментов фибриллы, карта которой определена с разрешением 2,9 А (рис. 4I, 4K и S9I).

В общей сложности семь уникальных структур фибрилл наблюдались во всех временных точках (рис. 5A), состоящих из различных комбинаций пяти уникальных субъединичных складок (рис. 5B). Эти структуры можно разделить на различные линии, основанные на трех различных ядрах 2PF. 2PF^P не образует агрегатов более высокого порядка, но 2PF^C входит в состав структур 3PF и 4PF, в то время как 2PF^L также входит в состав двух различных агрегатов 4PF (рис. 5A). Эти ядра 2PF накладываются на соответствующие ядра в более крупных агрегатных состояниях, причем значения Ca RMSD во всех случаях составляют менее 0,5 А (рис. 5E и 5F). Подгонка моделей к уточненным cryo-EM картам в сочетании с этими суперпозициями ядер убедительно свидетельствует о том, что все описанные структуры S20G представляют собой левосторонние фибриллы (рис. S7B и S7C, см. STAR Methods). Распределение полиморфов фибрилл резко менялось в процессе сборки (рис. 6А). Наряду с неразрешенными фибриллами сначала появились 2PF^P, но в фазе роста сохранилось мало фибрилл этого типа, а в фазе плато не наблюдалось ни одной. Напротив, 2PF^C и 3PF^CU наблюдаются в фазе роста, но исчезают в фазе плато. Напротив, полиморфы фибрилл 2PF^L, 4PF^CU и 4PF^LU стали более доминирующими в фазе плато. Баланс субъединичных складок, лежащих в основе различных структур фибрилл, также изменяется по мере сборки: P-складка обнаруживается в самых ранних фибриллах в лаг-фазе, за ним следуют L- и C-субъединичные типы в 6-недельном образце, а L- и U-субъединичные складки доминируют в 22-недельной временной точке (рис. 6B). По мере сборки накапливаются более крупные фибриллы, как с точки зрения средней длины повторяющихся пересечений фибрилл (Рисунок 6C), так и среднего количества субъединиц на слой фибрилл, т.е. количества протофиламентов в каждой форме фибрилл (Рисунок 6D). Например, 36 % набора данных показывают фибриллярные структуры 4PF в образце 22-недельного плато по сравнению с 11 % и 0 % в образцах 6-недельного роста и 3-недельной лаг-фазы, соответственно.

Чтобы изучить, как стабильность структур связана с процессом сборки, термодинамическую стабильность каждой субъединичной складки и каждой фибриллярной структуры рассчитывали с помощью двух независимых методов расчета свободной энергии (STAR Methods). ^12,55,56 Результаты показали, что каждая субъединичная складка в пределах каждого полиморфа имеет схожую свободную энергию на остаток около -0,8 ккал/моль (рис. 6E и S11), подчеркивая, что массив структур с похожей стабильностью возможен, когда неупорядоченный по своей сути пептид, такой как IAPP, собирается в поперечную β-амилоидную складку. Однако важно отметить, что поскольку по мере сборки происходит сдвиг в сторону фибрилл с большей массой на единицу длины (рис. 6D и 6F), более крупные формы 4PF имеют большую общую расчетную стабильность на слой фибриллы по сравнению с формами 3PF и 2PF (рис. 6E и S11). Таким образом, для этой реакции сборки амилоида на полиморфизм влияют как кинетические, так и термодинамические факторы, поскольку система движется к равновесию, создавая более крупные фибриллы из субъединиц, которые структурно сохранены и индивидуально изоэнергетичны.

Чтобы выяснить, изменяется ли структура фибрилл в ходе реакций сборки другой последовательности IAPP, мы организовали временной курс сборки WT hIAPP в аналогичных буферных условиях, но в 96-луночном планшете с непрерывным измерением флуоресценции соседних ThT-репортерных лунок (рис. S12A). Образцы (из реакций без ThT) были взяты в разные временные точки в двух экземплярах и проанализированы с помощью cryo-EM (STAR Methods). Снова наблюдался сдвиг в архитектуре фибрилл: от смеси фибрилл с неразрешимой структурой (структурами) в ранние сроки до более однородной популяции с преобладанием одной определенной архитектуры фибрилл в фазе плато сборки (рис. S12B-S12D). Наблюдались фибриллы с поперечником 25 нм, аналогичные ранее установленной форме 2PFS фибрилл WT hIAPP,^30,48,50 но конечный раствор этой фибриллы имеет конформацию позвоночника, сходную с той, что наблюдается в полиморфе, полученном путем высева hIAPP с семенами ex vivo из поджелудочной железы донора с диабетом II типа (полиморф TW230). Полученные результаты подчеркивают важность условий раствора и типа сосуда для определения формирующихся структур фибрилл (пластина против Эппендорфа или стеклянных флаконов, как это было в предыдущих исследованиях^30,48,50). Примечательно, что новый полиморф фибрилл WT hIAPP, идентифицированный здесь в устойчивом состоянии, присутствовал и в более ранней временной точке анализа, но его доля резко увеличивалась по мере развития реакции (от 14 % ± 3 % до 45 % ± 3 %). Таким образом, эти результаты еще раз показывают, что степень и характер полиморфизма фибрилл IAPP изменяются с течением времени, и позволяют предположить, что такие изменения являются консервативной особенностью формирования амилоида IAPP и, возможно, других белков.

cryo-EM структуры амилоида высокого разрешения на сегодняшний день, как правило, сосредоточены на морфологии фибрилл в один момент времени. В условиях in vitro это, как правило, время, когда фибриллы выросли и демонстрируют повторяющееся скручивание, что позволяет раскрыть их структуру (структуры) с помощью спиральной обработки.⁵⁷ Для исследований амилоида ex vivo конечная точка болезни обычно определяется доступностью донорской ткани. Здесь мы опираемся на результаты нашей предыдущей работы по изучению формирования амилоида IAPP-S20G48 и используем cryo-EM для описания различных структур фибрилл в гетерогенном, динамическом ансамбле полиморфов на разных стадиях реакции сборки амилоида. Полученные результаты поразительны, поскольку, хотя ранее для Aβ и α-синуклеина было показано, что структурные свойства фибрилл могут меняться со временем^39,40-42, мы раскрываем детали того, как 3D-структуры фибрилл hIAPP постепенно эволюционируют в процессе формирования амилоида.

На начальной стадии, когда начинается сборка фибрилл IAPP-S20G, наблюдается только один полиморф с регулярным закручиванием спирали, а именно 2PF^P. Эта из двух протофиламент структура фибрилл имеет некоторые общие черты с фибриллами 2PF^S, наблюдавшимися ранее для WT hIAPP^48,50, но структурно отличается от них (рис. 4D). Хотя структуры фибрилл WT и S20G IAPP еще не раскрыты ex vivo, четыре структуры были обнаружены при посеве мономерного WT hIAPP in vitro с материалом, выделенным из островков Лангерганса донора с T2D.³⁰ Интересно, что субъединичная структура 2PF^P напоминает субъединицы в посеянном ex vivo амилоиде WT hIAPP с полиморфами TW1 и TW3, описанными Cao et al.³⁰ (рис. S13). Высеянный ex vivo WT hIAPP (TW4) также содержит элементы структуры, напоминающие таковые в L-, U- и C-складках фибрилл IAPP-S20G, описанных здесь (рис. S13). Важно отметить, что 2PF^P - не единственная фибрилла, образовавшаяся в период задержки, поскольку большинство (68 %) фибрилл не имели регулярного спирального скручивания, и их структуры не могли быть раскрыты. Тем не менее, тот факт, что эти фибриллы не имеют очевидного скручивания, свидетельствует о том, что они структурно отличаются от всех скрученных полиморфов, которые были определены в данной работе. Примечательно, что такие фибриллы появляются, когда флуоресценция ThT низка по отношению к количеству гранулируемого материала, что позволяет предположить, что эти формы фибрилл могут не связывать ThT или связываться таким образом, что ThT флуоресцирует относительно слабо, что соответствует тому, что эти сборки имеют другую структуру, чем те, которые были определены в более поздние моменты времени. Ранее сообщалось о различной интенсивности флуоресценции ThT для разных морфологий фибрилл.^58-61

Мы не можем сделать вывод о том, как эти ранние структуры эволюционируют по мере сборки, т.е. как формируются более поздние виды фибрилл. Тем не менее, полученные результаты наглядно демонстрируют, что структура фибрилл меняется со временем.



Рисунок S13 Обзор обнаруженных складок субъединицы IAPP-S20G и их связь с другими опубликованными структурами фибрилл IAPP, связанными с рисунком 5.

(A) Cartoon view of each of the five unique IAPP-S20G subunit folds found within the fibril structures solved in this work.
(B) Previously published IAPP fibril structures30,48,50 with regions matching to the folds in (A) colored accordingly.

Новые полиморфы, появляющиеся в фазе роста, относятся к двум различным двухпротофиламентным формам, 2PF^C и 2PF^L, с различными структурами субъединиц и межмолекулярными взаимодействиями. Однако они обладают общей способностью присоединять новые субъединицы для формирования дополнительных протофиламентов, что приводит к образованию фибрилл более высокого порядка (рис. 6F). Этот принцип был предложен в нашей предыдущей работе, в которой впервые были обнаружены структуры 2PF и 3PF фибрилл S20G-IAPP⁴⁸ , но в том исследовании не было временного (и пространственного) разрешения, характерного для настоящего исследования. Здесь мы описываем структуры, которые показывают, что аккреция субъединиц является общим свойством сборки фибрилл IAPP-S20G in vitro. Эти структуры подчеркивают удивительную пластичность последовательности IAPP-S20G, в которой одни и те же минимальные 25 остатков (аминокислоты 13-37) могут принимать по меньшей мере пять различных конформаций субъединицы. Наращивание различных субъединиц приводит к формированию более крупных фибрилл за счет различной упаковки этих пяти субъединичных складок.

В фазе плато накопление субъединиц представляется медленной, но стабилизирующей силой, которая со временем смещает сборку амилоида в сторону более толстых фибрилл (т.е. фибрилл с большим количеством протофиламентов). Это сопровождается едва заметным удлинением расстояния между фибриллами, предположительно из-за того, что небольшое разворачивание структуры фибрилл легче вмещает дополнительную массу на единицу длины более толстых фибрилл.^25,62 Наиболее наглядно это демонстрирует полное исчезновение фибрилл 2PF^C и 3PF^CU в 22-недельном образце, которые составляли ~40% от общего набора данных в 6 недель, а 4PF^CU была единственной фибриллой C-линейки, оставшейся к 22 неделям. В фибриллах линии L наблюдается аналогичная тенденция: в фазе плато обнаружены две отдельные формы 4PF^L (4PF^LU и 4PF^LJ). Однако, в отличие от С-образных фибрилл, 2PF^L остается высоко населенной на этом позднем этапе сборки как единственная оставшаяся форма 2PF.

Термодинамические свойства полипептидной складки являются значительной движущей силой в формировании амилоидных фибрилл.^12,63,64 Однако общепризнано, что полиморфизм фибрилл находится под кинетическим, а не термодинамическим контролем, и соотношение продуктов определяется скоростью их образования, а не обязательно их термодинамической стабильностью.³⁷ Расчеты свободной энергии^12,55 показывают, что все структуры фибрилл, выявленные здесь, имеют сходные показатели энергии на остаток. Следовательно, хотя термодинамическая стабильность диктует, какие структуры возможны, т.е. создает лунки в энергетическом ландшафте для агрегации, относительная популяция каждого полиморфа диктуется не этой стабильностью, а скоростью образования конкретного полиморфа фибрилл. Почему же тогда полиморфизм меняется со временем в процессе роста амилоида (рис. 7A)? Скорость формирования фибрилл зависит от множества процессов, включая первичную нуклеацию, вторичную нуклеацию, фрагментацию и удлинение, каждый из которых по-своему зависит от концентрации мономера. Поэтому вклад каждого процесса в рост фибрилл будет меняться в процессе сборки по мере изменения популяций мономеров и фибрилл. На стадии задержки высокая концентрация мономеров и низкая концентрация фибрилл способствуют первичной нуклеации, в то время как на стадии роста преобладает вторичная нуклеация (при этом элонгация играет важную роль на протяжении всей сборки). Исходя из этого, мы предполагаем, что первая наблюдаемая форма фибрилл, 2PF^P, кинетически наиболее доступна, когда доминирует первичная нуклеация. После этого формирование фибрилл происходит преимущественно за счет вторичных процессов, которые для IAPP-S20G могут происходить в 108 раз быстрее, чем первичная нуклеация.⁵² Таким образом, мы предполагаем, что в фазе роста 2PF^P, который является единственным видом 2PF IAPP-S20G в данном исследовании, не образующим агрегаты более высокого порядка 3PF/4PF, становится перегруженным и может катализировать образование новых полиморфов за счет вторичной нуклеации (рис. 7B). Наблюдение за тем, что рассчитанное среднее значение ΔG^o на молекулу увеличивается по мере образования агрегатов 3PF и 4PF (рис. 6E и S11), это позволяет предположить, что стремление к повышению термодинамической стабильности может способствовать образованию этих более крупных агрегатов, когда реакция достигает устойчивого состояния. Вопрос о том, происходят ли дальнейшие изменения в структурном полиморфизме при еще более длительном времени, остается открытым, но если такие изменения происходят, то они, скорее всего, будут происходить на более длительных временных интервалах, которые здесь недоступны. Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что каждая стадия сборки IAPP-S20G отражает различные кинетические ландшафты, которые приводят к тому, что в разное время предпочтение отдается разным полиморфам (рис. 7C).



Figure 7 Cartoon summary of IAPP-S20G polymorph progression with a proposed mechanism of different kinetic landscapes during the different stages of assembly

(A) Cartoon ThT plot of the IAPP-S20G time course in the style of Figures 1C and 1D with windows representing the different ratios of species observed at each stage of assembly. Black squiggles represent unstructured monomer, gray tubes represent untwisted fibrils, and the resolved fibril polymorphs are represented by their respective core structures, colored by subunit fold as in Figure 6.
(B) Potential assembly pathway schematic based on the fibril architectures and order of appearance. Each step is presumed to be reversible, and all plausible transitions have been included. It should be noted that other intermediates may exist that have not been captured, the untwisted fibrils may contain a mixture of states, and that monomer could directly contribute to all of the fibril assemblies.
(C) Illustrative energy landscapes for each stage of IAPP-S20G assembly, based on the observed structures and their calculated stability based on a single fibril layer to scale each peak height. Each peak is labeled by the fibril structure it represents. Not intended as a comprehensive depiction but rather a potential snapshot of the kinetically accessible states at each assembly stage. See also Figure S11.

Представленные результаты раскрывают две интересные особенности сборки амилоида, которые до сих пор не были полностью признаны. Во-первых, мы представляем молекулярный механизм, с помощью которого могут формироваться более крупные фибриллы (рис. 7B) путем присоединения субъединиц, которые прикрепляются к предварительно сформированным поверхностям своих предшественников. Низкое содержание видов 3PF и 4PF в образцах Tau, Аβ и α-синуклеина, полученных от пациентов и наблюдавшихся до настоящего времени (все они собираются из изначально неупорядоченного полипептида), позволяет предположить, что эта особенность может быть дезактивирована in vivo, возможно, путем связывания молекулярных шаперонов или других макромолекул с поверхностью фибрилл (обзор сделан в Ulamec et al.⁶⁵). Определение структуры фибрилл WT IAPP или IAPP-S20G in situ (с помощью электронной томографии) или ex vivo (с помощью cryo-EM) поможет ответить на этот вопрос. Во-вторых, мы показали, что время является важнейшим, но недостаточно изученным фактором в формировании амилоида и, следовательно, возможно, в прогрессировании амилоидной болезни. Для IAPP полиморфизм, изменяющийся со временем, представляется общим свойством сборки амилоида: показано, что фибриллы WT hIAPP и IAPP-S20G созревают из в основном неразрешимых типов фибрилл в определенные структурированные полиморфы. Наиболее примечательно то, что мы продемонстрировали непосредственно с помощью cryo-EM определения структуры, что ранние стадии сборки амилоида IAPP-S20G воспроизводимо содержат полиморф фибрилл (2PFP), который структурно отличается от тех, что образуются в более поздние периоды. Недавний отчет о cryo-EM структурах фибрилл во время сборки фибрилл tau in vitro, которая заканчивается полиморфом, имеющим отношение к болезни, повторяет эти ключевые результаты в другой амилоидной системе, где многие структурированные промежуточные фибриллы образуются и исчезают по мере сборки.⁶¹ Это поднимает возможность того, что ранние стадии сборки амилоида in vivo могут содержать в настоящее время не изученные архитектуры фибрилл с потенциально отличными патологическими свойствами от тех, которые наблюдались до сих пор.

В данной работе мы показали, что полиморфизм амилоида hIAPP изменяется в процессе сборки, представив исследование созревания фибрилл с высоким разрешением, в результате которого было обнаружено неожиданное явление: структуры фибрилл, сформированные на ранних стадиях сборки, структурно отличаются от тех, которые наблюдаются на поздних стадиях.

Экспериментально получить последовательное поведение при формировании амилоида довольно сложно, и поэтому существует ограничение на уровень количественного анализа, который можно провести, сравнивая процентное содержание полиморфа в одно и то же время с другим. Главный вопрос, возникающий в ходе нашего исследования, заключается в том, происходит ли непосредственная взаимопревращение различных полиморфов, как это формально возможно при созревании фибрилл 2PF^C в фибриллы 4PF^CU в фазе плато, или же взаимопревращение фибрилл требует разборки на мономерные или переходные олигомерные виды до их повторной сборки в новую амилоидную складку. Для ответа на этот вопрос потребуются будущие исследования, которые позволят отслеживать отдельные виды фибрилл в режиме реального времени, например, путем разработки фибриллярно-специфических зондов. Кроме того, дальнейшая работа по изучению посевного потенциала фибрилл, образующихся на разных стадиях сборки, и их устойчивости к деполимеризации, денатурации и фрагментации будет опираться на структурные представления и обеспечит более детальное механистическое понимание сборки. Изучение структур, образующихся при сборке других амилоидогенных белков, поможет определить, является ли изменение полиморфизма со временем фундаментальной концепцией формирования амилоида in vitro, в то время как для определения того, созревают ли фибриллы в биологических условиях и каким образом, потребуются аналогичные эксперименты, проведенные в клетках или на животных моделях. Наконец, дополнительными важными нерешенными вопросами являются то, как фибриллы различной структуры влияют на клеточный гомеостаз и, возможно, на возникновение дисфункций и заболеваний. Такая работа будет иметь решающее значение для будущих терапевтических исследований заболеваний, связанных с амилоидозом. В связи с этим мы отмечаем, что структуры WT IAPP и IAPP-S20G из тканей человека еще предстоит определить, а структуры описанных здесь реакций сборки in vitro не обязательно будут одинаковыми.