Первичный иммунодефицит (PID) состоит из группы многенных болезней, характеризующихся нарушениями иммунного ответа, прирожденного или приобретенного. Это приводит к разным проявлениям, включая уязвимость для патогенов и условно-патогенных микробов, аллергию, воспаление, аутоиммунитет и рак. Идентифицировано более 260 нарушений [1]. Многие из них являются угрожающими жизни, особенно PID, затрагивающие T лимфоциты [2]. Поэтому были использованы hematopoietic allogeneic stem cell transplantation (HSCT) в течение почти 50 лет в попытке лечить PIDs [3-7]. Хотя HSCT может обеспечить лечение многих PIDs (включая severe combined immunodeficiencies - SCIDs), для др. T клеточных иммунодефицитов, Wiskott-Aldrich syndrome (WAS), hemophagocytic lymphohistiocytosis (HLH), chronic granulomatous diseases (CGDs) и некоторых др. болезней, процедура не лишена риска. Аллогенный конфликт между донором и реципиентом является основной причиной серьезных побочных событий (SAEs), таких как реакция трансплантат против хозяина (graft-versus-host disease (GVHD)) или отторжение трансплантата. Хотя эти препятствия обычно преодолеваются, когда доступен гено-идентичный донор по human leukocyte antigen (HLA), исход более опасен в др. условиях. Несмотря на это, наметился прогресс в разработке пригодных режимов ex vivo и in vivo для предупреждения GVHD, иммунные манипуляции (среди др. факторов) и выбор несовместимых доноров позволили существенно улучшить показатель эффективности лечения в последние годы [5-9]. Генотерапия для PIDs начинает складываться.

Gene therapy based on first-generation gamma retroviral (RV) vectors

Severe combined immunodeficiencies (SCID)-X1

В 1990s, некоторые исследователи стали рассматривать SCIDs как идеальные модели для генной терапии поскольку (i) тяжесть этих болезней (ii) ожидание, что внесение клеток предшественников предоставит преимущества в избирательном росте [10]. Принимая во внимания давнишние ожидания относительно T клеток, особенно памяти T клеток, исследователи полагали, что внесение HSC будет достаточным для восстановления устойчивого иммунитета T клеток. Описание коррекции иммунодефицита T клеток, вызванной реверсионными мутациями в SCID X1 и adenosine deaminase (ADA) SCID, составили солидную основу для тестирования генной терапии при SCIDs [11-13]. Gamma retroviruses (γRV), как полагают, являются удобными инструментами для обеспечения переноса генов в гематопоэтические клетки посредством интеграции ДНК копии из вирусной РНК (т.e. 'провируса') в геном клеток мишеней и затем её репликации во всех дочерних клетках. Были сконструированы вирусы, чтобы избежать саморепликации, переводя структурные гены в трансположение в линии вирус-продуцирующей линии клеток [14, 15]. Эти вирусы содержат long terminal repeats (LTRs) на конце своих геномов, которые позволяют провирусам интегрироваться в геном и обеспечить мощную энхансерную/промоторную активность вирусных генов (Fig. 1). Эти LTRs и были затем намечены для управления экспрессией трансгенов. Со временем, был достигнут прогресс в продукции векторов и в использовании новых оболочек, а также улучшены способности векторов трансдуцировать клетки гематопоэтических предшественников ex vivo, используя фрагмент фибронектина и добавляя цитокины: TPO, Flt3L и stem cell factor (чтобы вызывать клеточные деления - обязательное условие для интеграции γRV) [16-18].

Figure 1. Vectors used in gene therapy. Column 1: overall architecture of vector genome (simplified), LTR, long terminal repeat; ?RV, gamma retrovirus; SIN, self inactivated; LV, lentiviral vector derived from human immunodeficiency virus (HIV). Column 2: profile of integration sites in hematopoietic cells, TSS, transcription start site of genes in which integration occurs (approximately 60% of all integrations); kb, distance in kb from the TSS of genes (approximative, as coding regions are of variable length).

SCID X1 свойство дефицита субъединицы γc цитокинового рецептора необходимо для индукции T клеток и дифференцировки клеток natural killer (NK) с помощью интерлейкина IL7 и IL15, соотв. кДНК, кодирующая γc, была замещена на γRV, экспрессирующий амфотропную оболочку и способный инфицировать человеческие (и мышиные) клетки [19]. In vitro, этого типа вектор эффективно исправлял дефицит экспрессии γc восстанавливал дифференцировку NK и T клеток. In vivo, он был также надежен и эффективен в коррекции SCID фенотипа γc(-) мышей [20-22]. Были привлечены пациенты, лишенные HLA-совместимого донора и не подвергавшиеся myeloablative кондиционированию. Первое испытание было начато в 1999 и 10 пациентов были привлечены до 2002 [23]. За этим последовало вскоре второе, сходное испытание в Лондоне, с использованием слегка отличающегося вектора, который экспрессировал оболочку вируса лейкемии обезьян гиббонов. И ещё 10 были подвергнуты лечению с 2002 [24]. Эта простая стратегия оказалась эффективной; у 19 из 20 пациентов, появлялись Т клетки и обеспечивали эффективный иммунитет. У пациентов, получавших более чем 3 х 106⁶ γCD34+ клеток на килограмм веса тела, T клетки развивались в течение 3-6 мес. и достигали нормального уровня в крови. Эти T клетки оказались удовлетворительными [в терминах состава, поликлональности, присутствия нативных T клеток, пролиферации, секреции цитокинов [19, 23, 24]] , так что клинический эффект оказался четко очерченным. Пациенты были способны жить нормальной жизнью и имели копии инфекционных агентов, которые во всех отношениях летальны при SCID (такие как VZV или вирус Epstein-Barr). Восстановление пула Т клеток было устойчивым, при этом продолжалось обнаружение новых тимусных эмигрантов. Эта находка показывала, что T клетки продуцируются постоянно. В настоящее время, в среднем в этих двух когортах пациентов прошло 13 лет, при этом верхний лимит составляет 15.9 лет. Примечательно, что дефицит NK клеток не был скорректирован в той же самой степени. SCID X1 характеризуется нормальным развитием B клеток. В отсутствие myeloablation (т.e. в отсутствии достоверной коррекции стволовых клеток), очень немногие трансдуцированные В клетки могут быть обнаружены. Несмотря на это, 11 из 18 пациентов не нуждались более в замещении иммуноглобулинов. Прежде всего для усиления техники безопасности (see below), разработан ряд инструментов для отслеживания сайтов RV интеграции в геноме хозяина. C помощью линейной амплификации, обусловленной полимеразной цепной реакцией (PCR) с высокопроизводительным секвенирование ДНК, стало возможно идентифицировать места интеграции (разнообразие и относительное обилие) в данной популяции клеток с высокой чувствительностью [25, 26]. Эти исследования показали, что имеется приблизительно 1000 уникальных мест интеграции у пациентов в поликлональных Т клетках крови в среднем (диапазон: 300-4000). Эти результаты (i) показали, что небольшое количество клеток предшественников может продуцировать весь разнообразный репертуар с нормального размера пулом Т клеток, (ii) и подтвердили инициальную концепцию, на которой базируется генотерапия. Более того, установлено, что вскоре после воздействия, немногие общераспространенные сайты интеграции были найдены в T клетках, B клетках и нейторофилах - показывая тем самым, что все они позднее возникают из мультипотентных клеток предшественников. Достаточно интересно, что этого не случалось в более поздние моменты времени (когда обнаруживались только трансдуцированные T клетки). Эти наблюдения привели к след. заключению: хотя очень немногие гематопоэтические стволовые клетки были трансдуцированы с использованием этой процедуры, T клетки всё ещё могут продуцироваться уже боле 10 лет. Следовательно, сохраняются трансдуцированные, само-обновляющиеся клетки предшественники Т клеток.

Испытания SCID X1 были отмечены появлением генотоксических побочных событий (T клеточная лейкемия у 5 из 19 пациентов) 2.5-5.5 лет спустя после генотерапии. Наблюдались клональная пролиферация клеток или T клеточных предшественников (n= 4) и (в одном случае) клона зрелых Т клеток, часто с внезапным началом [27, 28]. Вскоре было установлено. что эти T клеточные клоны имеют активированный онкоген в локусе, в который интегрирован γRV провирус. В 4-х случаях участвовал онкоген LMO2 [онкоген, известный своей ассоциацией с редкой формой первичной T клеточной acute lymphoblastic leukemia (ALL) [29]]. Вторичные геномные альтерации были обнаружены во всех случаях и вероятно объясняются появлением неприкрытой лейкемии. Такая высокая частота трансактивации трансгена (обусловленная интегрированным вирусным LTR) не ожидалась. Действительно, в то время, когда были начаты испытания, геном человека не был полностью секвенирован и правила, управляющие интеграцией γRV, были плохо известны. С тех пор было установлено, что γRVs интегрируется 'полу-случайно' с предпочтением активных генов, при этом наблюдается равное распределение между промоторным регионом и транскрибируемым регионом [27, 28, 30, 31]. Возникновение лейкемии не ограничило генотерапию SCID X1 (see below), и поскольку это событие было понято в конечном итоге как прямое последствие характеристик первого поколения векторов γRV. $ из 5 пациентов были вылечены от лейкемии с помощью химиотерапии и с тех пор в полной ремиссии (спустя 7-10 лет после этого). Удивительно, что ген-модифицированные гематопоэтические клетки предшественники всё ещё генерируют Т клетки и эффективный иммунитет у этих пациентов.

ADA deficiency

Дефицит ADA вызывает преждевременный апоптоз незрелых лимфоцитов и поэтому приводит к SCID фенотипу. Это также является более генерализованной метаболической болезнью, которая затрагивает и др. ткани (включая эпителиальные клетки в тимусе). Аллогенные HSCT могут оказывать лечебный эффект, но исход от HLA-non-identical HSCT особенно плох в этом отношении [32]. Enzyme replacement therapy (ERT) является др. подходом к лечению, заслуживающим рассмотрения, поскольку он улучшает тяжелый иммунодефицит. Было бы логично рассмотреть ADA в качестве мишени для генотерапии в свете успешности ревертантных мутаций [12]. Первые попытки генотерапии в начале 1990s, нацеленные на T лимфоциты от пациентов с ERT. Несмотря на неполный перенос генов, было показано, что трансдуцированные CD8 T клетки могут благополучно персистировать более 10 лет [33]. Ранние попытки генотерапии, нацеленной на CD34 клетки предшественники оказались безуспешными из-за низкой величины трансдукции и пациентов продолжали держать на ERT [34].

Успехи в продукции γRV вектора и создании условий для клеточной трансдукции (see above) и временного отказа от ERT сделало возможной коррекцию иммунодефицита, ассоциированного с дефицитом ADA [35]. Разумно предположить, что низкие дозы myeloablation будут вносить вклад в лучшее приживление трансплантата из трансдуцированных стволовых клеток. Этот подход оказывается эффективным [24, 35-37], поскольку у 31 из 42 пациентов ERT было прекращено из-за отсутствия тяжелых инфекций. Коррекция иммунодефицита T и B клеток оказывается устойчивой, со средней продолжительностью в 8 лет (и максимумом в 14.5) к моменту написания статьи. Примечательно, что несмотря на достижение удовлетворительной метаболической коррекции, качество восстановления T клеток не столь высокое по сравнению с наблюдением лечения SCID X1. Эти данные подтверждают, что дополнительные факторы вносят вклад в последствия дефицита ADA - возможно на дефицит ADA в тимусных эпителиальных клетках. Удивительное отличие в испытаниях между дефицитом ADA и SCID X1 (все они базировались на одинаковой первой генерации γRV векторов) было отсутствие генотоксических событий в первом из испытаний. В целом паттерн сайтов интеграции γRV был сходен и часто сайты интеграции располагались внутри онкогенов, таких как LMO-2 в частности, были теми же самыми в двух группах испытаний [38]. Имеются два возможных объяснения этого расхождения в SAEs. Во-перых, использование myeloablation в ADA испытаниях может сделать возможным постоянный приток клеток предшественников к тимусу и тем самым предупреждать от локального лейкемогенеза [как полагают Martins et al [39]]. Однако, это объяснение не согласуется с возникновением лейкемии у пациентов с WAS, которые получали γRV-обеспечиваемые модифицированные CD34 клетки после myeloablation [40] . Во-вторых, дефицит ADA сам по себе может создавать неблагоприятную среду для лейкомогенеза - вообще-то за счет ограничения клеточной пролиферации на критических стадиях тимопоэза.

Wiskott-Aldrich syndrome

WAS является Х-сцепленным иммунодефицитом, который вызывает прогрессивное изнашивание T и B лимфоцитов, вместе со многими функциональными дефектами лимфоцитов и антиген-презентирующих клеток [41]. Синдром возникает в результате мутаций в гене, кодирующем WAS протеин (WASp), который участвует в регуляции F актинового цитоскелета в клонах гематопоэтических клеток. Дефицит WASp вызывает также microthrombocytopenia из-а аномальной фрагментации тромбоцитов [41]. Клинические последствия WAS могут быть очень тяжелыми и угрожающими жизни: сюда входят повторяющиеся бактериальные и вирусные инфекции, аллергия, аутоиммунитет (васкулиты) и в некоторых случаях лимфомы. Аллогенные HSCT являются излечивающими воздействиями. В испытании, предпринятом между 2006 и 2009, γRV-обеспечиваемый перенос гена WASp в CD34 клетки был предпринят у 10 пациентов с WAS после пониженной интенсивности myeloablation [40-42]. Хотя процедура и корректировала иммунодефицит и снижала тромбоцитопению у 9 из 10 пациентов, она сопровождалась крупными генотоксическими осложнениями. Между 14 мес. и 5 годами после генотерапии, 7 из 9 пациентов обнаруживали ALL (n = 6, all LMO-2 related) и/или acute myeloblastic leukemia (AML) как следствие онкогенной трансактивации с помощью вирусных LTR [40]. Несмотря на химиотерапию и вторичные аллогенные HSCT, два пациента погибли от лейкемии. Эти трагические результаты подтвердили, что первой генерации γRV вектора связаны с высоким риском индукции лейкемии в результате трансактивации in situ лимфобластных и миелобластных онкогенов.

Chronic granulomatous disease (CGD)

CGD возникает из-за дефицита NADPH оксидазного комплекса, который транспортирует электроны в фаголизосомы фагоцитов. С помощью реакции с кислородом эти электроны генерируют высоко reactive oxygen species (ROS), которые помогают убивать фагоцитированные бактерии и грибы. Наиболее заметная (X-сцепленная) форма CGD вызывается мутациями в гене, кодирующем gp91phox элемент NADPH оксидазы. Риск бактериальных и грибковых инфекций и болезней хронического воспаления чрезвычайно высок и может приводить к смерти во всех возрастах [43]. Аллогенные HSCT с подобранными семьями, 10 из 10 или 9 из 10 донорских трансплантатов от не родственников оказались лечебными [5, 9].

Основанные на γRV вектора были приготовлены для переноса гена gp91phox в клетки CD34 от пациентов с X-сцепленной CGD. Умеренная myeloablation была использована чтобы обеспечить персистенцию трансдуцированных стволовых клеток в гематопоэтических нишах. Несмотря на тот факт, что трансдуцированные клетки не обнаруживают преимуществе в избирательном росте после экспрессии gp91phox, большая фракция gp91phox-экспрессирующих нейтрофилов и моноцитов обнаруживается у двух подвергнутых воздействию молодых людей [44, 45]. Оказалось, что преимущественно случайный рост, в самом деле, придается трансдуцированным миелоидным клеткам благодаря аберрантной экспрессии онкогенов (т.e. EVI1 и PRDM1) как следствие γRV-индуцированной трансактивации. Заслуживает внимания, что мощный LTR элемент, управляемый из формируемых вирусом фокусов в селезенке, был использован для управления экспрессией gp91phox. Gp91phox экспрессия затем терялась за счет тушения трансгена, это сопровождалось появлением myelodysplastic syndrome (MDS), который оказался фатальным у одного пациента. Два др. пациента (получавшие лечение в более юном возрасте) имели сходный исход и нуждались в аллогенных HSCT для лечения MDS. Итак, 16 из 32 пациентов с SCID X1, WAS или CGD, подвергнутых воздействию первого поколения γRV обнаруживали или лимфобластную или миелобластную лейкемию, это представляет неприемлемый риск (Fig.2).

Figure 2. Leukemia-free survival after gene therapy. Only patients with successful gene therapy are included; adenosine deaminase (ADA) deficiency trials were excluded, because no serious adverse events (SAEs) have occurred to date in that particular setting (see text).

Gene therapy based on second-generation, 'self-inactivating' (SIN) RV vectors

В качестве альтернативы вирусной 3'LTR энхансерной последовательности, промоторная последовательность может быть добавлена для управления экспрессией трансгена, при этом энхансер вирусного 3'LTR делетирован. Такого типа конструкция впервые была создана для human immunodeficiency virus (HIV)-происходящих lentiviral (LV) векторов [46] и затем для γRV векторов [47] (Fig. 1). При in vitro подходе такие SIN вектора, как было установлено, очень значительно снижают трансактивацию гена, а , следовательно, независимость клонального роста клеток гематопоэтических предшественников [46-48]. В экспериментах in vivo на мышиных моделях показано, что SIN вектора трансдуцируют клетки гематопоэтических предшественников и кажутся надежными [49, 50]. Однако, следует принимать во внимание, что базирующаяся на первом поколении γRV трансдукция не вызывала у мышей лейкемии). Поэтому мы всё ещё лишены реальной животной модели для надежного тестирования. Несмотря на это ограничение, SIN вектора были допущены для клинического применения. Недавно первое сообщение о multicenter клиническом испытании SCID X1 предоставило довольно интересный предварительный результат. HSC от 9 пациентов с SCID X1 были трансдуцированы SIN γRV, в котором использован EF1α (короткая форма) промотор, чтобы управлять экспрессией γc. Процедура оказалась эффективной у 8 пациентов и приводила к устойчивому восстановлению T клеток у 7 из них (спустя 48 мес.). Паттерн восстановления T клеток сходен с таковым, наблюдаемым в испытаниях с вектором первого поколения [51]. Важно, что анализ паттерна интеграции RV [15] в T клетках пока не выявил клонального доминирования и низкой частоты интеграции в онкогены, ведущей к лейкемии в испытаниях с первым поколением вектора [51]. Эта находка подтверждает, что использование этого специфического SIN γRV не приводит к клональной селекции клеток, хотя характеристики интеграции остались неизменными. Соотв., случаев лейкемии не наблюдалось у этих пациентов и на сегодня средняя продолжительность испытания (36 months) соответствует времени, когда 4 случая лейкемии возникли при испытании SCID X1 с γRV первого поколения. Эти обнадеживающие результаты д. быть подтверждены после более длительного периода и воспроизведены на др. леченых пациентах.

Тем временем были созданы SIN LV вектора для коррекции др. PIDs с более эффективной трансдукцией HSCs. В самом деле, LV вектора могут трансдуцировать неделящиеся клетки, при условии, что последние находятся в G1 стадии клеточного цикла [52]. Первое клиническое использование в области PID касалось WAS. Naldini et al. создали LV, в котором WASp кДНК находилась под контролем эндогенного промотора. Этот вектор эффективно управлял экспрессией WASp в экспериментах in vitro и на мышиных моделях дефицита WASp [53, 54]. Др. вектор использовал вирусный энхансер из вирусной myeloproliferative саркомы, при этом был также использован происходящий из negative control region deleted (MND) промотор для дальнейшего усиления экспрессии WASp [55]. При использовании упомянутого выше SIN LV вектора, отмечается полная коррекция иммунодефицита и частичная коррекция тромбоцитопении Aiuti et al. в первоначальной серии из 3-х пациентов [56], чем у дополнительных пациентов. Некоторая myeloablation (busulfan) была проведена у этих пациентов перед повторной инъекцией трансдуцированных клеток, в порядке очистки гематопоэтических ниш. Имеются убедительны in vivo доказательства мультиклональной трансдукции, указывающие, что была трансдуцирована высокая пропорция HSCs. Эта находка подтверждается сходным профилем insertion site (IS) в различающихся миелоидном и лимфоидном клонах клеток [55].

Количество копий векторов (VCNs), достигаемое в лимфоидных клетках, и высокие количества WASp⁺ лимфоцитов и тромбоцитов (относительно нейтрофилов и моноцитов) подтверждает, что экспрессия WASp обеспечивает селективные преимущества лимфоцитам и поддерживает жизнеспособность тромбоцитов. У таких пациентов отсутствуют указания на IS селекцию клонов клеток и на повышенную частоту инсерции в онкогены [40]. Соотв. отсутствует leukemogenicity после 4.8 лет завершения испытаний (в среднем: 3.5 года). В целом был достигнут клинический успех - даже у пациентов с тяжелыми формами WAS. Конечно же, необходимо подвергнуть такому протоколу большее число пациентов.

Недавно начато клиническое испытание генотерапии дефицита ADA с LV ADA-вектором в Лондоне и Лос-Анжелесе. Предварительные результаты в группе из 16 пациентов подтвердили надежность и эффективность процедуры сходна с таковой, наблюдаемой в предыдущих испытаниях [56, 57]. Примечательно, что между тем LV вектора были использованы клинически, чтобы модифицировать HSCs от пациентов с др. наследственными нарушениями, включая adrenoleukodystrophy [58], metachromatic leukodystrophy [52] и β thalassemia [59]. И здесь подход выглядит надежным у пациентов с устойчивой детекцией трансдуцированных клеток крови спустя 7 лет после начала; отсутствуют leukemic события и нет указаний на избирательность клонов, ассоциированных с активируемыми онкогенами как это наблюдалось в испытаниях с γRV векторами первой генерации [60]. Если принять во внимание общее количество пациентов 31 с более, чем 1 год продолжительностью после начала (в среднем: 3 года) после успешной генотерапии клеток гематопоэтических предшественников, базирующейся на SIN векторах, не встретилось ни одного случая лейкемии. Это контрастирует с широкой распространенность (50%), наблюдаемой у пациентов, леченных с помощью γRV вектора (n = 32) первого поколения (Fig. 2). Это различие высоко достоверно и показывает, что SIN вектора более надежны, чем γRV вектор.

Future plans

На базе описанных выше успехов разрабатываются планы создания инструментов для лечения угрожающих жизни PIDs (Table 1), особенно для двух типов SCID, а именно RAG-1 и Artemis дефицита (61) (62) (63). При дефиците RAG-1 и Artemis SIN LV вектора были разработаны и активно тестировались на подходящих мышиных моделях. Клинический протокол д. включать пониженной интенсивности myeloablation, чтобы способствовать имплантации трансдуцированных HSCs.

Table 1. PID diseases and gene therapy

         First-generation γRV vectors       |       Second-generation SIN vectors
                      Effective                 Effective                                         Planned

SCID X1               +a                       +
ADA deficiency  +                         +
WAS                     +b                       +
SCID Rag-1                                                                                                  +
SCID Artemis                                                                                              +
X-linked chronic
granulomatous
disease                +b                                                                                    +
Leukocyte adhesion deficiency                                                             +
HLH perforin deficiency                                                                          +c

HLH Munc13-4 deficiency                                                                      +c

XLP1                                                                                                             +c

IPEX (FoxP3 deficiency)                                                                          +c  


1.        ADA, adenosine deaminase; HLH, hemophagocytic lymphohistiocytosis;
IPEX, immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy,
X-linked syndrome; PID, primary immunodeficiencies; SAEs, serious adverse events;
SCID, severe combined immunodeficiencies; SIN, self-inactivating;
WAS, Wiskott-Aldrich syndrome.
2.        a Associated with high frequency of SAEs (5 out of 19).
3.        b Associated with very high frequency of SAEs (seven out of nine
 for WAS, and four out of four for CGD).
4.        c CD34 and T cell strategy are both envisaged.

Генотерапия нарушений клеточного фагоцитоза (sтаких как CGD) нуждается в высоко эффективных процессах коррекции с помощью HSC, поскольку наиболее подходящие клетки мишени (нейтрофилы) замещаются каждые 48 ч. Терапия нарушений фагоцитарных клеток является сильно затрудненной; существует абсолютная потребность в комбинации надежности и эффективности при полном отсутствии избирательных предпочтений для экспрессии трансгена. Несколько групп разработали SIN LV вектора, содержащие сильные специфичные для миелоидных клеток промоторы, которые управляют экспрессией gp91phox [64, 65]. В одном случае промотор состоял из слитого cathepsin G и c-Fes промоторов и поэтому включал сайты связывания для транскрипционных факторов, участвующих в дифференцировке моноцитов и нейтрофилов [64]. Вектор оказался высоко эффективным в трансдукции HSCs и индукции строгой экспрессии gp91phox в миелоидных клетках, как показали эксперименты in vitro [64] и на мышиных моделях [66]. Chiriaco et al. [65] разработали слегка отличающуюся стратегию, согласно которой др. миелоид-специфичный промотор внедрен в LV вектор; минимальная промоторная последовательность из локуса gp91phox была слита с SD146 синтетическим энхансером/промотором, а экспрессия gp91phox была еще сильнее ограничена миелоидными клетками благодаря добавлению последовательности microRNA мишени [67]. Клинические испытания с использованием этих векторов проводятся в ряде центров. Полностью myeloablative или submyeloablative химиотерапия была включена в качестве ключевой ступени для управления гематопоэзом с помощью трансдуцированных HSCs. Сходный подход планируется в контексте leukocyte adhesion deficiency (LAD), вызываемого дефицитом β2 интегрина [68]. Заслуживает внимания, что γRV вектора (которые случайно интегрируются в геном) протестированы преклинически с успехом по этим показаниям [69].

HLH состоит из группы летальных состояний, вызываемых неприкрытым T-cell- и макрофагами-управляемыми воспалениями в результате дефицита цитотоксичности лимфоцитов [70]. Были предприняты усилия разработать базирующиеся на LV вектора для управления экспрессией генов, кодирующих perforin [71] или Munc13-4, в трансдуцированных HSCs или зрелых T лимфоцитах. Последняя стратегия, как известно, надежная и должна предоставлять пациентам субнабор функциональных цитотоксичных T лимфоцитов, эффективных в контроле HLH. Сходная стратегия (но доставляющая HSCs) уже подтвердила свою эффективность на животных моделях дефицита X lymphoproliferative disorder 1/SLAM-associated protein (SAP) - др. состояния, которое приводит к летальному HLH (помимо прочих проявлений) [72]. LV вектор, экспрессирующий SAP вектор под контролем EF1α промотора был разработан соотв. [73].

Immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked (IPEX) синдром является особенно заманчивым состоянием. Он вызывается мутациями в гене, кодирующем FOXP3, транскрипционный фактор, который абсолютно необходим для дифференцировки и поддержания регуляторных T клеток [74]. Если регуляторные T клетки отсутствуют или нефункциональны, то пациенты страдают от тяжелого энтерита с ранним началом, аллергией к пище и различными аутоиммунными проявлениями (включая диабет), которые угрожают жизни. Хотя HSCT могут спасать жизнь при IPEX [75], генотерапия с трансформацией периферических T клеток в регуляторные T клетки или принуждение HSCs развиваться в регуляторные Т клетки могли бы обеспечить прогресс в лечении пациентов, не имеющих подходящего аллогенного донора. Важной первой ступенью в направлении клинического применения д. быть превращение (in vitro) эффекторных FoxP3-мутантных CD4 T клеток в экспрессирующие FoxP3 регуляторные T клетки за счет использования LV вектора, содержащего FoxP3 кДНК под контролем EF1α промотора [76]. Эти клетки, д. сохранять свою регуляторную активность после переноса иммунодефицитным мышам.

Использование генотерапии при B клеточных PIDs также рассматривается. X-linked agammaglobulinemia (XLA) является прототипом B клеточной PID, поскольку она состоит из выраженного блока развития В лимфоцитов, вызываемого дефицитом Bruton's tyrosine kinase (BTK) . γRV и LV вектора, несущие BTK кДНК успешно были использованы на мышиных моделях дефицита BTK [77]. Принимая во внимание надежды на долгую жизнь большинства пациентов с XLA, необходима полная надежность. Др. стратегия базируется на коррекции мутаций сплайс-сайтов в BTK за счет использования корректирующих сплайсинг олигонуклеотидов, нацеленных на мутантные транскрипты BTK [78].

How can we improve gene therapy for PIDs?

Определенный ряд подходов предусматривает дальнейшее увеличение осуществимости, эффективности и надежности генотерапии, нацеленной на HSCs.

Во-первых, увеличение продукции клинических наборов векторов имеет первостепенное значение для осуществимости и последующего маркетинга одобренных продуктов. Вплоть до недавнего времени, наборы LV готовились для временной трансфекции клеточных линий с помощью адекватных конструкций. Такая процедура (i) является громоздкой, (ii) дает относительно небольшие наборы (несмотря на существенные успехи) и (iii) требует, чтобы каждый новый набор проверялся на надежность. Недавняя разработка клеточных линий, которые могут стабильно продуцировать LV вектора (используемые для SCID X1) может решить эту важную проблему [79].

Дальнейшие улучшения эффективности трансдукции HSC позволят лечить болезни, для которых ведутся поиски трансдукции с высокой эффективностью стволовых клеток. Ряд интересных новых путей описан недавно. Новая вирусная оболочка (тe. гликопротеин оболочки RV бабуина) используется для pseudotype LV векторов. Эти вектора, как было установлено, эффективно трансдуцируют человеческие CD34 клетки (т.e. вплоть до 90%). Было также показано, что до 30% пассивных CD34 клеток было трансдуцировано. Последние могут дифференцироваться в миелоидные и лимфоидные клоны после переноса NOD/SCID/γc(-) мышам [80]. Др. потенциальным источником прогресса является добавление mTOR ингибитора во время ex vivo фазы трансдукции. Это лекарство усиливает HSC трансдукцию - по-видимому, увеличивая высвобождение частиц вектора в цитоплазму обрабатываемых клеток [81]. Др. молекулы могут обладать ценностью в поддержании или увеличении пула покоящихся HSCs и тем самым достигать очень долговременной эффективности. В этом отношении, prostaglandin E2 [82], SR1 (an aryl hydrocarbon receptor antagonist) [83] и, прежде всего, pyrimidoindole [84], как было установлено, способствуют амплификации этих клеток.

Альтернативно, HSCs могут вобще-то генерироваться ex vivo за счет репрограммирования клеток взрослых. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) дифференцируются, прежде всего, в эмбрионального типа, кровяные клетки, ограниченного клинического интереса, поскольку последние не внедряются в костный мозг [85]. Разработаны альтернативные стратегии, чтобы репрограммировать клетки взрослых в HSCs. Посредством воздействия 6 транскрипционных факторов зрелые лейкоциты мыши трансформируются в индуцированные HSCs, способные к формированию всех клонов кровяных клеток [86]. Др. группа исследователей использовала эндотелиальные клетки пупочной вены, для которых репрограммирование путем воздействия на них 4 транскрипционных факторов может приводить к образованию bona fide HSC [87]. Эти подходы предоставляют важную ступень в направлении продукции a la carte HSCs. Такой инструмент д. быть потенциально пригодным для разработки 'неограниченной' HSC генотерапии, при условии, что продукты клеток надежны. Для этого необходимы обширные дальнейшие преклинические исследования [88].

Надежность всегда является приоритетом. Как обсуждалось выше, SIN вектора помогают предупредить генотоксичность. Добавление элементов локус контролирующего региона или microRNA мишеней для экспрессии в интересующих клетках может быть эффективной мерой для предупреждения эктопической экспрессии, как показано соотв. при клинических испытаниях при β thalassemia [59] или в преклинических исследованиях [67].

В конечном счет, редактирование генов д. стать наиболее привлекательным способом генной терапии. Редактирование мутаций является идеальным результатом, поскольку модифицированный ген остается в своей физиологически регулируемой, нормальной среде [89]. Этот процесс нуждается в нуклеазе (для расщепления ДНК вблизи мутации) и в матрице (соответствующей не мутантной последовательности варьирующей длины). Как только дНК расщеплена, аппарат гомологичной рекомбинации может вставить не мутантную последовательность in situ и тем самым восстановить функцию гена. Та же самая стратегия может быть использована для инсерции полной длины кДНК в 'надежное место' в геноме [т.e. в сайт, удаленный от каких-либо генов или энхансеров [90]]. Значительные успехи в этом отношении достигнуты путем создания ряда сайт-специфических нуклеаз. Наиболее широко используемые, кстати, базируются на элементах цинковых пальчиков, сцепленных с Fok1 нуклеазой. Модификация повторяющихся последовательностей цинковых пальчиков может гарантировать специфичность относительно интересующего сайта ДНК [91]. Такого типа нуклеаза была недавно использована для инсерции гена IL2RG (который мутантен при SCID X1, см. выше) в надежное место или чтобы вставить часть гена локуса IL2RG; это привело к экспрессии γc гематопоэтическими клетками миелоидного и лимфоидного клонов [92]. Нуклеаза может быть помещена в не интегративный (дефицитный по integrase) LV вектор или обустроена как РНК. Это довольно многообещающий и элегантный подход. Однако, два главных вопроса д. быть решены прежде, чем редактировать ген, пригодный для клинических испытаний. Гомологичная рекомбинация нуждается в том, чтобы клетки были делящимися, что отсутствует в большинстве HSCs. Низкие уровни эффективности редактирования (т.e. низкий процент) могут быть достаточны для коррекции SCID болезней, поскольку строгими селективными преимуществами наделяются корректируемые клетки. Однако, этого не было достигнуто в случае др. PIDs. Возникает вопрос, могут ли покоящиеся HSCs принуждены временно пролиферировать без потери значительной части своей 'стволовости'. Альтернативно, пролиферирующие искусственно созданные HSCs [86, 87] могут быть использованы в качестве мишени. Второй основной вопрос связан с надежностью, поскольку сконструированные нуклезы могут обладать вредными побочными эффектами. Хотя исследования по редактированию генов в клеточных линиях предоставляют надежные результаты, частота и паттерн off-target изменений, генерируемых с помощью негомологичной репарации соединений концов, вызываемых рассечением с помощью нуклеаз, ещё предстоит определить. Дальнейший прогресс в разработке сконструированных нуклеаз будет связан с подобными транскрипционному активатору эффекторными нуклеазами [93] и более всего с легко customable, происходящей из бактерий CRISPR-Cas9 системой [94], при которой нуклеазы точно будут направляться с помощью РНК, комплементарной интересующим последовательностям ДНК.

Conclusion

Over the last 20 years, gene therapy has become a reality in the field of PIDs. A flurry of technical advances have improve feasibility, safety and efficacy and thus now form the basis for extending the indications for gene therapy to dozens of life-threatening PIDs and developing models of other inherited and acquired disorders of the hematopoietic system. However, rigorous evaluation of every single genetic disorder of the immune system and careful long-term monitoring of treated patients including event-free survival and potential short and long term toxicities are prerequisites for continued progress in this field.

Gene therapy for primary immunodeficiencies A. Fischer S., Hacein-Bey Abina, F. Touzot,M. Cavazzana Clin.Gen. Volume 88, Issue 6 December 2015 Pages 507–515 .

Gene therapy for primary immunodeficiencies
A. Fischer S., Hacein-Bey Abina, F. Touzot,M. Cavazzana
Clin.Gen. Volume 88, Issue 6 December 2015 Pages 507–515 .