Скелетные мышцы являются самым крупным органом в теле человека, представляя приблизительно 50% от общего веса тела. Поддержание мышечной массы и физиологии является существенным для здоровья. Неупотребление (напр., при неподвижности, денервации или низкой гравитации), наследственные нейромышечные нарушения и старение, всё это приводит к подтачивающей здоровье потере скелетных мышц (Saini et al, 2009). Потеря скелетной мышечной массы не только увеличивает болезненность и смертность, но и также увеличивает показатель патологических переломов, функционального изнашивания и помещение в специальные учреждения (Degens & Alway, 2006). Несмотря на десятилетия исследований нет лечения для предупреждения потери мышечной массы при наследственных и/или приобретенных формах нейромышечных болезней.

Сохранение мышечной массы возникает в результате поддержания гомеостатического баланса синтеза и деградации белков. Понимание механизмов, лежащих в основе сохранения ткани скелетных мышц, является критическим для разработки терапевтических стратегий для борьбы с потерей мышечной массы. Данное исследование использует новаторский подход для решения этого вопроса на модельном организме, который имеет прирожденные защитные механизмы против потери мышц: находящиеся в зимней спячке грызуны. Мы проанализировали 13-lined сусликов (Ictidomys tridecemlineatus), естественно возникших, впадающих в зимнюю спячку животных (Vaughan et al, 2006). Эти грызуны проводят приблизительно полгода в спячке. Брахикардия, гипотермия, эпизодическое дыхание, отсутствие приема пищи и воды, неподвижность характеризуют состояние безразличия. Поскольку молекулярные механизмы детерминации находящихся в спячке, характеризующиеся заметной устойчивостью (resilience) против аторофии пока не выяснены, было предположено, что изменения в передаче сигналов target of rapamycin (mTOR) у млекопитающих, а также эпигенетически обеспечиваемые пути играют важную роль (Lee et al, 2010; Morin & Storey, 2009; Nowell et al, 2011; Shavlakadze & Grounds, 2006).

У не впадающих в спячку млекопитающих современная парадигма предполагает, что сила, рост и жизнеспособность мышечных клеток зависят от пути PI3K/Akt/mTOR, который активируется в ответ на некоторые ростовые факторы, включая insulin-growth factor-I (IGF-1; Glass, 2003). Соединение IGF-1 со своим рецептором запускает активацию phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) и транслокацию serine/threonine kinase Akt (также наз. Akt1 и PKB для protein kinase B) в мембрану. Этот процесс облегчает фосфорилирование и активацию Akt по serine-478 (S478) с помощью 3-phosphoinositide-dependent kinase 1 (PDK-1). Akt является жизненно важным медиатором нескольких процессов, участвующих в гомеостазе и жизнеспособности скелетных мышц. Непосредственные и косвенные мишени, стоящие ниже Akt, включают mTOR, p70S6K и эукариотический фактор инициации трансляции 4E binding protein 1 (4E-BP1)-ключевые регуляторные белки, участвующие в трансляции и синтезе белков (Glass, 2003; Saini et al, 2009). Кроме того, Akt инактивирует Foxo3a с помощью фосфорилирования по serine-253 (S253) и threonine-32 (T32; Brunet et al, 2001). Инактивация Foxo3a ведет к пониженной экспрессии генов мишеней, обусловливающих атрофию скелетных мышц, atrogin-1 и MuRF1 и к аутофагии (напр. LC3B, beclin, ATG7; Mammucari et al, 2007; Zhao et al, 2007). Некоторые исследования на млекопитающих показали, что этот путь изменен в скелетных мышцах в условиях их неиспользования и голодания (Glass, 2010).

Serum- and glucocorticoid-induced kinase 1 (SGK1) принадлежит к семейству serine/threonine киназ, которые обнаруживают 45-55% сходство с Akt, cAMP-dependent protein kinase, p70S6K и protein kinase C в отношении их каталитических доменов (Webster et al, 1993). Akt прежде всего фосфорилирует Foxo3a по serine-253, тогда как SGK1 обнаруживает более высокое сродство к serine-315, и как Akt, так и SGK1 фосфорилируют threonine-32 с одинаковым сродством (Brunet et al, 2001). В данном исследовании мы показали, что SGK1 выполняет ранее неизвестную роль в обеспечении гомеостаза скелетных мышц и функционирует у впадающих и не впадающих в спячку млекопитающих. SGK1 обеспечивает защиту при ингибировании Foxo3a-индуцированной атрофии и аутофагии и при активации передачи сигналов mTOR. Мы полагаем, что терапевтические модуляции SGK1 могут быть благоприятными в условиях, связанных с атрофией или дегенерацией мышц.

Используя мышцы животных в спячке в качестве инструмента для понимания гомеостаза скелетных мышц, мы продемонстрировали, что Foxo3a-обусловленное ингибирование мышечной атрофии/ аутофагии, активация каскада передачи сигналов mTOR и жизнеспособность мышечных клеток регулируются независимо от активации Akt. Вместо этого, анализ мышц сусликов в спячке позволил нам идентифицировать serum/glucocorticoid-induced kinase 1 (SGK1) в качестве нового и центрального фактора, обеспечивающего сохранение скелетных мышц во время спячки. Информация, полученная в нашей модели, может быть обобщена,т.к. мы оказались способны установить, что SGK1 играет критическую роль в функции мышц после спячки. Мы продемонстрировали, что мышцы, лишенные sgk1обнаруживают атрофию скелетных мышц, связанную со снижением силы мышц in vivo и in vitro. Более того, мы показали, что избыточная экспрессия постоянно активной SGK1 защищает от атрофии неиспользуемых мышц и от вызванной голоданием мышечной атрофии.

DISCUSSION

Поддержание гомеостатического баланса между синтезом и деградацией белка защищает от потери массы, пластичности и функции скелетных мышц. Мы продемонстрировали, что повышенная экспрессия SGK1, ведет к ингибированию активности Foxo3a сопровождается повышенной экспрессией каскада передачи сигналов mTOR, сохраняя массу скелетных мышц во время продолжительной неподвижности и голодания во время спячки. Более того, функциональный и молекулярный анализ SGK1 у некоторых не впадающих в спячку животных моделей идентифицировал SGK1 в качестве нового медиатора гомеостаза и функции скелетных мышц.

Существующая парадигма подчеркивает роль Akt в IGF-1/PI3K путии его нижестоящих мишеней, Foxo3a и mTOR, таким образом регулируя размер и функцию клеток скелетных мышц (Glass, 2003). Анализ естественно возникшего чрезвычайного физиологического состояния спячки показал, что фосфорилирование Foxo3a по serine-253, -315 и T32 ассоциирует с повышенным фосфорилированием mTOR мишеней, p70S6K и 4E-BP1, независимо от активации Akt. Вместо этого спячка сусликов демонстрирует повышенную экспрессию и активацию SGK1. SGK1 возвращает к базовым уровням после спячки сусликов, указывая тем самым на то, что это увеличение необходимо для защиты от атрофии скелетных мышц во время спячки. Биохимический in vitro анализ подтверждает, что SGK1 фосфорилирует Foxo3a по serine-315 с высоким сродством, по serine-253 с более низким сродством по сравнению с Akt и по T32 с одинаковым сродством как и у Akt (Brunet et al, 2001). Более того, SGK1, как было установлено, регулирует передачу сигналов mTOR, жизнеспособность клеток и гипертрофию кардиомиоцитов in vitro (Aoyama et al, 2005). В соотв. с этими исследованиями in vitroнаш анализ in vivo показал, что в отсутствие повышенной активации Akt, SGK1 фосфорилирует Foxo3a по serine-253, serine-315 и T32 и что это обеспечивает активацию передачи сигналов mTOR и его нижестоящих мишеней в скелетных мышцах (Fig 7D).

Помимо своей защитной роли у животных в спячке SGK1 играет критическую роль в гомеостазе и функции мышц. Анализ мышей, лишенных sgk1 выяви снижение мышечной массы и размеров волокон в общем-то при нормальном структурном виде. Sgk1^-/- мыши обнаруживают пониженные уровни фосфорилирования Foxo3a по serine-315, но нормальные уровни Foxo3a в отношении serine-253. Эти находки, скорее всего, обусловлены компенсаторным повышением уровней фосфорилирования за счет Akt у sgk1^-/- мышей. Несмотря на это увеличение, мыши sgk-1^-/- обнаруживают нарушения мышечных функций, на что указывает снижение работоспособности во вращающемся колесе, а также снижение генерации специфической мышечной силы in vitro. Более того, sgk-1^-/- мыши демонстрируют удивительную преувеличенную реакцию на неиспользование и голодание. Предыдущее исследование показало, что повышенная активация Akt улучшает силу мышц и метаболизм быстрых мышечных волокон (Izumiya et al, 2008). Компенсаторное увеличение Akt у sgk-1^-/- мышей неспособно восстановить нормальную функцию и защитить от атрофии, связанной с неиспользованием и голоданием, указывая, что SGK1 может действовать посредством дополнительных , Foxo3a/mTOR независимых, механизмов, чтобы обеспечить гомеостаз скелетных мышц. Эти результаты побудили нас проанализировать экспрессию SGK1 и её нижестоящих мишеней у мышей, дефицитных по akt1. Эти мыши, подобно sgk-1^-/- мышам, имеют слегка уменьшенные размеры мышечных волокон с пониженной мышечной силой (Goncalves et al, 2010). Наш анализ выявил повышенную экспрессию SGK1 одновременно с повышенным фосфорилированием Foxo3a по serine-315. Аномалии скелетных мышц у sgk-1^-/- и akt1^-/- мышей показали, что ни Akt, ни SGK1 не могут полностью компенсировать потерю др. др., демонстрируя, что Akt и SGK1 необходимы для гарантии нормальных размеров и функции скелетных мышц. В самом деле, предварительные эксперименты в нашей лаб. показали, что нокдаун экспрессии SGK1 у взрослых мышей дикого типа, вызывает компенсаторное увеличение Akt без заметного кратковременного воздействия на морфологию и функцию скелетных мышц. Сейчас мы оценивает долговременное воздействие нокдауна SGK1 у взрослых, в постнатальных скелетных мышцах.

Поскольку SGK1, по-видимому, играет защитную роль у сурков в спячке и вызывает компенсаторную гипертрофическую реакцию у животных, не впадающих в спячку, поэтому мы анализировали трансгенных мышей с постоянно активной экспрессией sgk1 (Arteaga et al, 2007). Биохимический анализ таких мышей демонстрирует повышенное фосфорилирование Foxo3a по serine-315 , а также повышенные уровни дополнительных нижестоящих мишеней для SGK1. Профиль экспрессии в мышцах мышей с избыточной экспрессией SGK1 был удивительно сходен с нашими находками в мышцах сурков в спячке. Морфометрический анализ скелетных мышц от SGK1 трансгенных мышей не выявил достоверного увеличения размеров скелетных мышечных волокон; напротив, взрослые трансгенные мыши, избыточно экспрессирующие Akt1 во время первых 6 мес. жизни развивают достоверную гипертрофию мышечных волокон типа II (Izumiya et al, 2008; Lai et al, 2004). Эти находки могут быть связаны с незначительным увеличением SGK1 и/или увеличением аутофагии у sgk1 трансгенных мышей по сравнению с профилем экспрессии Akt у трансгенных Akt мышей. Для терапевтического потенциала важно, что трансгенные Akt мыши обнаруживают дистрофические аномалии скелетных мышей после 6 мес. (Grumati et al, 2010), этого не наблюдается у наших sgk1 трансгенных мышей, подтверждая, что легкое увеличение экспрессии SGK1 может не вмешиваться в нормальный гомеостаз скелетных мышц даже в течение продолжительного периода времени.

Sgk1 трансгенные мыши демонстрируют защиту от потери мышечной массы при систематических катаболических стрессовых ситуациях продолжительного голодания, которые вызывает значительную мышечную атрофию (Boehm et al, 2007). Эта фенотипическая выгода ассоциирует с ожидаемым увеличением фосфорилирования Foxo3a по serine-315 и T32. В противоположность контрольным животным, caSGK1 трансгенные мыши обнаруживают отсутствие увеличения экспрессии гена и/или белка медиаторов аутофагии. Эти находки особенно важны, поскольку аутофагия, как известно, вносит вклад в потерю мышечной массы во время голодания (Mammucari et al, 2007; Zhao et al, 2007). Наши результаты показывают, что ингибирование избыточной аутофагии защищает от атрофии скелетных мышц во время катаболических стрессов и подтверждают, что SGK1 может регулировать аутофагию. Однако, принимая во внимание, что трансгенные мыши обнаруживают повсеместную экспрессию sgk1, мы не можем исключить, что др. системы органов могут влиять на защиту от атрофии скелетных мышц.

Электропотрация TA мышц позволила нам оценить функцию повышения экспрессии SGK1 в постнатальных взрослых мышечных волокнах, элиминируя онтогенетические, метаболические или системные эффекты. Наши эксперименты продемонстрировали, что повышенная экспрессия постоянно активной Sgk1, но не дикого типа Sgk1, полностью защищает TA мышцы от вызываемой неподвижностью атрофии. Хотя ряд стимулов, таких как ростовые факторы и гормоны, как известно, вызывают активацию SGK1 (Lang et al, 2006), а активация SGK1 необходима для обеспечения её биологической функции (Kobayashi & Cohen, 1999).

Следовательно, наши результаты показывают, что SGK1 совместно с Akt обеспечивает мышечный гомеостаз и что активация SGK1 необходима для сохранения массы скелетных мышц в условиях стресса. Наши находки подчеркивают, что потенциал SGK1 в качестве новой терапевтической мишени, которая борется с потерей скелетных мышечных масс и действует в нейромышечных соединениях, участвующих в атрофии и гипертрофии скелетных мышц. Наконец, завершением концептуального является обещание, что молекулярный анализ естественно возникающих физиологических состояний, таких как спячка, может выявить неожиданные патогенные механизмы и рациональные стратегии лечения.