Посещений:
DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY

ADVANCES IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY GENE THERAPY
Judith C. T. van Deutekom, Gert-Jan B. van Ommen
Nature Reviews Genetics 4, No 10, 774-783 (2003); doi:10.1038/nrg1180

Since the initial characterization of the genetic defect for Duchenne muscular dystrophy, much effort has been expended in attempts to develop a therapy for this devastating childhood disease. Gene therapy was the obvious answer but, initially, the dystrophin gene and its product seemed too large and complex for this approach. However, our increasing knowledge of the organization of the gene and the role of dystrophin in muscle function has indicated ways to manipulate them both. Gene therapy for Duchenne muscular dystrophy now seems to be in reach.


Рис.1.  | Structural domains of the human full-length dystrophin, Becker mini- and micro-dystrophins, and utrophin.


Рис.2.  | Schematic representation of the exon-skipping strategy.


Рис.3.  | Therapeutic exon skipping in cultured myotubes from a DMD-patient (DL363.2) with a deletion of exons 45–54.


Рис.4.  | Schematic representation of the human utrophin A and B promoter regions and the factors that affect expression.

Boxes


Box 1.  |  Recombinant adeno-associated viral vectors

Табл.1 Overview of strategies for Duchenne muscular dystrophy gene therapy

Табл.2 Overview of animal models for Duchenne muscular dystrophy gene-therapy studies

Табл.3 Overview of therapeutic exon skipping for a series of DMD-causing deletions

Links

DATABASES
LocusLink: DMD | UTRN
OMIM: Becker muscular dystrophy | diabetes type 1 | Duchenne muscular dystrophy | haemophilia IX | Pompe disease

FURTHER INFORMATION
Leiden muscular dystrophy pages
X-сцепленный ген dystrophin (DMD) является самым большим из 30,000 генов, которые кодируют белки в геноме человека: его 79 экзонов занимают 2.6 миллионов base pairs (bp). Такой большой размер делает ген склонным к событиям перестройки и рекомбинации, которые вызвают мутации. В большинстве случаев мутации являются делециями одного или нескольких экзонов (~60%); однако дупликации (~6%)1, транслокации и точковые мутации также встречаются (см Leiden muscular dystrophy pages in online links box). В целом мутации, которые разрывают рамку считывания диранскриптов дистрофина и ведут к преждевременному, абортивному синтезу дистрофина, обусловливают Duchenne muscular dystrophy (DMD). DMD является наиболее частым летальным наследственным заболеванием детей: 1 на каждые 3,500 мальчиков рождается с ним2.
Dystrophin является важным структурным элементом в мышечных клетках, который закрепляет белки внутреннего цитоскелета на мембране волокон. Потеря функционального дистрофина вызвает повреждения волокон и мембрнаы начинают протекать3,4, но потенциальная роль белка заключается в передаче сигналов5,6, это указывает на то, что симпотомы болезни м. иметь двух-составоной источник. Прогрессирующая мышечная слабость делает всех DMD пациентов привязанными к креслу кателке ещё до 12 лет и пациенты обычно умирают в свои двадцать.
Мутации в гене дистрофина обычно не нарушают трансляционной рамки считывания, что приводит к ослабленному Becker muscular dystrophy (BMD) фенотипу, который обнаруживается у 1 из 20,000 новорожденных мальчиков2. У BMD пациентов аберантный транскрипт находится in-frame и кодирует дистрофин, который несмотря на внутреннее укорочение возможно присутствует на низких уровнях, и является, по крайней мере частично, функциональным. Пациенты BMD , следовательно, обнаруживают от промежуточного до слабого фенотипа и имеют большую продолжительность жизни.
Множество различных стратегий генной терапии DMD было изучено и улучшено (см. Table 1). Основное внимание будет уделено трем относительно новым стратегиям: the delivery of functional mini- and micro-dystrophins by recombinant adeno-associated viral (rAAV) vectors; therapeutic antisense-induced exon skipping; and dystrophin replacement by utrophin upregulation.

Conventional gene-therapy strategies


Размер дистрофинового гена явился важным препятствием для разработчиков генной терапии. Для замещения дефектного гена дистрофина искусственная дистрофиновая кДНК конструкция д.б. перенесена в ядра мышечных клеток, где она м. экспрессироваться и регулироваться соответственно. Итак, чтобы доставить 14 kb дистрофиновой кДНК (11.5 kb кодирующих последовательностей), необходимы вектора большой ёмкости. Ёмкость первой генерации аденовирусных векторов (до 8 kb) была слишком маленькой. Позднее открыты высокой ёмковти (28 kb) 'gutless' вектора, из которых удаляли все аденовирусные гены, обходя тем самым ограничение и предоставляя добавочные преимущества благодаря снижению иммунной реакции хозяина на вирусный вектор и улучшению персистенции экспрессии трансгена в мышцах7,8. Однако необходимо было преодолеть две критические проблемы прежде чем использовать вектора для терапии: они слишком велики, чтобы легко проходить через EXTRACELLULAR MATRIX, который окружает зрелые миофибриллы, и очень небольшое количество adenoviral attachment рецепторов на поверхности миофибрилл (9,10 о возможном решении последней проблемы).
В противоположность аденовирусным векторам, herpes simplex virus type-1 (HSV-1) вектора м. ести большие включения. HSV-1 обнаруживают довольно высокие уровни TRANSDUCTION in vivo, но также как и gutless аденовирусные векторы, это имеет место только у новорожденных и в регенерирующих мышцах11,12. IMMUNOGENICITY и CYTOTOXICITY HSV-1 препятствует долговременной экспрессии трансгенов.
Размер полной длины кДНК дистрофина не является проблемой для невирусных ДНК плазмидных векторов, которые м.б. созданы для крупных вставок. Эти вектора являются синтетическими и не-инфекционными, поэтому они пригодны для клинического использования (идут клинические испытнаия phase I 13). Однако эта стратегия доставки является неэффективной в мышечной ткани, поэтому необходимы cationic lipid редакции (formulations), ELECTROPORATION, PRESSURIZED ISOLATED-LIMB PERFUSION или MICROBUBBLES и ультразвук для усиления эффективности TRANSFECTION14-16.
MYOBLAST TRANSPLANTATION, другая стратегия поставки гена дистрофина также имеет проблемы, которые связаны с использованием ее в клинике: специфическое иммунное отторжение, ограниченное распространенение клеток и плохая жизнеспособность миобластов непосредственно после трансплантации17-19. Однако разрабатываются стратегии, призванные решить эту проблему20-23. Недавно сходная клеточно-терапевтическая стратегия, которая испоьзует стволовые клетки, происходящие из костного мозга, мышц или кровеносных сосудов, обнаружила определенный успех на мышиных моделях дистрофии (таких как mdx; Table 2) и DMD мышцах18,24,25.

Alternative genetic strategies


Разработано несколько альтернативных подходов к генной терапии DMD. Одним из многообещающих новых путей является использование chimeroplasts — двунитчатых ДНК-РНК олигонуклеотдов — чтобырепарировать гены in situ посредством клеточной ДНК репарационной кухни (machinery)26. Эта стратегия пооозволяет репарировать точечные мутации в экзоне 23 гена дистрофина у mdx мышей и в интроне 6 CXMD golden retriever собак (ещё одна модель DMD; Table 2)27-29. Этот метод всё ещё неэффективен и сильно зависит от скорости репарационной активности в интересующих клетках хозяина. Тем не менее подход м.б. многообещающим благодаря своим эффектам, которые кумулятивны и постоянны. Оптимизация химии олигонуклеотидов, частот репарации и поставки эта стратегия м. в дальнейшем увеличть эффективность коррекции до терапевтического уровня.
Используется ещё одна альтернативная стратегия AMINOGLYCOSIDE для супрессии преждевременного стоп-кодона, который обусловливает DMD. Напр., gentamicin восстанавливает экспрессию функционального дистрофина в скелетных мышцах мышей mdx30. Несколько клинических испытаний на людях с этим conventional лекарством были инициированы у отобранных DMD пациентов. Однако в одном испытании воздействие gentamicin на людей оказалось безуспешным. Также повтороне исследование на мышах mdx ооказалось неспособным воспроизвести первоначальные обнадёживающие результаты31.

New strategies: mini- and micro-dystrophins


Reduction of the dystrophin transgene size. Большой набор делеций в гене дистрофина вызывает лишь легкие фенотипы у BMD пациентов (32). Итак, большие части гена, по-видимому, не несут витальной функции (Рис. 1). Чтобы картировать области, которые являются критическими для функции дистрофина, сконструировано несколько линий mdx трансгенных мышей, котрые несут разные делеции во всех 4-х дистрофиновых доменах.Делейии в N-терминальном домене ассоциированы с относительно слабыми фенотипами, это указывает на то, что данная область м.б. не существенной для прикрепления актина и цитоскелета33,34. Напротив делеции в богатом цистеином домене вызывают тяжёлую дистрофию из-за разрушения всего dystrophin–glycoprotein комплекса35. C-терминальный домен, с его паттернами альтернативного сплайсинга,по-видимому, не обязателен для сборки этого комплекса35,36. Ряд крупных делеций был оценён в центральном палочкидном домене 37-40, было показано, что хотя палочковидная структура является необходимой, однако ряд повторов м.б. существено сокращён. Однако собственно позиционирование повторов, а также присутствие и конфигурация шарнирных областей являются критическими. Мини-конструкция в 6.2 kb (ΔH2–R19)39, которая сожержит 8 повторов и шарнирные области 1, 3 и 4, получена для воспроизведения делеции экзонов 17–48 у BMD пациентов32 (Рис. 1). Эта конструкция оказалась полностью функциональной: трансгенные mdx мыши, которые несли эту конструкцию, не обнаруживали морфологии дистрофичных мышц и имели нормальную мышечную силу.
Др. мини-дистрофиновые конструкции также ослабляют патологию у mdx мышей38. Эти исследования показали, что 5 повторов и два шарнира существенны для обеспечения критической длины и гибкости в палочковидном домене. Дальнейшее уменьшение осуществимо, как показывают некоторые микро-конструкции (3.6–4.2 kb), которые оказались высоко эффективными в поддержании почти нормальной мышечной структуры и функции, по крайней мере у мышей37,39-41. Самая маленькая эффективная микро-конструкция (ΔR4–R23)39 содержит только 3.6 kb и несет 4 повтора и шарнирные области 1, 2 и 4 (Рис. 1).
Transgene delivery with rAAV vectors. Благодаря увеличению наших знаний о дистрофиновом белке и исследованиям по картированию доменов, которые дали функциональные генные конструкции, стал вопрос об определенных ген-переносящих векторах с ограниченной insert ёмкостью. В частности стало возможным использование rAAV векторов (Box 1). Разные мини- и микро-дистрофинове генные конструкции были клонированы в rAAV type-2 векторах и тестрованы на mdx мышах38,39,41,42. Эти исследования показали, что rAAV доставка конструкций, несущих 4, 5 или 8 повторов, в комбинации или с двумя или тремя шарнирными областями, является эффективным средством лечения симптомов DMD в этой модели. Реверсия mdx-ассоциированных морфологических аномалий наблюдалась по крайней мере спустя 6 мес. после инъекции независимо от выбора промотора (CMV, MCK или CK6), инъецированной мышцы (gastrocnemius или tibialis anterior) и возраста мыши на время инъекции. В целом наблюдалось широко распространенная высокая экспрессия мини- и микро-дистрофинов с правильной локализацией на мембранах волокон и восстановлением dystrophin–glycoprotein комплексов. Tерапевтический эффект характеризуется исправлением некоторых патофизиологических параметров, ассоциированных с mdx фенотипом, таких как изменчивость диаметра волокон, миофибрилл с центральным расположением ядер, снижение интеграции мембран и некрозы. Эти данные указывают на то, что rAAV-обеспечиваемая доставка эффективных мини- и микро-дистрофиновых геных конструкций м. ослабить или даже остановить прогресирование дистрофии на длительрное время.
Однако наблюдается высокая иммунная реакция на rAAV-доставляемый (чужеродный) трансгенный продукт в дистрофических мышцах по сравнению с нормальными мышцами43,44. Это связывают с воспалительрными условиями в mdx-мышцах и эффектом совместо-инфицируемых antigen-presenting cells (APCs), которые активируют цитотоксические Т лимфоциты против трансгенных продуктов, которые вызывают деструкцию трансдуцированных миофибрилл. Также NEO-ANTIGENS высвобождаются из протекающих дистрофичных миофибрилл и презентируемых с помощью миобластов и регенерирующих миофибрилл44. Чтобы минимизировать иммунную реакцию rAAV-базирующейся DMD генной терапии необходимо использовать иммуно-супрессирующие лекарства, мышце-специфические промоторы, чтобы устранить активацию APCs и полностью функциональных микро- и мини-дистрофиновых конструкций и чтобы защитить волокна от дегенерации и высвобождения нео-антигенов.
Perspectives. Микро- и мини-дистрофиновые конструкции эффективны у mdx мышей, но следует учитывать, что патофизиология у людей заметно тяжелее и необязательно, что такой подход окажется столь же эффективрным у DMD пациентов. Минимальная функциональная потребность у дюдей в дистрофиновом белке и в его критических доменах м. оказаться другой, чем у мышей. Более того, все ещё открыт вопрос, м. ли микро- и мини-дистрофины полностью восстанавливать мышечную силу (а также предупреждать мышечные вопреждения) т.к. для этого м. потребоваться большие дистрфины. Хотя rAAV и имеют потенциал для мышечной терапии, необходимы клинические испытания, которые будут способствовать дальнейшей оптимизации. AAV вектора, которые базируются на альтернативных capsid стереотипах, как было показано, обладают лучшей трансдуцирующей способрностью в мышцах45,46. Необходима также дальнейшая разработка векторов, находящих мышцы, для системного лечения DMD. Наконец, т.к. фракция rAAV векторов интегрирует в геном хозяина, то имется риск инсерционного мутагенеза. Однако этот риск невелик по сравненнию со спонтанным мутациоными и рекомбинациоными собыиями в хромосомной ДНК и м. быть перевешен терапестической пользой у DMD пациентов.

New strategies: antisense-induced exon skipping


Относильельно слабые BMD фенотипы, которые вызываются некоторыми большими делециями или нонсенс мутациями открывают и др. возможноую стратегию генной терапиии:пропуск экзона во время PRE-mRNA SPLICING, чтобы увеличить делецию, так чтобы она стала почти in-frame BMD аналогу (Рис. 2). Хотя создание больших делеций для терапевтических целей кажется интуитивно неразумным, но это часто происходит в природе. Некоторые BMD пациенты имеют мутации, которые должны обычно вызывать DMD-подобный фенотип. Критические различия в том, что эти мутации затрагивают сплайсинг-мотивы или взаимодействуют с выбором места сплайсинга и вызвают спонтанный пропуск (дополнительных) экзонов. Возникающие в результате транскрипты находятся in-frame и делают возможным синтез дистрофинов с внутренними делециями, которые м. в разной степени вызывать слабые фенотипы47-50. Такие нарушения сплайсинга часто, как полагают, вызвают изолированные кластеры 'revertant'(dystrophin-позитивных) миофибрилл у многих DMD пациентов. Хотя и редко, но эти ревертантные фибриллы м. увеличиваться с возрастом и их корорелирующее действие на тяжесть DMD широко дебатируется47,48,51,52.
Итак, очевидно, что пропущенные экзоны м. иметь терапевтическое значение, но вопросы остаются: как это м. индуцировать искусственно? Ответ получен при изучении японского пациента с DMD, у котрого в 52-bp frame-disrupting делеция в экзоне 19 обусловливает пропуск экзона 19 в транскрипте dystrophin53. Было предположено, что эта область м. содержать exon-recognition site (ERS) — известный также как exon-splicing enhancer (ESE) — которая является последовательностью богатой пуринами и котора янеобходима для корректного сплайсинга экзонов со слабыми splice-site консенсусными последовательностями54,55. Небольшой антисмысловой oligodeoxyribonucleotide (ODN) был изучен и был найден блок такой ERS последовательности, что подтверждено точным пропуском экзона 19 после трансфекции этого ODN в лимфобластоидные клетки человека56.
Exon skipping in the mdx mouse model. Возможность использования antisense oligonucleotides (AON) для индукции потенциально терапевтического пропуска экзона в DMD пре-мРНК продемонстрирована на PRIMARY MUSCLE-CELL CULTURES от mdx мышей57. Мыши mdx являются дефицитными по дистрофину благодаря нонсенс мутации в in-frame экзоне 23 (58; Table 2). В данном исследовании, 2'O-methyl-phosphorothioate AONs не были направлены против exon-internal ERS, а скорее против обоих сплайс-сайтов экзона 23. Пропуск этого экзона д. приводить к обходу нонсенс мутации и генерации in-frame транскриптов с небольшой внутреннеё делецией. Сплайсинг был успешно модулирован, используя AON, который был специфичным к 3' splice сайту интрона 22. Однако экзон 22 оказался сплайсированным вплоть до экзона 30, это указывает на то, что механика сплайсинга м.б. затронута более серьёзно. Такой транскрипт, который также оказался in-frame, обнаруживался на низких уровнях и делал возможным синтез белка дистрофина, который обнаруживался в ~1% трансфицированных mdx мышечных трубок. В последующих исследованиях структура AONs была нацелена на сплайс-сайты экзона 23 и дала обнадёживающие результаты59-61. AONs, которые были комплементарны 5' сплайс-сайту интрона 23 (который находится ниже экзона 23) как было установлено, более специфичны и эффективны, с минимальной эффективной дозой in vitro менее 5 nM61. При более высоких дозах до 300 nM, возникал паттерн альтернативного сплайсинга, который пропускал экзоны 22 и 23 (an out-of-frame combination). Эта область известна тем, что имеет альтернативные паттерны сплайсинга как в контрольных, так и mdx клетках62, a AONs м. усиливать такие локальные паттерны63. Это м.б. объяснено с помощью AON-индуцированных нарушений локальной конфигурации пре-мРНК, это, в свою очередь, м.останавливать SPLICEOSOMAL COMPLEX и заставляеть его устранить блокаду за счёт ligating non-sequential сплайс-сайтов. Несмотря на это, пропуск одиночного экзона 23 продуцирует значительные уровни дистрофина в обработанных мышечныхх трубках mdx. Более того, недавно установлено, что mdx мыши после внутримышечного введения эффективного для 5' сплайс-сайт AON, даёт почти нормальные уровни дистрофина почти полной длины в большинстве мышечных трубок, это улучшало функцию мышц64. Хотя этот эффект был оптимальным в течение 2–4 недель, дистрофин всё ещё обнаруживался спустя 3 мес. после инъекции.
Exon skipping in human DMD muscle cells. Первые доказательства терапевтического эффекта пропуска экзона в мышечных клетках от пациентов с DMD получены в исследовании, направленном на экзон 46 (65). Делеция одиночного экзона 45 составляет ( ~7%) среди наиболее частых мутаций, вызывающих DMD согласно базе данных по DMD (см. Leiden muscular dystrophy pages in online links box). Специфический AON-индуцированный пропуск экзона 46 достигнут в мышечных клетках от двух пацииентов с делецией экзона 45, с помощью таргетинга exon-internal ESE-подобных последовательностей, которые были pre-selected с помощью in vitro binding assay. При эффективности пропуска только в ~15%, рамка считывания восстанавливалась и инлдуцировался синтез дистрофина в более чем 75% трансфицированных мышечных трубок. Более того, существенные уровни дистрофина проявлялись в накоплениии белка. Т.к. пациенты с BMD с делецией экзонов 45–46 имеют довольо слабый фенотип, то такой белок д. обнаруживать терапевтический жффект на пациентов DMD с делециями экзона 45.
После выявления рада мутаций, вызывающих DMD становится ясным, что пропуск любого данного ээкзона м. оказаться эффективной генотерапией для многих различающихся мутаций (Table 3). Напр., пропуск экзона 51 д. восстанавливать рамку считывания у пациентов, которые несут делецию в экзонах 45–50, 47–50, 48–50, 49–50, 50, 52 или 52–63, которые в целом составляют до 17.5% от всех DMD пациентов. В самом деле пропуск только 12 различных экзонов м. бы теоретически скорректировать почти 75% из всех делеций (Table 3). В последующих исследованиях мы воздействовали на 21 DMD экзоны, которые были выбраны благодаря своей способности корретировать большинрство известных DMD делеций63 (J.C.T.D., unpublished data). Два AONs были разработаны для экзона — все направлены на exon-internal последовательности (но не обязательно все были ESE-подобными) — которые как предполагалось имеют частично открытую вторичную РНК структру при 37°C. Их соединение с последовательностями-мишенями per se как предполагалось будет менять вторичную exon pre-mRNA структуру, достаточную для предупреждения выбора экзона для его включения. Пилотные эксперименты на нормальных мышечных клетках человека выявлили набор AONs, которые эффективно обеспечивали пропуск 20 из 21 экзона-цели: экзоны 2, 8, 17, 19, 29, 40–46, 48–53, 55 и 59. Это указывает на то, что большинство экзонов в гене dystrophin является 'skippable', и что пропуск экзона м. б. применён к большинству мутаций (>75%), включая делеции, дупликации и нонсенс мутации in-frame экзонов.
Широкий терапевтический потенциал AONs продемонстрирован на культуре мышечных клеток от DMD пациентов, котоые имели разные делеции66 (напр., экзоны 45–54) (Рис. 2). Во всех случаях, экзоны-цели специфически пропускались и на довольно высоком уровне до ~90% (как на Рис. 3a), при этом индуцировался синтез существенных уровней дистрофина в более чем 75% обработанных клеток (Рис. 3b,c). Эти дистрофины локализовались в соответствующей сарколемме и восстанавливали dystrophin–glycoprotein комплексы, это строго подтверждало восстановление функции.
В параллельном исследовании, которое было нацелено на сплайс-сайт экзона 51, было достигнуто более постоянное обхождение делеции экзонов 48–5067. В этом случае антисмысловые последовательности были клонированы в small nuclear RNAs (snRNAs), которые вводили в культививруемые мышечные клетки с помощью рекомбинантных ретровирусов. Малы интегрированные 'factories' были внесены, которые затем стабильно и эффективно продуцировали антисмысловые последовательности. Конструкция, нацеленая на оба сплайс-сайта экзона 51, была особенно эффективна в индукции пропуска более чем в 60% клеток, в которые вносился синтез нового укороченного дистрофина.
Perspectives. Хотя пропуск экзонов является мутация-специфической терапией, важным внутренним преимуществом по сравнениюю с обычной генотерапией является то, что одновременно корректируются все изоформы дистрофина. Он также сохраняет исходную ткане-специфичную регуляцию генов. Более того, AONs являются малыми сиквенс-специфическми и синтетическими и поэтому относительно безопасны. Хотя имеющиеся результаты указывают на кратковременный терапевтический потенциал, некоторые параметры необходимо оптимизировать для клинического использования.
Одним из таких параметров является выбор последовательности-мишени. Т.к. экзон м.б. включен в мРНК только, которые и являются мишенями для AONs. Однако mdx исследования показали, что структура AONs, которые находят сплайс-сайты, д.б. критической. Напротив, стратегии, которые нацелены на последовательности внутри, взаимодействуют с выбором экзона для включения до сплайсинга: процесс, который ещё недостаточно изучен. Подтверждено, что вторичная структура экзона в пре-мРНК играет критическую роль для того, чтобы экзон был включен. Накапливаются доказательства, что жкзонные сигналы иные, чем ESEs участвуют в сплайсинге55. Если эта теория верна, то нацеленные на внутренние последователности AONs м. менять этот структурный сигнал для включени на ранней стадии, не нарушая действительный процесс сплайсинга. Эффективность большинства из AONs, которые были предназначены для 20 разных экзонов указывает на то, что таргетинг частично открытых структур в экзонах даёт больший выбор для создания AONs, с небольшими ограничениями по длине и составу оснований. Таргетинг внутренних последовательностей экзонов м. также обеспечивать более высокий уровень специфичности, чем консенсусные последовательности сплайс-сайтов, и м. уменьшать риск аберраций неспецифического сплайсинга. Более того в недавнем сравнительном исследовании ESE в экзоне 19 было показано существование более чувстительной мишени для AON-индуцированного пропуска экзона, чем фланкирующие сплайс-сайты68. Низкие концентрации AON, необходимые для индукции пропуска экзонов, также снижают этот риск.
Др. параметром является создание антисмыслового лекарства. В больширнстве упомянутчх исследований используются 2'O-methyl-phosphorothioate oligoribonucleotides. Химические модификации антисмысловых молекул обеспечивают их резистентностью к клеточным endonuclease и неспособностью индуцировать RNaseH-активность. Однако phosphorothioate модификации фосфатнного костяка м. вызывать токсические и/или не-антисмысловые побочные эффекты в клетках69,70. Недавние успехи в технологии создания AONs включают и модификации сахаров или остова, что м. улучшить их сиквенс-специфичность, резистентность е эндонуклеазам, сродство к РНК-мишеням, клточному потреблению и PHARMACOKINETIC PROFILE. Итак, альтернативно модифицированные AON аналоги, такие как locked nucleic acids (LNAs)71, peptide nucleic acids (PNAs)72 и morpholinos phosphorodiamidate oligomers73 сейчас оцениваются74.
Третий параметр это создание надежной и эффективной системы доставки. Это зависит от химических характеристик избранных антисмысловых лекарств. Proof-of-principle исследования, такие как у Lu и др.64, первоначально использовани внутримышечные инъекции AONs. Однако для клинического использования предпочтительней менее инвазивная система. Изучение системной доставки AONs у мышей показало, что только 5% оригинальной дозы достигает мышечной ткани75,76. Итак, высокие дозы или мышце-специфическое введение.

New strategies: utrophin upregulation


Dystrophin имеет гомолог, наз. utrophin77. Ген utrophin (UTRN) картирован на хромосоме 6q24 и содержит 74 экзона, которые занимают свыше ~1 Mb78. Хотя общая геномная длина гена utrophin составляет лишь треть от таковой гена dystrophin, его транскрипт (в 13 kb) почти столь же велик (Рис. 1). Dystrophin и utrophin очень сходны и возможно происходят из одного источника в результате удвоения 79. Одинаково с dystrophin, utrophin состоит из actin-связывающего N-терминального домена, центрального суперскрученного палочковидного домена и C-терминального домена, который взаимодействует с dystrophin–glycoprotein комплексом80 (Рис. 1). Наиболее существенным различием является в том, что у него отсуствуют spectrin-подобные повторы 15 и 19,и две шарнирные области dystrophin81.
Utrophin экспрессируется повсеместно в большинстве тканей — наиболее выражен в лёгких, кровеносных сосудах и нервной системе. В мышцах его локальная экспрессиия зависит от созревания: в мышцах плода он первоначально диспергирован по всей SARCOLEMMA, в ходе развития он постепенно замещается дистрофином82 , а в зрелых мышцах он локализуется только в нейромышечных и мычечносухожильных соединениях83. В постсинаптической мембране нейромышечных соединений utrophin ко-локализуется с ACETYLCHOLINE рецепторами и как полагают, выполняет структурную и функциональную роль в дифференцировке и поддержании доменов постсинаптических мембран84,85. Напротив, в регенерирующих мышцах DMD пациентов, mdx мышей aи dystrophin-дефицитных кошек utrophin обнаруживается активированным и перераспределенным в сарколемме86-88. Это наблюдение ведет к гипотезе, согласно которой utrophin м. иметь комплементаруню, а также защитную роль в дистрофических мышцах. Подтверждение этой гипотезы получено от мышей, дефицитных по utrophin–dystrophin, у которых обнаруживается тяжелая прогрессирующая мышечная слоабость, аномалии нейромышечных и мышечносухожильных соединений и преждевременная гибель89, 90. Фактически это лучшая модель для DMD изучения генотерапии, чем мыши mdxкоторые физически менее затронуты.
Utrophin to treat dystrophin deficiency. Исследования на mdx мышах показали, что возможность активирования utrophin для лечения DMD. Высокая экспрессия укороченного трансгена utrophin в сарколемме заметно уменьшает дистрофическую патологию внутриклеточный гомеостаз кальция и улучшает механические свойства мышц 901,92. Более того, аденовирусная доставка мини-utrophin восстанавливает dystrophin–glycoprotein комплексы, уменьшает количество фибрилл с центрально расположенными ядрами и тем самым нормализует дистрофический фенотип у трёх животных моделей DMD93-97. Эмкспрессия мРНК полной длины utrophin у трансгенных mdxмышей дает ещё лучшие, несмотря на то, что уровень экспрессии составлял 50% от нормального эндогенного уровняs98,99. В купе с данными, которые показали, что неспецифическая избыточная экспрессия utrophin полной длины не обладает токсическим эффектом в широких кругах тканей100,эти результаты указывают на то, что активация utrophin не нуждается в строгом контроле и тканевой специфичности.
Targeting the utrophin promoters. Два промотора (A и B) контролируют экспрессию101-103 полной длины utrophin A и B, соотв. (Рис. 4). Вышестоящий промотор A расположен в CpG ISLAND на 5' конце гена и содержит несколько предполагаемых сайтов связывания для транскрипционных факторов Sp1, Sp3 и Ap2, которые управляют конституитивной транскрпицией с этого промотора101,102. Он содержит также E-box, который связывает миогенные факторы, такие как MyoD, MyoG и MRF4 (104,105), которые регулируют utrophin мышце-специфическим способом. manner.
Др. важным элементом в промоторе A является N-box. В соответствии с его функцией в acetylcholine субъединице и гене esterase этот мотив ответственен за синапс-специфическую экспрессию utrophin106,107. Транскрипция с промотора A регулируется путём взаимодействия этого N-box с nerve-derived транскрипционным и ростовым факторами108-111. В самом деле, обработка культивируемых мышечных трубок agrin, L-arginine, nitric oxide (NO) или hydroxyurea, и in vitro и in vivo, увеличивает уровни utrophinв сарколемме18,112 (Рис. 4). Сходным образом избыточная экспрессия ростового фактора heregulin или Ets-родственного транскрипционного фактора GA-binding protein (GABPα/β) в культивируемых мышечных трубках обусловливает N-box-зависимое увеличение экспрессии utrophin109,110.
Исследования, подбные этим, не только вносят вклад в понимание регуляторных механизмов, которые контролируют временную и пространственную экспрессию utrophin, но и идентифицируют также потенциальные мишени для (малых) фармакологических соединений, чтобы увеличить экспрессию utrophin. Искользуя конструкции utrophin promoter–репортерный ген, Davies и др. скринировали библиотеки, чтобы идентифицировать соедирнения, которые м. существенно усилвать экспрессию utrophin-A, посредством ещё неизвестных путей. Однако несмотря на многолетние усилия, эти исследования не выявили какого-либо кандидата-лекаарства. Напротив, недавно было показано, что glucocorticoids вызывают повышение уровней белка utrophin113.
Более дистальный промотор B расположен в большом втором инитроне гена103 (Рис. 4). Он не сожержит N-box, a , следовательно, не контролируется синаптическим факторами. Utrophin промотор B, как полагают, ответственен за присутствие внесинаптических utrophin транскриптов, которые обнаруживаются в мышцах114. Фактически использование антител, которые специфичны для utrophin A и B (открывает снова их уникальные N-концы), так недавно было показано, что utrophin B экспрессируется во всех различных тканях специфически в сосудистых эндотелиальных клетоках115. Эти исследованания показывают также, что utrophin A (который экспрессирутся в нейромышечных соединениях, хороидном сплетении, pia mater и почечных гломерулах), но не utrophin B, объясняет увеличение уровней utrophin в dystrophin-дефицитных мышцах115. Utrophin B регулируется с помощью др. механизма по сравнению с utrophin A, a использование разных регуляторных элементов м. обеспечивать альтернативные мишени. Промоторная область содержит предполагаемые связывающие сайты для различных транскрпиционных факторов и одинаково с др. эндотелиальными генами он трансактивируется с помощью Ap1, Ets и GATA-2 (116, 117). Однако необходимо установить, м. ли utrophin B замещать dystrophin в дистрофичных мышцах, т.к. все исследования на mdx мышах проводились с трансгеном utrophin A.
Perspectives. Идея замещения отсутствующего или дисфункционального дистрофина утрофином, как функционально, так и локально, уникальна и открывает многообщающие терапевтические возможности для DMD. Усиление экспрессии utrophin имеет несколько преимуществ по сравнению dystrophin-based терапией. Т.к. utrophin не является neo-антигеном он вряд ли будет индуцировать иммунное отторжение. Более того, первые исследования показали, что отсутсвие кратковременных повреждающих эффектов от избыточной экспрессии подной длины, это указывает на то, что сторогий контроль за терапевтическим эффектом необязателен. 2-3-кратное усиление экспрессии utrophin оказывает достаточный терапевтический эффект, чтобы уменьшить патологию дистрофических мышц. Наконец, усиление активности utrophin фармакологическими соединениями д.б. довольно безопасным и делает возможным более прямое системное лечение, которое достигает всех мышц. Т.к. utrophin A, но не B, замещает dystrophin в скелетных мышцах, то вышестоящая промоторная область, по-видимому, является более пригодной мишенью для усиления активности. Хотя и охарактеризованы некоторые ростовые и транскрипционные факторы как эффективные активаторы промотора A, всё ещё остаётся задача по идентификции лакарств, которые окажутся достаточно utrophin-специфичными, чтобы устранять вооозможные побочные эффекты. В будущем возможно будут идентифицированы дальнейшие регуляторные элементы в гене в качестве потенциальных мишеней для этой стратегии118.

The future of DMD therapy


As with other monogenic diseases, the initial high hopes that identifying the gene responsible for DMD would rapidly bring rational therapy have been dampened. However, steady progress in understanding the gene and its function has pointed to several innovative therapeutic strategies. It now seems reasonable to expect that the next decade will see great advances in this field. Considering its efficiency and relative simplicity, the antisense approach seems the next candidate (and probably the most promising so far) for clinical trials. Indeed, would it not be fitting if the unique characteristics of DMD — the large size of the gene, the complexity of its processing and the intriguing milder BMD — were also to lead to an initial version of its therapy?