Посещений:
RNAi Терапия

siRNA
Soutschek, J. et al. Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs. Nature 432, 173–178 (2004) |  Article  |  PubMed |  ChemPort

FURTHER READING
Dorsett, Y. & Tuschl, T. siRNAs: applications in functional genomics and potential as therapeutics. Nature Rev. Drug Discov. 3, 318–329 (2004) |  Article  |  PubMed |  ISI |  ChemPort



Рис.1.  | RNAi is carried out by the introduction of small interfering RNAs (siRNAs), which target the degradation of mRNAs via an induced silencing complex, RISC. siRNAs are synthesized and transfected into cells; alternatively, they may be generated by RNAase activity on short hairpin RNAs (shRNAs) transcribed in vivo. Transfection and integration of plasmid DNA containing a selectable marker and a promoter driving shRNA transcription have been used to generate stable cell lines. The applicability of RNAi to DNA repair research has been dramatically demonstrated by Rosenquist et al. These investigators used a stable transfection approach to "knock down" expression of a DNA glycosylase, Neil1, in murine ES cells (Rosenquist et al) and, in separate experiments, demonstrated germline transmission of RNAi in mice, providing a means to rapidly assess the consequences of suppressing a gene of interest in a living animal (Carmell et al). RNAi methods offer a rapid path to the development of cell lines in which specific gene functions are selectively suppressed. Importantly, the procedure makes it feasible to simultaneously suppress several genes. The specificity and versatility of siRNA makes possible a number of potential therapeutic applications. In our laboratory, we have successfully knocked down expression of Neil 1 , a DNA glycosylase, and DNA polymerase b in murine ES cells.

We've all heard of the promise of RNA interference (RNAi) as a potential approach to treating disease, but how close are we to delivering on this promise? As described in Nature, Vornlocher and colleagues have now taken us a step closer to the goal of selectively modifying gene activity for a clinical benefit.
Vornlocher и др. продемонстрировали in vivo молчание эндогенного гена, кодирующего белок, имеющий значение для терапии, apolipoprotein B (APOB), который существенен для формирования low-density lipoprotein (LDL), а , следовательно, участвует в ряде сердечнососудистых заболеваний. Хотя RNAi продемонстрировала свои эффекты in vivo раньше, но предыдущие модели или не затрагивали эндогенные гены или использовались таким образом, что были не пригодны для терапии у людей. В данной работе молекулы small interfering RNA (siRNA), которые индуцировали RNAi генов с комплементарными последовательностями, были введены мышам с помощью инъекций в хвостовую вену, способом легко воспроизводимым у людей.
Как генная терапия и антисмысловые подходы имеют проблемы с доставкой, так и RNAi. В прошлом использовали вирусные вектора среди др. устройств по доставке, чтобы поставлять siRNA в ткань-мишень. В данном исследовании использовали химические модификации, чтобы поставлять молекулы siRNA подобно большинству лекарств и стабильно внутри тела и восприниматься клетками. Конъюгация холестерола с 3' концом siRNA молекул существенно улучшает их in vivo фармакологические свойства, такие как клеточная доставка и период полу-жизни.
Чтобы обеспечить in vivo эффект этих нацеленнных на APOB, cholesterol-модифицированных siRNAs, они инъецировались мышам, которые получали нормлаьную диету. Уровнизатронутых мРНК затем измеряли в печени и тощей кишке, ключевых местах экспрессии APOB. Модифицированные siRNA вызывали достоверное снижение мРНК APOB в обеих тканях, что проявлялось в виде снижения уровней белка APOB. Желательные эффекты обнаруживались и на физиологическом уровне тоже: воздействие siRNA вызывало 25% снижение уровней липопротеинов высокой плотности и на 40% снижение уровней LDL.
Ключевым в исследовании RNAi оказалось то, что наблюдаемые результаты м.б. вызваны в виде неспецифических 'off target' эффектов или в виде реакции interferon. Vornlocher и др. оказались способны удалить эту возможность, т.к. две APOB-специфические siRNAs, которые находят разные регионы мРНК APOB дают в результате сходные эффекты. Более того, контрольные siRNA, хотя и присутсвуют в печени и тощей кишке на уровнях, сравнимых с таковыми терапевтических siRNA, не оказывают эффектов. Авт. установили благодаря анализу продуктов деградации APOB, что механизм действия RNAi ответственен за наблюдаемые экспериментальные находки.
With the first demonstration of the in vivo silencing by siRNA of an endogenous gene through an RNAi mechanism — and using an administration route that could readily be applied to humans — now provided, RNAi looks set to gain further prominence as a research tool and potential therapeutic.