Нейроразвивающие расстройства у людей могут проявляться с различными клиническими проявлениями. С одной стороны, у пациентов могут наблюдаться откровенные структурные дефекты в развитии мозга, такие как микроцефалия, а с другой стороны, они могут проявляться относительно скромными когнитивными изменениями, такими как аномально задержка развития или различные уровни интеллектуальной недостаточности. Эти клинические проявления также могут возникать как следствие внутриутробных инфекций или воздействия токсинов, таких как свинец, или недостатка питания (Ijomone et al. 2020; Daliry and Pereira 2021). Глобальное бремя психических заболеваний для Индии (Sagar et al. 2020) оценено в 2017 году ~193 млн чел, т.е. 14,3% населения Индии, страдали от той или иной формы психического заболевания. Из них самая большая доля, 4,5%, приходится на идиопатическую умственную отсталость; этиология, лежащая в основе этого состояния, остается неизвестной и может включать как генетические и не-генетические факторы окружающей среды. Анализ сети не диагностированных заболеваний (https://. undiagnosed.hms.harvard.edu/), может помочь в решении проблемы этиологии таких расстройств, диагностика которых остается сложной.



Figure 1. Categories of brain disorders found in the OMIM database...

Для того чтобы установить генетическую основу расстройства нейрального развития, необходимо провести секвенирование для выявления мутаций в последовательности ДНК пациента, которые могут лежать в основе клинических проявлений. Такие исследования секвенирования ДНК могут проводиться на разных уровнях, включая секвенирование специализированных генных панелей (Ganapathy et al. 2019) для известных генов, которые ранее были связаны с нервными расстройствами, клиническое секвенирование экзомов [список из 3000-6000 экзомов генов, которые ранее были связаны с заболеваниями человека (Corominas et al. 2022)], и целого экзома (т. е. секвенирование экзонов, кодирующих белок, и прилегающих интронов из ~20000 генов в геноме человека) или секвенирование всего генома. Хотя специализированные панели ценны для выявления специфических мутаций в ранее известных генах, связанных с нейроразвивающими расстройствами, идентификация новых генов, приводящих к этим расстройствам, потребует использования непредвзятого секвенирования экзома или всего генома. Кроме того, для того чтобы установить наследственный характер обнаруженных мутаций (в отличие от мутаций de novo), необходимо будет провести трио секвенирование и анализ, т.е. генетический анализ пробанда вместе с обоими родителями.

Хотя существует множество вариантов секвенирования определенных наборов генов или геномов, более сложной задачей является возможность оценить значимость вариантов, обнаруженных у индивидуума в определении его клинического фенотипа (Grody 2019). В случае последовательностей, кодирующих белки, было разработано несколько алгоритмов (Miosge et al. 2015; Richards et al. 2015), но они не всегда не всегда способны точно определить функциональную значимость варианта кодирующего белок. Кроме того, особенно в случае редких генетических заболеваний, частота встречаемости данного варианта аллеля в популяции среди людей без клинических признаков, становится важной; в этом случае важно наличие частот аллелей в соответствующем наборе популяционных данных. Например, при оценке значимости варианта в условиях азиатского генетического фона, следует иметь в виду, что большие базы данных вариантов, такие как gnomAD (https://gnomad.broadinstitute.org/) относительно слабо представлены информацией из образцов азиатского происхождения. Кроме того, структура популяций в разных частях света может быть различной, и понимание этой структуры будет иметь важное значение для интерпретации значимости вариантов, обнаруженных у людей с редкими генетическими заболеваниями (Nakatsuka et al. 2017; Wall et al. 2023).

После идентификации вариантов неопределенной значимости (VUS), становится необходимым определить их функциональное значение. Для решения этой задачи можно использовать несколько подходов; например, можно сравнить молекулярные свойства (например, активность фермента активность) генного продукта, продуцируемого вариант-содержащим геном, по сравнению с продуктом дикого типа. В качестве иллюстративного примера, фосфоинозитиды представляют собой класс липидов, особенно богатых в мозге и мутации во многих ферментах, которые синтезируют и их деградируют, лежат в основе многих редких генетических заболеваний человеческого мозга (Raghu et al. 2019). В недавнем исследовании биохимический анализ in vitro был использован для измерений 3' фосфоинозитид-фосфатазной активности дикого типа миотубулярина и сравнен с активностью вариантов этого гена, зарегистрированных у пациентов с Х-сцепленной миотубулярной миопатией (Bhattacharyya et al. 2023). Дополнительный подход, который можно использовать, заключается в определении субклеточной локализации продукта варианта гена по сравнению с диким типом при экспрессии в культивируемых клетках. Синдром Lowe - редкое, Х-сцепленное рецессивное заболевание, обусловленное мутациями в фосфоинозитид 5' фосфоинозитидной фосфатазе OCRL1 (Mehta et al. 2014). Например, в недавнем исследовании (Ahmed et al. 2021) проверялся паттерн локализации мутанта, идентифицированного у пациента с синдромом Lowe, c нейроразвивающим расстройством, а в более масштабном исследовании изучалась локализации нескольких вариантов аллелей, выявленных у пациентов с синдромом Lowe (Lee et al. 2023; Ramadesikan et al. 2021).

Уникальной проблемой при изучении редких заболеваний мозга является необходимость изучения механизмов, с помощью которых мутации в генах приводят к изменению клеточной биологии и, как следствие, физиологии клеток мозга человека. Это связано с тем, что человеческий мозг недоступен для биопсии и анализ полученного образца ткани невозможен кроме как в посмертных условиях. Кроме того, в контексте нервных расстройств необходимо понимать изменения в структуре мозга и активности мозга в зависимости от возраста развития. Исторически сложилось так, что использование моделей грызунов, несущих мутации в гомологичном гене, были ценными инструментами для моделирования как нервных (Fallah and Eubanks 2020) и нейродегенеративных (Myers and McGonigle 2019) редких заболеваний мозга. Однако в случае некоторых генов мышиный нокаут у мыши гена человеческого заболевания не может фенокопировать клиническую картину. Этому есть множество причин, включая различия в регуляции генов человека и мыши, а также наличие нескольких генов. Редкие генетические заболевания мозга с мутациями гомологов, обеспечивающих видоспецифическую компенсацию (Jaänne et al. 1998b; Bothwell et al. 2010). Гуманизированные модели мышей, учитывающие эти факторы, могут облегчить анализ патогенеза заболеваний в этих условиях (Ito et al. 2018). Кроме того, некоторые аспекты развития мозга, такие как наличие определенных типов клеток, степень расширения коры головного мозга и лежащие в их основе клеточные механизмы, различаются между мозгом грызунов и приматов (Florio and Huttner 2014), и поэтому мышиные нокауты генов, влияющих на такие фенотипы, могут не воспроизводить клинические признаки человеческого заболевания. В таких условиях одной из альтернатив является моделирование заболеваний человеческого мозга на приматах, которые поддаются экспериментальному изучению, таких как marmoset (Homman-Ludiye and Bourne 2020).

Совсем недавно доступность современных технологий получения стволовых клеток позволила получить линии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC) из соматических тканей (кровь или кожа) отдельных пациентов (Shi et al. 2017). Затем эти hiPSC могут быть дифференцированы in vitro обеспечивая химические сигналы для направления дифференцировки в сторону ткани мозга; это можно делать как в 2D, так и в 3D (органоидных) культурах. В контексте заболеваний мозга возможность получения таких культур (рис. 2A-D) позволяет исследователям отслеживать ключевые аспекты развития и физиологии нейронов, глии и других типов клеток мозга. Используя физиологические методы, таких как внутриклеточная Ca²⁺ визуализация и цельноклеточная патч-кламп электрофизиология (рисунок 3A-D), можно отслеживать развитие нейронной активности в зависимости от возраста развития in vitro (Sharma et al. 2020) и соотнести это с нейральным развитием in vivo. Когда этот подход применяется с использованием hiPSCs, полученных от индивидуума с генетическим нарушением мозга, можно получить представление о клеточных механизмах и механизмах развития, приводящих к клиническим фенотипом у человека (Zeng et al. 2014; Russo et al. 2015). В настоящее время существует множество примеров использования этого подхода для изучения заболеваний мозга, включая расстройства нейрального развития, такие как аутизм (Bhattacharyya and Zhao 2016; Akhtar et al. 2022; Susco et al. 2022), нейродегенеративные заболевания (обзор в Penney et al. 2020), атаксии (Hommersom et al. 2022) и эпилепсии (Tidball and Parent 2016; Sterlini et al. 2020).

В дополнение к анализу клеточных механизмов при заболеваниях мозга, линии hiPSC, полученные от пациентов, могут быть использованы для скрининга химических соединений, способных обратить вспять клеточные корреляты заболеваний человека (Wang et al. 2017; Hommersom et al. 2022), а также для понимания генетических и клеточных основ реакции на анти-психотические средства и стабилизаторы настроения (Vadodaria et al. 2019; Pisanu and Squassina 2023; Saha et al. 2023). В результате они представляют собой ценный ресурс для скрининга лекарств на определенных генетических фонах, а также для фармакогеномики и точной психиатрии (Pardinas et al. 2021; Sadee et al. 2023).

Хотя 2D- и 3D-модели культур in vitro, описанные выше, могут дать важное представление о клеточных и молекулярных механизмах, вовлеченных в человеческие расстройства мозга человека, также важно иметь экспериментальные модели, способные воспроизвести влияние

Рисунок 2. Визуализация нейронных культур, полученных из hiPSC, через 3'

заболевания на физиологию и поведение животного в целом. Исторически сложилось так, что использование мышиных моделей было популярным подходом к моделированию заболеваний мозга, возникающих в результате мутаций в определенных генах. Однако в некоторых случаях мышиные нокауты человеческих генов могут не повторять клинические проявления, наблюдаемые у пациентов (см. обсуждение выше). Биоинформационный анализ показывает. что, помимо M. musculus (мыши), почти все 536 генов OMIM, связанных с генетическими нарушениями мозга, почти все гомологи у D. rerio (рыбок данио), D. melanogaster (плодовых мушек) или C. elegans (червей) (рис. 4; дополнительная таблица 2). Каждый из этих организмов имеет

Figure 3. Functional activity of hiPSC-derived neural culture in vitro.

редкие генетические заболевания мозга разного уровня сложности и доступность сложных молекулярно-генетических инструментов в этих модельных системах должно позволить использовать их для понимания физиологических или поведенческих аспектов редких генетических расстройств мозга. На примере синдрома Lowe, редкого Х-сцепленного генетического заболевания, поражающего глаза, почки и мозг, является хорошим наглядным примером ценности использования нескольких модельных организмов для изучения специфического редкого генетического заболевания мозга. Изначально синдром Lowe был смоделирован на мышах путем создания нокаута в мышином гене OCRL1. Однако из-за функционального перекрытия с гомологом Inpp5b, эти животные жизнеспособны и фертильны и не проявляют ни одного из клинических фенотипов синдрома Lowe (Jänne et al. 1998a). Удаление обоих OCRL1 и Inpp5b является эмбрионально летальным; однако гуманизированная модель мыши, в которой Inpp5b заменен на его человеческий гомолог фенокопирует дисфункцию проксимальных почечных канальцев и дефекты физиологии почек при синдроме Lowe хотя она не фенокопирует дефекты глаз и мозга (Festa et al. 2019). Напротив, у рыбок данио истощение гомолога OCRL1 приводит к дефектам как в почках, так и в мозге (Oltrabella et al. (Oltrabella et al. 2015) и мозга (Ramirez et al. 2012). Таким образом, в зависимости от того, о каком гене идет речь, может потребоваться подобрать подходящую модель для моделирования аспектов фенотипа заболевания (рис. 4).

В целом, несмотря на то, что диагностика редких генетических расстройств и понимание лежащих в их основе механизмов остается сложной задачей, однако появление новых технологий секвенирования, подходов на основе стволовых клеток и молекулярно-генетических исследований в модельных организмах открывает новые возможности для разработки более совершенных диагностических средств и новых терапевтических вариантов.