Ряд исследований показал, что трансплантации аллогенного костного мозга в NOD или BB крыс с целью индукции состояния химеризма, также м. предупреждать диабет и облегчать трансплантации allo- и xenograft островков.
. Т.к. эти механизмы предполагают вовлечение центрального и периферического химеризма, то пригодность этого подхода у людей затрудняется использованием очень высокой радиации для подготовки реципиента. Необходимо для завершения или частичное myeloablative воздействие или аллогенные доноры д.б. получены с помощью генетического инженеринга производных периферической крови аутологов гематопоэтических стволовых клеток с помщью трансгенов, способствующих индукции и активности иммунорегуляторных сетей. Независимо от средств, используемых для устранения аутоиммунитета, состояние, при котором диабетик свободен от аутореактивных Т клеток, а их нападение на панкреатические β клетки является оптимальным, чтобы позволить или способствовать восстановлению или регенерации достаточного количества инсулин-секретирующих клеток в эндогенной поджелудочной железе. Это м. привести к физиологической euglycemia.
Рассматриваемые как мощные иммуностимуляторы, DC, как недавно было показано, обладают tolerogenic характеристиками в определенных условиях. DC tolerogenicity проявляется в виде супрессии активации Т клеток в опухолях, при allo- и autoimmunity.
90 Условия, которые м. дать tolerogenic DC, включают облучение УФЛ, а также воздействие на cytotoxic T-lymphocyte antigen-4:immunoglubulin Fc слияние (CTLA-4Ig), transforming growth factor β (TGF-β) bkb interleukin (IL)-10.
91-93 Как действуют tolerogenic DC, чтобы супрессировать иммунореактивность, несовсем понятно, но оно м. использоваться для поддержки anergy Т клеток, которые приходят в контакт с DC, для сдвига от TH1- к TH2-типу ответа, апоптоза аутореактивных Т клеток или индукции регуляторных клеток, включая и регуляторные Т клетки и natural killer-T (NK-T) клетки.
90, 94-98 С целью установления продолжительного состояния толерогенности у реципиентов аллогенных трансплантатов, миэлоидные DC были генетически модифицированы с помощью аденовирусных и ретровирусных векторов, кодирующих CTLA-4Ig, TGF-β и IL-10 у мышей.
91-93. CTLA-4Ig-экспрессирующие DC существенно удлинняют жизнеспособность аллотрансплантата, м. индуцировать гипочувствительность alloantigen-specific T-клеток и обеспечить повышенную жизнеспособность неиммуносупрессированных аллогеных хозяев.
92 Презентация
in vivo аллоантигенов с помощью донорских или реципиентных DC в отсутствие ко-стимуляции вместе с локальной продукцией иммуносупрессивных молекул. подобных TGF-β, v/ скорее всего способствовать ингибированию антидонорской реактивности и способствовать индукции толерантности, не вызывая какой-либо большой системной иммуносупрессии. DC были engineered, чтобы экспрессировали vIL-10, вследствие переноса ретровирусного гена продуцируют vIL-10
in vitro, обнаруживая заметное снижение на клеточной поверхности MHC и экспрессии ко-стимулирующих молекул, снижение T-клеточной аллостимуляции и обеспечение индукции T-клеточной hyporesponsiveness.
91 Генетически engineered DC м.б. использованы для предупреждения отторжения аллогрфов островков, т.к. они способны манипулировать антидонорской и/или аутоантигенной иммунореактивностью. Показаная islet-специфическая экспрессия молекул в периферических лимфоидных органах м.б. подтверждена в APC
99 подобных DC, производных костного мозга (Machen
et al, un-published observations), так что м. вообразить инфузию автологичных DC-engineered
ex vivo, чтобы лишить их ко-стимулирующей способности, но при этом экспрессировать islet-специфические гены (eg, glutamic acid decarboxylase (GAD)-65 или insulin), у пациентов преддиабетических или в начальной стадии диабета, с объективной индуцированной аутоантиген-специфической hyporesponsiveness. Фактически, DC обрабатывались
ex vivo oligodeoxyribonucleotide ловушками к ядерному фактору &kappaB (NF-κB), важному maturational транскрипционному медиатору в DC, и инъецировались аллогенным хозяевам. Эти DC были способны пролонгировать выживаемость аллогенного сердца heart.
100 Вероятно, что этот и др. транскрипционые пути в APC будут использованы в качестве стратегий отлавливания нуклеотидов, чтобы презентовать антиген в отсуствие ко-стимулирующих сигналов или в присутствии death лигандов, чтобы замалчивать или убивать аутореактивны Т клетки.
Insulin replacement strategies
Новые иммуносупрессивные коктейли, культуры в присутствии гомологичных сывороточных белков, минимизация времени между procurement поджелудочной железы и процессингом островков в комбинации с трансплантацией больших масс β-клеток, были наиболее существенными ступенями в улучшении исходов трансплантаций островковв исследованиях Shapiro и др.
101-104 Хотя это не совсем ясно, какие из параметров обеспечивают наибольший успех, какие из множества факторов все еще ограничивают large-scale диффузию островков и замещение β-клеток у пациентов с type I диабета. Необходимость хронической иммуносупрессии и и во множественных донорах в качестве источника островков остаются главными причинами или факторами, которые навязывают исследователям поск альтернативных путей, которые позволят выживать клеткам островков allograft.
Технология переноса генов является таким оптимумом и обладает рядом преимуществ в животных моделях трансплантаций allograft островков. Табл. 2a и 2bпредставляют список экспериментов, в которых достигнута существенная пролонгация выживаемости островковых allograft или xenograft.
Основным препятствием подходов, базирующихся на переносе генов, является выбор векторов для переноса гена. Несмотря на первоначальный энтузиазм по поводу всесторонности аденовирусных векторов, их наследуемая иммуногенность вызывает ряд серьезных проблем в связи с возможностью использования engineer человеческих островков для клинического использования. s for clinical use. Появление lentiviral векторов позволило преодолеть некоторые трудности иммуногенности, но lentivirus оказались не столь эффективны ак аденовирусы в трансдукции интактных островков человека. Табл. 1a представляет список векторов для переноса генов, а также за и против при переносе генов в интактные островки. Однако, неодоцененным фактором, который скорее всего сказывается на успешности приживания островков, является метаболический статус самих островков после выделения и культивирования. Нет сомнения, что время между поиском органа и процессингом островков с промежуточными ступенями, включая холодовое хранение и ферментативно/механическое переваривание влияют на выход, жизнеспособность и функцию островков.
30, 105 Более того, условия культивирования до трансплантации м. существенно затрагивать физиологию клеток островков, а , следовательно, шансы успешного приживления. В общем, прекращение поставки кислорода в ткани поджелудочной железы во время забора донорских органов, как известно, запускает ишемические повреждения, свободными радикалами обусловленные дегенерации клеток, а также инициирует апоптоз.
106, 107 Отделение островков от отделяющего матрикса и от соседних клеток в зависимости от процедуры отделения в большей или меньшей степени активирует апоптоз клеток.
108, 109. Непосредственно начинающаяся ишемия, как полагают, важный детерминант острого и хронического отторжения allograft.
10 Кроме того, органы, несущие загрязняющие иммунные и большое чтсло эндотелиальных клеток, или органы, в которых отлавливаются тромбоциты, и будут скорее всего переживать т.наз. 'cytokines storms', когда начинающиеся апоптические процессы вызывают аномально большое высвобождение хранящихся цитокино и др. провоспалительных растворимых медиаторов. Более того, цикл, иницируемый при этом высвобождением цитокинов м. обострять формирование реактивных промежуточных продуктов оксиления (oxygen intermediates).
111 Возможно, что комбинация всех этих механизмов предрасполагает островки к средовым посреждениям как во время культивирования, так и в месте трансплантации, где воспаление скорее всего происходит вскоре после имплантации, даже до начала алло-иммунной реакции. Потенциальным подходом для устранения этой ситуации м.б. перфузия органа растворами, содержащими химические ингибиторы апоптоза (ZVAD-fmk), а также антиапотические гены, подобные bcl-2, bcl-xL, и энзимы, которые прерывают или предупреждают образование свободных радикалов, таких как catalase, thioredoxin, heme-oxigenase-1 and superoxide dismutase.
112-117 Некоторые из этих антиапоптических белков, слитые с protein-transduction доменами м. успешно предотвращать апоптоз и существенно улучшать приживание и жизнеспособность осровков повле выделения.
30,118,119 Установлено, что включение синтетических mimetics уборщиков свободных радикалов, по-видимому, предупреждает дегенерацию островков, возможно, ограничивая инициацию апоптического процесса.
105,119 Островки воспринимают также довольно эффективно олигонуклеотиды. Знание первичных транскриптов, чьи белки участвуют в активации апоптоза или супрессии продукции инсулина м.б. использованы для таргетинга с помощью антисмысловых олигонуклеотидов вовремя процедуры изоляции.
Как уже упоминалось, олинуклеотидная терапия предлагает простой и удобный метод для воздействия не только на экспрессию генов, но и на транскрипцию, используя короткие двунитчатые ловушки, содержащие сайты связывания для специфических транскрипционных факторов, участвующих в воспалительной реакции, подобных like NF-κB и STATs. Растворимые связывающие белки и лиганд-связывающие домены хемокинов также м.рассмативаться как потенциальный инструмент, с помощью которого м.б. предупреждена дисфункция первичных островков. Хемокины являются мощными иммуноаттрактанами высоко резистентными к деградации и они секвестрируются с помощью протеогликанов на эндотелии.
120, 121 Хемокины способствуют эндотелиальной адгезии помимо своих хемотактических свойств.
120, 121 Действительно, были идентифицированы кодируемые белки, которые соединяются с хемокинами и м.б. использованы для блокирования хемокинов.
122, 123 Эта блокада м.б. легко достигнута при использовании peptide transduction доменов, слитых с рекомбинантными белками, или при использовании коротких олигонуклеотидов, особенно если они применяются во время procurement и reperfusion донорской поджелудочной железы. Однако, долговременная экспресиия некоторых из этих молекул, м. оказывать более значительный эффект на выживаемость транплантата, елси однажды достигнута стабильная экспрессия гена. Это требует использования генных векторов, которые м. поставлять терапевтические гены с objective oэкспрессией в течение всей жизни реципиента.
Инъекции животным ряда векторов, подобных аденовирусам
124-133, кодирующих проинсулин пд контролем ряда промоторов, включая и CMV, insulin, phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK) и
L-pyruvate kinase (LPK) вызывают коррекцию гипергликемии. Во многих примерах, hоднако, эффект временный. Этот подход страдает от сильной иммуногенности вирусов и во многих случаях невозможно повторное введение из-за генерации нейтрализующих антител. В случае LPK продемонстрирована низкая кинетика, хотя в одной работе с этим промотором оказалось возможным достичь относительно быстрой реакции на глюкозу.
131 Наконец, многие ткани не экспрессруют необходимые протеиназы, чтобы превратить проинсулин в мощный биоактивный инсулин.
Суррогатные β клетки предлагаются в качестве альтернативы трансплантации интактных островков и для непосредственного введения векторов, экспрессирующих проинсулин. Разнообразные типы клеток, включая фибробласты, мышцы, нейроэндокринные клетки м.б. перестоены, чтобы продуцировать инсулин.
134-138, 126, 128, 129 Гепатоциты особенно привлекательны,т.к. они легко м.б. трансплантированы в печеньи т.к. они обладают идентичными glucose-sensing молекулами, что и поджелудочная железа (eg, GLUT2, glucokinase (GK)). Более того, м. использовать ряд промоторов генов гепатоцитов, которые чувствительны к глюкозе, в том смысле, что engineer трансгены инсулина будут чувствительны к концентрации глюкозы. Несмотря на ряд обещающих подходов, использующих ряд glucose-regulated промоторов,
126, 128, 129, 131,139-144 необходима еще значительная работа по получению удовлетворительных гепатоцитов, полностью замещаюшщих β клетки. Во-первых, гепатоцит не способен собственно действовать подобно β-клеточному суррогату является их неспособность отвечать на глюкозу значительно более быстрым способом, что характерно для β клеток. cells. Во-вторых, печень-специфические чувствительные к глюкозе промоторы имеют элементы, которые отвечают на гормональные и метаболические сигналы, которые м. затруднять, ослаблять или устранять обычную тонкую регуляцию глюкозы. Напр., в случае hyperglucagonemia, которая ожидается в отсутствие функциональных эндогенных клеток β eу иабетиков, будет скорее всего ослабляться или репрессироваться LPK промотор, также как и др. промоторы, такие как GK.
129,145,146 В-третьих, глюкозо-зависимая трансактивация промотора LPK promoter нужадется в GK-зависимом фосфорилировании глюкозы, т.и. в активности, которая инсулин-зависима.
129 Др. промоторы, такие как PEPCK, активируются glucagon и ингибируются инсулином, это не м. обеспечить необходимой кинетики физиологической gluco-regulation.
147,148 Возможно, что комбинация промоторных элементов от разных отвечающих на глюкозу печеночных генов д.б. создана, чтоабы управлять экспрессией инсулина в печни настоящим чувствительным к глюкозе способом.
Совсем др. подход, когда используются ткане-специфические промоторы для превращения клеток, экспрессирующих инсулин, в клетки, которые не нацелены на аутоиммунную деструкцию. Lipes
et al149,150 экспрессировали инсулин в переденей доле гипофиза у мышей NOD под контролем pro-opiomelanocortin промотора. Инсулин экспрессируется, накапливается в секреторных гранулах и обнаруживает регулируемую секрецию. Более того, трансплантация ткани трансгенной передней доли гипофиза мышам NOD была способна восстанавливать частично нормгликемию без каких либо признаков иммунного отторжения.
149,150 Неясно, однако, является ли в этих клетках секреция инсулина зависимой от концентрации глюкозы. Интересный подход с использованием кишечных К клеток в качестве суррогатных, продуцирующих инсулин. Трансгенные мыши экспрессируют инсулин человека под понтролем промотора gastrointestinal inhibitory peptide (GIP). Такие мыши экспрессируют и секретируют инсулин кишечными К клетками, в которых промотор GIP активен. Секреция инсулина в этом случае чувствительна к глюкозе и поддерживается в результате применения streptozotocin, указывая тем самым, что K клетки spared the effects of streptozotocin.
151 Эти данные указывают на то, что они м.б. пригодными для таргетинга кишечных клеток векторами, кодирующими GIP-insulin трансгены, или для
ex vivo engineering кишечных клеток, в которых чувствительные к глюкозе промоторы управлют экспрессией инсулина. Однако, д.б. разработан эффективный способ высвобождения продуктов генов этими клетками
in vivo, т.к. эти клетки присутствуют в криптах кишки, что мешает трансдуцировать их вирусными векторами.
Stem/progenitor cells
Несмотря на условия культиврования и манипуляции детерминация в β клетки и продукция инсулина не всегда совпадают.
152-157 Взрослые стволовые клетки из костного мозга или из др. тканей м. 'трансдифференцироваться' в ряд др. клонально отличающихся типов клеток. Такие стволовые клетки описаны и иногда физически изолированы в нервной системе, поджелудочной железе, мезенхиме, печени, кости, мышцах и эндотелии. Гематопоэтические стволовые клетки, в некоторых исследованиях, были способны давать эндотелиальные, головного мозга, мышечные, печеночные и мезенхимные клетки. В некоторых исследованиях они генерировались также из нейрональных или мышечных стволовых клеток (Wagers
et al88). Однако ряд препятствий охладил энтузиазм. Загрязнение гематопоэтических стволовых клеток мезенхимными предшественниками или зпрограммированость с помощью ростовых факторов в культуре, а также феномен слияния стволовых клеток с тканевыми клетками являются наиболее важными переменными, которые необходимо протестировать.
88,158 Однако, сохраняется уверенность, что мезенхимные клетки костного мозга м.б. мультипотентным источником клеток.
85-87 Однако, нет данных о том, м. ли такие клетки дифференцироваться в островковы и β-клеточные клоны. Ясно, что способность манипулировать с blood-borne предшественниками по превращению их в β-клеточный клон м. оказаться важным прорывом в технологию суррогатных β-клеток.
Несмотря на противоречия и серьезные этические затруднения, вызываемые технологией клонирования, очень вероятно, что терапевтическое клонирование в жестких ограниченных условиях, найдут вое место в терапии стволовыми клетками.
159-161 В этой связи, одним из возможных способов разведения β клеток или предшественников и избегания иммунной реакции м.б. наследуемое удаление ДНК или ядра из соматических клеток пациента и его перенос в энуклеированные эмбриональные стволовые клетки и их экспансия до соответств. β-клеточного клона. Пока это чрезвычайно спеклятивно, но возможно.
Иммортализация клеток островков с β-клеточным фенотипом достигнута. Продукция инсулина, однако, по-видимому, связана с терминальной дифференцировкой клеток, событие наступающее при остановке роста. Эта проблема ограничивает использование клеточной иммортализации. Кроме того этот подход сопряжен с возможностью онкогенной трансформации.
162-165
Все еще противоречивые эти данные указывают на то, что зрелые β клетки человека м.б. индуцированы к репликации под действием hepatocyte growth factor (HGF).
166-168 Ограничения этого подхода, однако, покоятся на потере дифференцировке, индуцируемых β клеток вместе с существенным снижением продукции инсулина.
169 Обусловленная репликация не-человеческих β клеток достигнута за счет помещения SV-40 T антигена под контроль индуцибельного промотора.
163 В этих исследованиях, β клетки были способны реплицироваться и поддерживать дифференциованную функцию в индуцибельных условиях. Нет даннх о том, м. ли такой подход быть приложим к человеческим β клеткам.
Размножение клеток предшественников островков с последующими генетическими манипуляциями, детерминирующими β-клеточный клон, также рассматриваются.
156,170 Чтобы стать пригодным, этот подход, однако, нуждается в более четком понимании иерархии master регуляторных транскрипционных генов. В зависимости от типа клеток, избыточная экспрессия PDX-1 м.б. в них давать β-клеточные или β-cell-подобные фенотипы.
171-174, демонстрируя, что аденовирусный перенос гена PDX-1 в печень м. давать клетки, экспрессирующие инсулин, хотя и неясно, являются ли эти клетки глюкозо-чувствительными и действительно ли секретируют инсулин timely образом. Др. важные транскрипционные регуляторы, ассоциированные с дифференцировкой эпителиальных клеток протоков в клетки эндокринных островков, включают HNF семейство транскрипционных факторов, PAX-4 и PAX-6, NeuroD/B2, Nkx 2.2 и Nkx 6.1.
173, 175-186 и в меньшей степени TGF-α,
179,187-190? gпредполагается акже, что передача сигналов fibroblast growth factor (FGF) является важной для генерации β клеток.
189,190 Стратегии, нацеленные на engineering β-клеточных предшественников из панкреатического эпителия протоков с помощью FGF в присутствии пермиссивной экспрессии PDX-1 м. способствовать экспансии β-клеточных предшественников или дифференцировке предшественников в пре-β-клеточный клон.
Идентифицирован класс факторов, чья экспрессия и продукция ассоциированы с регенерацией поджелудочной железы.
191-193 Reg-секретируемый белок, в частности, способствует увеличению β-клеточной массы у крыс после панкреатэктомии.
194-196 Экспрессия и секреция др. молекулы, которая принадлежит к семейству белков Reg, названной islet neogenesis-associated protein (INGAP), являются активируемыми в островках хомячков, где искуственно индуцировн неогенез.
197, 198 Точная роль INGAP в пролиферации и функции β клеток неясна.
Bonner-Weir
et al199 показали, что оказаться пригодным получение кластеров β клеток из экзокринной панкреатической ткани, из которой возникают эпителиальные клетки протоков, предназначенные стать эндокринными панкреатическими островковыми клетками. Этот подход интересен тем, что зрелая не-эндокринная ткань поджелудочной железы не нужно очищать от них в процессе выделения островков, они м.б. использованы в определенной кульуральной системе для генерации клеток, предшественников островков, для манипуляций с ними генетически или гормонально.
Т.о., перенос комбинации генов, кодирующих растворимые и факторы внутриклеточной дифференцировки в стволовые/родоначальные клетки м. оказаться пригодным, если будет известна их точная роль на пути детерминации и диффренецировки β клеток. Однако, β клетки имеют ограниченный сорок жизни
in vitro. Какую роль в этом играют апоптоз или старение, неясно. Рассматриваются возможные способы переноса циклин-зависимых киназ, прорепликационных и митотических факторов и/или теломеразы для увеличения продолжительности их жизни под контролем регулируемых промоторов. Такой подход м. увеличить экспансию полудетерминированных или полностью детерминированных клеток предшествнеников островков или ранних β клеток. В комбинации с xenogeneic донорскими манипуляциями, эти вмешательства м. обеспечить получение почти неограниченных во времени β клеток для трансплантаций. Нокаут нефункциональной α(1,3)-galactosyltransferase, чтобы получить трансгенных свиней, дефицитных по этому энзиму, позволяет предсказать включение модельностей, которые позволят использовать трансгенные островки свиней вместо аллеогенных человеческих островков для транплантации.
200, 201 Значение этого подхода нельзя недооценивать, исходя из того факта, что это основная мишень для xenoreactive антител, которые способствуют острому отторжению ткани свиней. Т.к. это основной xenoantigen у свиней, то определенно и др. минорные свиные эпитопы будут вносить свой вклад, но не в острое отторжение, а при хроническом xenograft отторжении.
Looking towards the future
Clearly, many unexplored avenues await to be negotiated with the technology in existence today. First, combinations of immunosuppressive transgene cassettes should be used to transduce intact islets in culture in parallel with efforts at identifying the vector with the least immunogenicity. Second, it will be impossible to infect every single β-cell within intact islets; consequently, it may be more effective to target soluble molecules that activate β-cell death. In this way, vectors that may not be islet transduction-efficient, yet nonimmunogenic and stably integrating, can still be used effectively when expressing multicistronic transcripts encoding inhibitors of multiple proapoptotic pathways, for example. Cell therapy will very likely include stem and progenitor cells as replacement or surrogate β cells. The biology of these cells is now beginning to be unraveled, and in parallel with advances in tolerance induction and gene transfer technology may yield an efficient means of promoting not only islet allograft or xenograft survival, but may even lead to operational tolerance in an autoimmune background.