Посещений:
Генотерапия: Репарация Мутаций

THE DEVELOPMENT AND REGULATION OF GENE REPAIR
Li Liu, Hetal Parekh-Olmedo, Eric B. Kmiec
Nature Reviews Genetics 4, No 9, 679 -689 (2003); doi:10.1038/nrg1156

A technique that can direct the repair of a genetic mutation in a human chromosome using the DNA repair machinery of the cell is under development. Although this approach is not as mature as other forms of gene therapy and fundamental problems continue to arise, it promises to be the ultimate therapy for many inherited disorders. There is a continuing effort to understand the potential and the limitations of this controversial approach.


  • Разрабатывается новая стратегия генной терапии, целью которой является коррекция генетических мутаций непосредственно в хромосоме.
  • Этот подход использует однонитчатую ДНК, чтобы активировать пути репарации ДНК в клетке и управлять обменом мутантных оснований в точной локализации в хромосоме.
  • Эта молекула однонитчатой ДНК м.б. введена в клетки без использования вирусов, которые являются классическими векторами/переносчиками, которые используются для генотерапии.
  • Если это окажется успешным, то 'процесс генной репарации' сможет, по-видимому, снизить побочные эффекты, которые возникают при стратегии вирусной генотерапии.
  • Ключом к успеху является способность корректировать или ревертировать мутации с частотами, которые окажут благоприятный терапевтический эффект.
  • Обсуждаеются подходы по преодолению барьеров на этом пути.


    • PHOSPHOROTHIOATE
    A modification that provides nuclease resistance in an oligonucleotide in which a non-bridging oxygen is replaced by a sulphur atom in the oligophosphate backbone.
    EPISOMAL
    In the context of transient transfection, this term refers to a plasmid target that is extra chromosomal.
    FLUORESCENCE-ACTIVATED CELL SORTING
    (FACS). A method whereby dissociated and individual living cells are sorted, in a liquid stream, according to the intensity of fluorescence that they emit as they pass through a laser beam.
    PSORALEN
    A photosensitizing chemical that is used for determining RNA–DNA structures in cells, and intercalates between two strands in duplex DNA.When attached to an oligonucleotide, psoralen forms interstrand crosslinks.When exposed to ultraviolet light, it forms photoadducts, crosslinked chemical bonds within adjacent bases.
    MONO-ADDUCTS
    A form of DNA lesion induced by DNA damaging agents, such as ultraviolet radiation,which on longer exposure can be converted into covalent crosslinks in the DNA.Monoadducts can, to an extent, induce recombination in yeast, mammalian and bacterial cells.


    Рис.1.      | The evolution of the vector.


    Рис.2.      | The gene-repair process.


    Рис.3.      | The yeast chromosomal targeting system and modified single-stranded DNA oligonucleotide Hyg3S/74NT.


    Рис.4.      |  Model of the DNA-pairing phase of gene repair.

    Табл.1 Universal chart of gene-repair activities: successful gene-repair applications

    Links

    Databases
    LocusLink: HBB | MSH2 | MSH6 | RAD51 | RAD52 | RAD54
    OMIM: altered apolipoprotein E2 | β-thalassemia | CAII deficiency | Crigler-Najjar | Pompe disease | sickle cell disease
    Saccharomyces Genome Database: rad51 | rad52

    Further Information
    Eric B. Kmiec's laboratory
    В недавнем обзоре вирусной геннотерапии Thomas et al.(1) проиллюстрировали некоторые проблемы, с которыми сталкивается вирусный подход и обсуждены некоторые из неблагоприятных событий. В частности, смерть в 1999 Jesse Gelsinger, привлекшая внимание всего мира к опасности инфузии больших количеств вирусного вектора пациентам и стимулировнию побочных иммунных или токсичеких реакций. В конце 2002 при генотерапевтических испытаниях во Франции у некоторых пациентов развилось лейкемия-подобное заболевание. Рак, по=видимому, наиболее показателен из интегративных событий, катализируемых ретровирусными векторами, которые использовались для переноса генов. Геномная интеграция является частью жизненного цикла таких вирусных векторов и существует реальная возможность возникновения рака.
    В обзоре будет оценен потенциал репарации генов - нового гено-терапевтического подхода, при котором генные мутации исправляются в месте возникновения ошибки в хромосоме. Эта стратегия не использует вирусы и не имеет целью добавление генетического материала в геном человека.

    The problem


    В противовположность классической генотерапии фундаментальной целью генной репарации является фиксирование, возвращение или исправление мутантного основания, которое отвественно за генетическую дисфункцию. Это резонная цель, т.к. многие нарушения или синдромы связаны с простыми альтерациями оснований в одиночном гене и теоретически вставка нормального дикого типа основания д. приводить к ‘излечению’. Одновременная коррекция мутаций во многих клетках м. в конечном счете облегчить страдания пациента. Незнание физиологии и патологии болезни часто является ‘Ахилевосой пятой’ молекулярной медицины. Так, напр., хотя серповидно клеточная болезнь обусловливается точковой мутацией в кодоне 6 гена глобина человека, но сама по себе болезнь сложна и на ее тяжесть влияют др. факторы, лишь некоторые из которых имеют генетическую основу (2,3). Итак, соотв. протокол для генной репарации м.б. разработан только тогда, когда известны все аспекты заболевания во всей сложности.
    Существует общее мнение, что реверсия мутаций в хромосоме является совершенной формой генотерапии. Но эта цель трудно достижима. Считается, что постоянная хромосомная репарация гена недостижима т.к. гомологичная рекомбинация происходит с частотой намного ниже, чем та, что необходима для достижения терапевтического эффекта. Хотя подсчёты частот гомологичной рекомбинации варьируют, в целом считается, что она происходит в 1 из каждых 104–105 клеток, стимулированных к гомологичной рекомбинации (4). Более того, для каждого специфического события гомологичной рекомбинации должно происходить множество неспецифических интеграционных событий и в этом заключается наиболее важная проблема — клетки человека, по-видимому, склонны скорее к случайной, чем специфической интеграции. Одно только это наблюдение сильно снизило первоначальный энтузиазм в отношении генной репарации. Несмотря на это предположение, что гомологичная рекомбинация и генная репарация осуществляются с помощью одного и того же механизма, м. оказаться преждевременным, возможно не все события, ассоциированные с гомологичной рекомбинацией, происходят во время генной репарации.

    Targeted gene repair
    Нет единого источника для концепции репарации генов. Серии несвязанных наблюдений были объединены в попытке упростить процесс и разраотать протокол изменения индивидуальных нуклеотидов (5,6). Ещё и теперь большинство генетических манипуляций у эукариот использует путь гомологичной рекомбинации. У низших эукариот, таких как Saccharomyces cerevisiae, гомологичная рекомбинация происходит регулярно без перекрывания с конкурирующими путями, такими как non-homologous end-joining (NHEJ)(7). Но в клетках млекопитающих частоты гомологичной рекомбинации гнетущи и даже техника, которая разрабатывается для усиления этого процесса, даёт лишь скромные улучшения (4). Др. проблема концентрируется вокруг попыток препарировать targeting вектор для реакции гомологичной рекомбинации. В большинстве случаев вектор состоит из кассеты длинных двунитчатых ДНК, которые содержат области ДНК гомологии на каждом конце с избирательными маркерами. Их подготовка связана со стратегией клонирования и субклонирования, которые требуют много времении временами очень сложны. Итак, импульсом для разработки генной репарации было не только изменение точно одиночного основания, но и достижение этого с помощью простого вектора, подготовка которого не требует значительных молекулярных манипуляций.

    A new generation of synthetic targeting vectors


    В целом, термин вектор используется для описания молекул чужеродной ДНК, которая вносится в клетки, чтобы повысить уровень генной экспрессии или, как в случае генной репарации, управлять специфическими изменениями оснований. Важно, однако, отличать синтетические gene-repair векторы от вирусных векторов, которые используются при более стандартных методах генотерапии. Синтетические векторы для изменений in vivo генов были впервые использованы Sherman и др. (8–10), чтобы показать, что олигонуклеотиды однонитчатой ДНК м. управлять in vivo изменениями оснований у S. cerevisiae. Заметим, что эта работа выявила несколько важных параметров реакции, котороые включают смещение нити, длину олигонуклеотида и тип мутации, которая д.б. целью. Хотя первоначально была использована однонитчатая ДНК для вызывания генетических изменений (11) эксперименты на дрожжах позволили создать более пригодную систему для тестирования эффективности хромосомных альтераций.
    Общепринято, что немодифицированная однонитчатая ДНК разрушается или становится неактивной в клетках эукариот, поэтому большинство векторов нового поколения содержат химически модифицированные основания или связи (12). Одним из таких векторов является олигонуклеотид RNA/CDNA (chimaera), который является однонитчатой молекулой, которая является комплементарной сама себе и складывается в конформацию двойной шпильки (13,14). Одним из наиболее характерных уникальных свойств химеры является присутствие оснований РНК на одной нити сложенного дуплекса (Рис. 1). Включение модифицированной РНК (2'-O-methyl РНК) необходимо, чтобы защитить от активности RNase (15,16). Спаренные молекулы, которые содержат короткие области гомологии (менее 30 п.н.), стабильно соединялись, если один из партнеров содержал РНК. Итак, включение РНК в химеру обеспечивает стабильность, которая является критической для прямой реакции репарации гена. Однако, из-за трудностей синтеза вектора и проблем очистки химер, структура вектора была упрощена в надежде сохранения его активности. Получение высоких концентраций целиком синтезированных полной длины химер проблематично , следовательно, необходим упрощенный способ: структура д. сохранять активность, её синтез не должен включать высокий процент n-1, n-2'­продуктов. Эволюция вектора свершилась благодаря ряду ступеней, которые использовали деконструкцию конфигурации двойной шпильки (Рис. 1). Используя бесклеточные человеческие экстракты и бактериальные клетки Cole-Strauss et al. (17) показали, что в качестве однонитчатой молекулы участки RNA/CDNA химеры обнаруживают маргинальную активность, тогда как одна нить ДНК обнаруживает или эквивалентный или более высокий уровень gene-repair активности. Чтобы увеличить период полужизни этих однонитчатых молекул ДНК in vivo были включены некоторые модификации концов при их синтезе, которые и явились новым поколением векторов. Первые конструкции были олигонуклеотидами, которые состояли из центрального участка ДНК с терминальными областями RNA18/C20 (RDO I и RDO II). Вторая генерация векторов была modified single-stranded DNA oligonucleotides (MSOs), которые содержали одну, две или три PHOSPHOROTHIOATE связи на каждом конце (12,21-C26). Стандартный RDO обычно длиной в 35-55 нуклеотида, тогда как MSOs в пределах 25-90 нуклеотидов с пиком их активности при 74 нуклеотидов (23).
    Недавно создан новый набор целенаправленных векторов. Ония являются продуктом бифункционального купирования двух олигонуклеотидов, которые сделаны так, что гибридизируются с каждой нитью спирали мишени или одновременно или последовательно. Каждый член этой пары должен содержать locked нуклеиновую кислоту, которая является РНК-подобным остатком ДНК, содержащим метиленовый мостик, который соединяет 2'-oxygen и 4'-carbon рибозы, давая в результате 3'-концевую-конформацию. Этот новый дизайн базируется на структуре критических реакционных промежуточных образований в процессе репарации генов, D-петля, которая создаёт матрицу для репарации. Рациональное увеличение периода полу-жизни D-петли должно естественно расширить временное окно для репарации. Ранее было установлено, что добавление второй молекулы ДНК, которая комплементарна смещенной нити одиночной D-петли, обеспечивает чрезвычайную стабильность (27-29). Это т.наз. двойная D-петля обеспечивает высокий уровень репарации генов in vivo (30). Drury and Kmiec (31) нашли, что преформированная D-петля управляет репарацией генов в 10 раз с большей скоростью, чем преформировнная одиночная D-петля.
    Альтернативная векторная система, small fragment homologous replacement (SFHR), использует PCR фрагменты, чтобы найти геномную ДНК и индуцировать прямые геномные альтерации (32). Впечатляющая активность, которая ассоциирцует с этим вектором, м.б. объяснена тем, что реакция промежуточных образований напоминает конформацию двойной D-петли, которая содержит спаренные билатеральные нити. Несмотря на распространённое мнение, что эффективность рекомбинации увеличивается с диной гомологии между геномной ДНК и целенаправленного вектора, поведение по обнаружению цели SFHR, довольно эффективно. В самом деле SFHR обладает потенциалом репарации F508 мутации гена cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR)(33) и гена mdx dystrophin и in vitro и in vivo (34), однако их механизмы действия нуждаеются в полном объяснении, прежде чем он будет рассматриваться в качестве терапевтичеакого средства.
    Хотя большинство целенаправленных попыток репарации генов сфокусированао на не-вирусных методах, однако, recombinant adenoassociated virus (rAAV) привлекают внимание в качестве векторов для исправления мутаций одиночных пар оснований в гомологичных сайтах геномной ДНК посредством определенного корректирующего механизма репарации. rAAV недавно был использован для коррекции замен одиночных пар оснований в гене enhanced green fluorescent protein (EGFP), который обусловливает отсутствие флюоресценции, и в результате достигнута эффективность в 0.1% (35). Однако, целенаправленное введение rAAV мутантным EGFP трансгенным мышам оказалось существенно менее эффективным в первичных фибробластах (0.01%) и не было выявлено коррекции in vivo после инфекции мышц мышей. Также и недавное сообщение, в котором описывается опасная интеграция rAAV у людей (36) ставит серьезеые препятствия этому подходу.

    Mode of action and applications


    Механизм, с помощью которого химеры RDOs и MSOs функционируют, изучены, но процесс репарации, который управляется каждым из типов молекул, по-видимому, осуществляется в две фундаментальные ступени: спаривание ДНК и репарация ДНК (13,37,38) (Рис. 2). В первой фазе, которая, по-видимому, является скорость ограничивающей (31), синтетическая молекула вступает в гомологичный регистр с сайтом на хромосоме, который предназначен для изменения. Это событие катализируется членами RAD52 эпистатической группы, наиболее вероятно RAD51 м RAD54 (23,39–45). Как только достигается выравнивание выявляются несоответствия одиночного основания между вектором и одной из нитей мишени. По сценарию вектор просто высвобождается от сайта-мишени за счёт диссоциации. Наблюдали, что молекула с модифицированным концом м. оставаться интактной в течение , по крайней мере, 40 ч (Liu et al., неопубл.). Напротив, олигонуклеотид ассимилируется с сайтом-мишенью и замещает одну из родительских нитей, вообще-то, интегрируясь непосредственно в спираль (46). Идея интеграции возникла благодарая наблюдениям, в которых не-матричная (нетранскрибируемая) нить гена-мишени оказывалась более поддатливой для генной репарации — MSOs или RDOs , синтезированные с последовательностей, комплементраных нетранскрибируемой нити, обеспечивали более высокие уровни репарации, чем комплементарные транскрибируемой нити (22–24). На этом пути, смещенная нить мишени удаляется с помощью активности нуклеазы, тогда как MSO ассимилируется в нить-мишень. На второй фазе оба пути, несоответствующие пары оснований (формируемые между вектором и мишенью) исправляются или ревертируются с помощью ДНК репарирующих энзимов, которые являются скорее всего членами семейства DNA mismatch-repair (47–49). Однако, согласно др. данным активным путём генной репарации является эксцизионная репарация нуклеотидов (50–52).
    Существует несколько проблем с интегративными подходами, связанными в основном с тем, что отсутствуют прямые экспериментальные доказательства интеграции. Имеются также исключения для предпочтения не-матричной нити, которые включают одну нить дрожжей, в которой матричная нить оказывается предпочтительной в качестве мишени (25). Степень в предпочтении нити варьирует существенно. Так, Yoon и др. первоначально сообщили о 1000-кратном сдиге в сторону нетранслируемой нити (19), но в недавней публикации эта предпочтительность была снижена до десятка. Такого рода изменчивость не является необычной для систем млекопитающих, в которых обычно используются репортерные конструкции, т.к. количество и положение мутантных генов в геноме определено не абсолютно. Существует также строгая вероятность, что полярность репликации ДНК предопределяет какая нить будет предпочтительнее (53). Итак, предпочтение нити, по-видимому, возникает как результат метаболических событий, таких как преимущественная репарация определенных несоответствующих оснований, уровень транскрипционной актиности внутри и вокруг гена, полярность репликации и положение корректируемого гена в хромосоме.

    Success stories


    Коррекция мутантных генов с использованием химер, RDOs и MSOs, достигнута в многих отличающихся системах. Список мишеней приведен в Табл. 1 (38), но мало успехов, заслуживающих упоминания. Наиболее поплулярной мишенью у разных групп является ген β-globin человека (HBB)(54–56), т.к. коррекция мутаций в HBB имеет важное значение для лечения серповидно-клеточной анемии и β-thalassemia. Альтерации др. генов млекопитающих, таких как tyrosinase (57,58) и alkaline phosphatase (59–61), дают важные подтверждения в пользу этой техники. Однако наиболее важной вехой явилось использование животных моделей, в которых был исправлен дефицит фактора IX (62,63), Crigler-Najjar (64), CAII deficiency (62,65,66), muscular dystrophy (67–69) и изменен apolipoprotein E2 (70). Хотя список успешных мишеней увеличивается постоянно, однако изменчивые уровни коррекции продолжают расстраивать исследователей. В некоторых исследованиях подчеркивается постоянная неудача в достижении какой-либо обнаружимой коррекции (71,72). Растет скептицизм в оношении техники в целом. Но техника постоянно продолжает совершенствоваться (73).

    Variability


    Существенные шаги были проделаны, особенно в определении факторов, регулирующих частоту. Yanez and Porter (42) показали, что высвобождение ДНК увеличивает успешность генного таргеттинга. Эта информатия была также получена и применительно к области генной репарации (74). В этом исследовании авт. подтвержили важность, которая ранее была установлена Steerи др., разработки эффективной стратегии высвобождения (delivery) с использованием lactosylated-PEI (polyethyleneimine), чтобы переносить большие количества химер в высокий процент клеток (63,75). PEI часто соединяют с углеводными или сахарными полвинками, которые способствуют их локализации в специфических органах. Работа Steer была воспринята с некоторым скептицизом из-за сообщенного высокого уровня генных репараций, но точно, что эффективность высвобождения скорее всего ответственна за успех техники. Thorpe et al. (74) также уделили много внимания оптимизации PEI-обусловленного высвобождения для некоторых клеточных линий и получили воспроизводимые количества EPISOMAL генной репарации. Др. группы сфокусировали своё внимание на максимализации высвобождения и достигли удвоения уровней коррекции (70). Но вообще-то наиболее впечатляющим примером важности высвобождения стала работа Liu et al. (56). В их исследовании микроинъекции CD34+ клеток химерами приводили к высоким уровням генной репарации, вообще-то, благодаря вектору вводимому непосредственно в ядро.
    Компетентность клеток катализировать генную репарацию является ещё одним фактором, который вносит вклад в вариабельность уровней конверсии. Достигнуты успехи, которые помогают искусным в репарации клеткам. Некоторые белки, которые играют роль в этом процессе, были идентифицированы — их активность снижает или повышает частоты генной репарации. Напр., Yoon и др. нашли, что репаративная активность повышается в p53–/– бесклеточных экстрактах (20), это указывает на то, что p53 м. супрессировать целенаправленно определенные несоответствия (mismatches) в этом процессе. Белок p53, как было показано ранее, модулирует связывание белков репарации ДНК с несоответствующими парами оснований (76,77) и т.к. сродство p53 в отношении mismatches в некоторых случаях противоположно паттерну сродства mismatch-repair генов MSH2 и MSH6, то очевидно, что генная репарация зависит от взаимоотношений конкурентного связывания между этими двумя силами.
    Исследования на дрожжах также помогли определить механизм генной репарации, особенно в оношении фазы инициального спаривания. Сходное наблюдение p53-индуцированной супрессии в бесклеточных экстрактах из линий дрожжей, которые были лишены rad52, позволило получить усиление активности (50), которое указывает на то, что Rad52также м. супрессировать реакцию генной репарации. Наиболее важным белком в процессе генной репарации, однако, являюется Rad51 — его доступность и активность являются критическими для достижения существенных количеств генных репараций у дрожжей. Значение Rad51 в генной репарации становится ясным, когда линии дррожжей, у которых отсутствует функциональный Rad51, обнаруживают сильное снижение активности геннгой репарации (50).

    Assay systems for gene repair


    Пригодной системой для для определения мехнизма генной репарации является та, при которой мишенью является слитая конструкция, которая содержит мутантный ген резистентности к антибиотику (такому как hygromycin) и EGFP ORF, как показано на Рис. 3. Эта реверсия кодона (TAC вместо TAT) снижает возможность того, что резистентность к hygromycin или EGFP флюоресценция возникнет в результате побочного загрязнения. Такой внутренний контроль обеспечивает увереннцю оценкую Кроме того такая система позволяет упрощенную оценку активности генной репарации на фенотипическом уровне, что м.б. подтверждено генотипическим анализом. Учитывая противоречивую историю, существует абсолютная потребность для анализа генной репарации в assay системе, которая позволила бы управлять направлением событий репарации без использования PCR амплификации as the primary screen. В наболе методов, предложенные ранее, мутации были в слитом гене, так что после коррекции и резистентность к hygromycin и EGFP флюоресценция м.б. измерены. Способность обеспечивать экспрессию EGFP является важной характеристикой этой системы потому, что хотя большинство событий генной репарации оценивается с помощью селективных маркеров (8–10,22,25), но селективное давление само по себе м. индуцировать мутагенные события или даже естественные реверсии. Безусловным преимущетвом скорректированной экспрессии дикого типа EGFP является то, что все клетки, участвующие в реакции, м.б. видимы, не только те, которые пережили селекцию. Итак, более аккуратное измерение эффективности коррекции м.б. достигнуто. Др. системой методов являются методы оценки векторов, включая и те, что используют ген антибиотика zeocin (78) или бактериальный ген lacZ (46) в качестве генетического редута.
    Любая из упомянутых систем м. давать изменчивые результаты из-за количества копий интеграции, маркерного гена, положении клетки-мишени в клеточном цикле, хромосомной локализации и/или чувствительности метода. Но в отличие от др. опубликованных систем, EGFP, по-видимому, наиболее подходит из-за того, что детекци прямая, с помощью FLUORESCENCE-ACTIVATED CELL SORTING (FACS), и не нуждается в окрашивании клеток или обработке их с помощью методов, базирующихся на бактериальных клетках. Получаемые оценки реальны и устойчивая к ошибкам система методов не будет давать занижения оценок.

    Frequency, frequency, frequency


    Разные типы методических систем помогают идентифицировать факторы, которые влдияют на процесс и частоты генной репарации в клетках дрожжей и млекопитающих. Напр., избыточная экспрессия Rad51, как было показано повышает частоту генной репарации в хромосомах при использовании системы hygromycin–EGFP слитых генов (23). Избыточная экспрессия rad51, по-видимому, улучшает эффектиность реакции фазы спаривания путём максимализации сродства Rad51 к Rad54, или путём повышения связывания Rad51 с вектором MSO (79). Фундаментальным является то, что экспрессия rad51 увеличивает активность генной репарации в клетках дикого типа, это важное дополнение для будущего использования генной репарации у людей.
    Частота, с которой события генной репарации приходят к своему завершению, м.б. предопределена тем, насколько эффетивно стартовал процесс. В реакции с любым типом молекулы ДНК, которая прдназначена для изменения специфического нуклеотида и которая вносится в клетку, ДНК спаривание наиболее важное событие во время сборки комплекса для коррекции. Rad51 способствует такому спариванию благодаря взаимодействию с др. членами Rad52 epistasis группы и с ДНК (80). Более того, недавние доказательства подтверждают идею, что Rad51 и Rad54 работают совместно, чтобы ремоделировать хроматин во время события strand-transfer, которое ведет к созданию D-петли (81) — основного реакционного промежуточного образования на пути репарации гена. Итак, Rad51 и Rad54 м. инициировать реакцию в дрожжах с помощью управления strand invasion и ремоделированием хроматина. Это чётко проверяемая гипотеза, которая м.б. тестирована (BOX 1), а результаты м. иметь серьёзные последствия для конструкции белковой машины, которач сможет естественно увеличивать частоту репарации генов в моделях высших эукариот.
    Эффект RAD51 на нахождение гена чётко продемонстрирован у млекопитающих (4,82). Yanez и Porter (41,42) наблюдали 2-4-кратное увеличение тергетинга гена hypoxanthine guanine phosphasyl transferase (HPRT) при избыточной экспрессии у людей RAD51 в HT1080 линии клеток. Но вообще-то более информативны результаты Thorpe et al. (39,40), которые описывают генную репарацию эписомальных мутаций, стимулированную избыточной экспрессией RAD51 человека. Особенный интерес прдставляет наблюдение, что величина стимуляции варьирует между линиями клеток, это указывает на то, что определенные клеточные линии не только варьируют в отношении своей способности наследования поддержки генной репарации, и также в отношении свой способности быть стимулированными с помощью RAD51.
    Эти данные, а также те, что описаны BOX 1, состаляют основу для модели первой фазы реакции генной репарации (Рис. 4). Каждая из 4-х ступеней этого пути представлена на Рис. 4 в сопоставлении между Rad51 и Rad51 (K342E). Взаимодействие между мутантным Rad51 и Rad54 продуцирует более ‘active’ нуклеопротеиновые филаменты, которые ищутся в ДНК по гомологии и ремоделируют хроматин более эффективно. На первой ступени Rad51 соединяется с одно-нитчатым вектором the single-stranded vector. Последующее взаимодействие с нуклеопротеиновой филаментоый и Rad54 инициирует поиск по гомологии на хроматиновой матрице. В финальной стадии реакции комплементраные нити вектора и спирали переплетаются во время ассимиляции нити, т.к. несоответсвующая пара оснований располагается в центре D-петли, то она становится доступной для коррекции. Хотя это событие репарации возможно катализируется энзимами mismatch-repair системы, эта фаза реакции еще неполностью понятна. Тем не менее возможно вообразить сценарий, в котором вторая ‘repair’ фаза (Рис. 2) также будет регулироваться с помощью искусственно преобразованных белков , которые буджут более чувствительны к несоответствиям в в D-петле.

    Dual targeting


    Дрожжевая система hygromycin-резистентности также м. использоваться в новом подходе, известном как dual targeting (Рис. 5). При таком использовании генной репарации гены человека, которые помещены в дрожжевые yeast artificial chromosome (YAC), изменяются на нуклеотидном уровне. Гены, которые обнаруживают особую устойчивость к направленному таргетингу м.б. изменены с использованием этой стратегии. YACs делают возможным поддержание и размножение больших фрагментов чужеродной ДНК, которые часто включают кодирующие и регуляторные области. Итак, интроны, экзоны и регуляторные области м.б. изменены, потому что геномная ДНК вставляется в YAC. Эти YACS м.б. помещены на генетический фон, в котором частоты таргетинга постоянно высокие. Исскуственные хромосомы нуждаются в некоторых существенных дрожжевых элементах для стабильной репликации и поддержания: дрожжевой центромере, дрожжевой autonomously replicating sequence (ARS)или источнике репликации, двух отличительных маркерах и теломерных последовательностях, которые способствуют добавлению дрожжевых теломерных повторов (83). Чтобы начать процесс, YAC, которая содержит ген человека, размножается в дрожжевой линии LSY678(Int)22, которая содержит интегрированную копию мутантного гена hygromycin-резистентности, Коррекция с помощью Hyg MSO приводи в результате к hygromycin резистентности и к росту на агаровых пластинках, содержащих hygromycin. Хотя репарация хромосомных генов становится видной благодаря резистентности к hygromycin, нуклеотидная мишень в гене человека (YAC) нет и она редко м.б. выявлена без экстенсивного анализа последовательностей ДНК. Следовательно, двойные векта, Hyg MSO и YAC MSO, м. электропортироваться в линию LSY678(Int), которая сожержит YAC, одновременно. После фазы восстановления (22) клетки пересаживаются на hygromycin и aureobasidin пластинки и резистентные колонии подсчитываются. Деленин количества Hygr-колоний на число aureobasidin-resistant колоний и дает эффективность коррекции, которая является величиной, которая дает оценку эффективности только активности хромосомной репарации. Все Hygrcolonies помещаются на 96-well culture plate в жилдкий бульон, который содержит hygromycin. Каждая выборка затем анализируется в отношении single nucleotide polymorphism (SNP), чтобы выявить non-selectable second-site изменения. Изменённые YAC, которые идентифицируются таким способом, м.б изолированы и внесены в соматические или embryonic stem (ES) клетки млекпитающих. Одним из преимуществ такой системы является то, что многие изменения м.б. получены высокопроизводительным способом, а факторы, которые усиливают генную репарацию, такие избыточная экспрессия RAD51, м.б. добавлены непосредственно в динию. Так, только одна 96-well пластинка необходима, чтобы создать non-selectable изменения нуклеотидов в гене человека, используя подход двойного таргетинга.

    DNA damage and the cellular environment


    Альтернативный подход к увеличению частот генной репарации - это внесение ген-специфических повреждений ДНК в область хромосомы, которая предназначена для изменения. Эта важная область исследования, т.к. повреждения м. стимулировать и локализовать репарационные активности в специфические сайты. to a specific site. К этому же, triplexforming oligonucleotides (TFOs) были конъюгированы с PSORALEN, который в ответ на активацию УФЛ формирует MONO-ADDUCTS и поперечные связи между нитями (84) ДНК. TFO обеспечивает специфичность благодаря спариванию его комплементраных оснований с мишенью, a активация psoralen индуцирует повреждения и репарацию. Хотя и имеются проблемы с этой технологией, такие как блокада раскручивания спирали, которое необходимо для ДНК метаболических процессов, эти бивалентные конфигурации, как было показано, стимулируют гомологичную рекомбинацию до уровней, которые в 3–50-раз выше фонового уровня (85–88). Имеются хорошо известные ограничения этой стратегии. Т.к. стабильное связывание часто нужадается в GC-богатых областях, то ограничивающие последовательности помещаются на targeting молекулу. Однако в ряде последних сообщений (78,89) высказываются сомнения в потребности polypurine/polypyrimidine в target области. Более того, однонитчатые векторы ДНКбыли использованы для модификации генов непосредственно в ES клетках без необходимости в специалных последовательностях (90). Эта работа показала, что специфическая модификация на уровне ДНК с помощью такого типа векторов не нуждается в sequence restriction, которые вводятся с помощью TFO. TFO определенно запоздало.
    Хотя попытки перестроить векотора и перекроить белки законны, но модификации хромосомных мишеней также д. рассматриваться как плодотворные. Поддержание хроматина в более открытой конформации или снижение скорости репликации, так что репликационная вилка держит хроматин в более доступном состоянии, является законной стртегией увеличения чатоты генной репарации. На клетках дрожжей (J. Sonntag, неопубл.) и млекопитающих (89) показано, что компетентные к репликации клетки, являются наиболее активными в реакции генной репарации. Белки, ремодулирующие хроматин, такие как RAD54 (91) или игибиторы деацетилирования гистонов, такие как trichostatin A, являеются перыми примерами факторов, которые м. влиять на процесс генной репарации. Взаимодействие между вектором и сайтом-мишенью является сутью техники и д.б. точным, чтобы минимизировать всё ещё существующую опасность неспецифического случайного мутагенеза. Подробные исследования не проводились, но некоторые общие исследования оказались способными найти аберрантные неспецифические события, которые были индуцированы с помощью этих синтетических векторов (65,78,92).

    Perspective


    Хотя очевидно, что цель по репарации генов у высших эукариот не реализована, она будет оставаться привлекательной. Временная суматошная активность в прошлом, но важные работы продолжают появляться, несмотря на хорошо известные противоречия, окружающие это поле деятельности. Недавние работы Lu и др. (93) лучший пример такого типа исследований по генной репарации. Они использовали стратегию Parekh-Olmedo и др. (94), чтобы создать векторо, который будет управлять репарацией точковых мутаций, которые вызывают болезнь Pompe. Их успешный подход включает несколько слоёв proof-of-principle экспериментов — сначала на культуре клеток, а затем на соотв. животных моделях. Используя определенную методическую систему, они четко показали репарацию на уровне ДНК, наследование нуклеотидных изменений и, наконец,появление нормальной энзиматической активности.
    In this review,we have emphasized the present state of gene repair from the perspective of the factors that affect its efficiency and reproducibility. Stable and nontoxic vectors, re-engineered proteins and malleable chromatin templates are the focus of present day efforts. But, all of these manipulations, although scientifically sophisticated and based on well-known cellular/molecular properties, still revolve around what the cell does naturally — repairing its own mistakes. In the end, harnessing this natural ability will be the best therapy of all.