Коалиция для лечение CHD2 (CCC), основанная в 2020 году, - это некоммерческая организация, призванная улучшить жизнь людей, страдающих от заболеваний, связанных с CHD2, путем повышения уровня образования, создания сообщества и ускорения исследований, направленных на поиск лечения. Ген CHD2 был идентифицирован как генетическая причина эпилептической энцефалопатии с ранним началом в 2013 году. Наиболее распространенными признаками CHD2-RD являются судороги (96%), умственная отсталость/задержка развития (95%) и расстройство аутистического спектра (56%), а также другие особенности, включая светочувствительность.^1,2 Пациенты обычно испытывают несколько типов припадков рефрактерного характера, включая миоклонические, отсутствующие, миоклонически-атонические, миоклонию век и тонико-клонические припадки.³ Хотя понимание CHD2 прошло долгий путь с момента его открытия как гена эпилепсии 10 лет назад, для достижения цели излечения и улучшения жизни людей с CHD2-RD необходимы дальнейшие важные научные исследования.

CHD2 - это ДНК-связывающий белок, участвующий в ремоделировании хроматина и входящий в семейство генов CHD (хромодомен хеликаза, связывающая ДНК).³ Ремоделирование хроматина включает в себя модификацию и контроль транскрипции, регуляции и экспрессии генов. Большая часть выявленных патогенных (вызывающих заболевание) вариантов в CHD2-RD, как предполагается, приводит к преждевременному усечению (нонсенс, сдвиг рамки считывания, сплайс-варианты) CHD2; также сообщалось о полных делециях гена, приводящих к гаплонедостаточности. Патогенные варианты почти исключительно являются de novo (отсутствуют у одного из родителей)¹

Хотя недавно CHD2 был признан геном, чувствительным к дозе, благодаря крупномасштабным популяционным исследованиям, CCC не известно о каких-либо известных дупликациях только CHD2.4 Недавнее обнаружение трех человек с делециями de novo в CHASERR, длинной не-кодирующей РНК (lncRNA), расположенной непосредственно перед CHD2, дополнило то, что было известно ранее о природе CHD2-RD. Примечательно, что вновь выявленные пациенты с делециями CHASERR демонстрируют гораздо более глубокий фенотип, чем даже самые тяжелые пациенты с CHD2. К особенностям, характерным для пациентов с делециями CHASERR, относятся гипомиелинизация мозга, атрофия коры и полное отсутствие вех развития, которых достигают пациенты с CHD2. Исследования с использованием клеточных линий, полученных от пациентов с делециями CHASERR, выявили сверхэкспрессию мРНК и белка CHD2, что позволяет считать CHD2 доза-чувствительным геном.⁵

Хотя полное влияние потери CHASERR неизвестно, считается, что избыток белка CHD2 приводит к более тяжелому фенотипу, поскольку человеческие делеции, покрывающие как CHASERR, так и CHD2, похожи на гаплонедостаточность CHD2. CHASERR может играть роль не только в регуляции CHD2⁶; подобно другим генам нейроразвития, он был связан с несколькими видами рака.^7-9 В мышиных моделях мышиный аналог CHASERR, Chaserr, негативно регулирует уровень CHD2 in cis-положении, что указывает на CHASERR как на потенциальную терапевтическую мишень для восстановления уровня CHD2 у пациентов с гаплонедостаточностью CHD2.¹⁰

На рисунке 1 сравниваются фенотипы расстройств, связанных с CHD2 и CHASERR.⁵ Хотя CHD2 и CHASERR - это разные заболевания с уникальными фенотипами, оба расстройства соответствуют техническому определению энцефалопатий развития и эпилепсии.¹¹



Figure 1. Comparison of CHD2 and CHASERR Haploinsufficiency.

Чтобы помочь направить наш путь к излечению CHD2-RD, CCC создал «Дорожную карту излечения CHD2» (рис. 2), в которой указаны шаги, которые мы, как сообщество, должны предпринять, чтобы улучшить жизнь людей, живущих с CHD2-RD. С помощью дорожной карты исследований мы можем разделить текущий ландшафт исследований CHD2 на ключевые этапы, которые приведут нас к нашей цели - излечению. Мы можем выявить пробелы и работать над их устранением. Лекарство, скорее всего, будет представлять собой новый терапевтический подход, который восстановит нормальный уровень CHD2, но могут быть и другие подходы, которые помогут облегчить некоторые симптомы заболевания и улучшить качество жизни. Расширение исследований и знаний о CHD2 и CHD2-RD не только продвигает нас по пути к лечению, но и помогает нашему сообществу понять влияние CHD2 и то, как их жизнь может измениться в будущем, как с лекарством, так и без него. Одна из самых больших проблем для пациентов и их опекунов, столкнувшихся с таким редким заболеванием, как CHD2-RD - это недостаток информации и неопределенность. Мы надеемся, что эта дорожная карта не только приведет к излечению, но и поможет нашему сообществу получить более полную информацию. Благодаря дисциплинированному подходу мы надеемся определить клиническую траекторию с учетом измеримых результатов и количественных факторов риска, а затем направить наше сообщество к финишной черте. Мы нацелены на достижение нашей цели, и нам важно учиться у других групп поддержки пациентов и находить способы совместной работы для достижения общей цели.



Figure 2. CCC’s roadmap to cure CHD2.

Когда мы думаем о нашей «дорожной карте» по излечению CHD2, нам прежде всего нужно подумать о том, что мы ожидаем в конце пути, или, как сказал Стивен Кови в своей основополагающей книге «Семь привычек высокоэффективных людей», «начинать с конца». Другими словами, что такое лекарство для сообщества CHD2? Понимание симптомов и проблем качества жизни поможет нам направить наши усилия на проекты, которые соответствуют интересам нашего сообщества пациентов. Чтобы понять проблемы сообщества и области, в которых семьи хотели бы изменить ситуацию к лучшему, CCC провел несколько мероприятий по сбору данных. Первым был опрос, проведенный в закрытой группе CHD2 Facebook для лиц, ухаживающих за больными или оказывающих поддержку больным CHD2-RD. Группа CHD2 в Facebook открыта для любого члена семьи с диагнозом CHD2 после одобрения администратором группы. В сообщении на Facebook участников сначала попросили прислать по электронной почте три наиболее приоритетных направления исследований в совершенно открытом формате. Затем эти первоначальные ответы были преобразованы в основу опроса. Ухаживающие могли проголосовать за три приоритетных направления исследований из вариантов, полученных из ответов по электронной почте, или добавить свои собственные, если какая-то область отсутствовала. В окончательном опросе приняли участие 75 человек. Восемь наиболее важных приоритетов исследования сообщества показаны на рисунке 3. Несмотря на то, что сбор данных в социальных сетях имеет свои ограничения, для CCC это был простой способ получить первоначальное представление о том, что является наиболее важным для нашего сообщества.



Figure 3. Top eight CHD2-RD community research priorities.

Борьба с приступами была самым приоритетным вопросом в опросе. Многие пациенты с CHD2 не могут добиться контроля над приступами, несмотря на то, что пробуют множество различных лекарств; те же, кому удается добиться контроля над приступами, часто обнаруживают, что он не является постоянным. Некоторые семьи отметили, что чувствуют себя так, будто играют в «припадочную рулетку», что приводит к большим нагрузкам, включая побочные эффекты от лекарств, проблемы со школьной деятельностью и выгорание сиделок. Улучшение контроля над приступами - обязательное условие любой разработанной терапии. Вторым приоритетом было поведение. CHD2-RD может вызывать расстройства аутистического спектра (ASD) и синдром дефицита внимания с гиперактивностью, а некоторые люди проявляют сильную агрессию. Некоторые терапевтические средства могут положительно влиять на активность приступов, но иметь негативные поведенческие побочные эффекты, а поскольку приоритетными являются улучшения в обеих областях, важно учитывать этот баланс при разработке будущих терапевтических средств. Третьим приоритетом является решение проблемы регресса, которая может включать изменения в познании, влияние на академические и учебные навыки, а также на способность к самообслуживанию с ухудшением или без ухудшения приступов. Регресс, с которым сталкиваются некоторые пациенты, также создает ощущение срочности в поиске методов лечения, которые могут сохранить неврологическую функцию и/или предотвратить ее появление у других пациентов. Будем надеяться, что лекарство, которое биологически восстановит CHD2 до его более естественного уровня, приведет к заметному улучшению многих из этих проявлений, которые важны для пациентов и их семей. Среди других приоритетов - улучшение умственной отсталости, более подробная информация о фенотипической тяжести, побочных эффектах лекарств и улучшении речи.

Вторая задача по сбору данных связана с первой концептуальной моделью болезни CHD2. FDA рекомендует использовать концептуальные модели заболеваний для разработки лекарств, ориентированных на пациента, поскольку они обеспечивают основу для учета опыта и приоритетов семьи, чтобы обосновать выбор показателей, представляющих интерес для разработки терапии.^12,13 В 2022 году на заседании Американского общества эпилепсии CCC совместно с другими специалистами представил постер «проект концептуальной модели заболевания» для CHD2-RD¹⁴ , который содержал результаты триангулированного методологического подхода: обзор литературы, три интервью с семьями и данные опроса, полученные в ходе цифрового исследования естественной истории болезни, проведенного в 2019 году под руководством д-ра Анны Берг. Энн Берг, профессора-исследователя Чикагской детской больницы имени Энн и Роберта Х. Лури и Медицинской школы Файнберга Северо-Западного университета, и Джерри Несбитта, MBA, создателя программной платформы CLIRINX, на базе которой был реализован проект. Целью исследования естественной истории болезни было лучше понять точку зрения родителей на припадки и сопутствующие заболевания, связанные с CHD2. Всего было 62 участника, которые заполнили онлайн-опросники на цифровой платформе. Средний возраст начала симптомов составил 2 года. Участники испытывали трудности во всех пяти областях контрольного списка аберрантного поведения: гиперактивность, раздражительность, социальная замкнутость, речь и стереотипии. Тридцать пять процентов участников имели сырые баллы, которые позволили бы включить их в испытания на аутизм.

Чтобы расширить проект концептуальной модели заболевания, CCC предпринял тщательный качественный подход под руководством доктора Кристины СанИносенсио, качественного исследователя и члена правления CCC. Предварительные результаты интервью с 15 лицами, ухаживающими за больными CHD2, были представлены на первой семейной и исследовательской конференции CCC в июне 2023 года, а окончательную публикацию планируется представить в конце 2024 года.

CHD2 - редкое заболевание с неизвестной распространенностью. В отчете о почти 10 000 человек, направленных на генетическое тестирование с использованием комплексной панели эпилепсии, у 0,25 % был выявлен патогенный вариант CHD2.¹⁵ В США CHD2 включен в общие панели эпилепсии и аутизма/интеллектуальной недостаточности, предлагаемые крупными компаниями по клиническому тестированию (см. Рисунок 4), но поскольку экзомное или геномное секвенирование все чаще становится рекомендуемым генетическим тестом первой линии для людей с необъяснимыми припадками и/или интеллектуальной недостаточностью, содержание генов в генетических панелях становится менее важным. У меньшего процента пациентов делеции, включающие CHD2 (а иногда и CHASERR), обнаруживаются при исследовании хромосомных микрочипов. Следует отметить, что CHD2 - это один из всего 8 генов, которые включены во все панели по эпилепсии и аутизму/интеллекту из четырех крупных лабораторий США (рис. 4).



Figure 4. CHD2 and CHASERR coverage on genetic panels in the United States.

Еще одним инструментом диагностики CHD2 является тестирование сигнатуры метилирования (или «эписигнатуры»). Гаплонедостаточность CHD2 является одним из нескольких генетических состояний с определенной эписигнатурой^16-18; клиническое тестирование эписигнатуры может быть использовано для определения вариантов неопределенной значимости (VUS). Если у человека с VUS имеется эпипризнак CHD2, то вариант CHD2, скорее всего, патогенен; и наоборот, если эпипризнак отсутствует, то вариант, скорее всего, доброкачественный. Некоторые семьи с VUS оказываются невосприимчивыми к наблюдению за метилированием из-за страха потерять диагноз, который кажется подходящим, что разочаровывает, поскольку они, скорее всего, не смогут претендовать ни на один из методов лечения, над разработкой которых так усердно работает CCC, не решив проблему этих вариантов. Мы также сталкивались с семьями с сильным медицинским образованием, которые просто не знали о существовании этого теста Episign. CCC уже провела один вебинар по метилированию и планирует продолжить работу по просвещению пациентов в будущем. Сигнатура метилирования для CHASERR все еще изучается.

Генетическое тестирование взрослых, возможно, отстает от педиатрического генетического тестирования по целому ряду причин, включая отсутствие доступа к генетическому тестированию и неубедительное предварительное тестирование, проведенное по старым протоколам, но мы наблюдаем изменения в возрастном распределении новых случаев, поступающих в CCC, по мере того как генетическое тестирование взрослых становится все более распространенным. В прошлом году в CCC узнали о пациенте в возрасте около 40 лет, который впервые прошел генетическое тестирование. Этот пациент считается самым старым из известных пациентов с диагнозом CHD2. Продолжающееся исследование взрослых людей, страдающих этим заболеванием, которое проводит доктор Даниэль Андраде из Университета Торонто (в настоящее время оно не опубликовано), в конечном итоге приведет к публикации статьи, в которой будет представлена новая информация об особенностях CHD2 на протяжении всей жизни. Мы также узнали о ребенке, которому диагноз был поставлен в 9 месяцев из-за генерализованной гипотонии, задолго до того, как в среднем приступы начинаются в 24 месяца. Поскольку доступ к генетическому тестированию продолжает расширяться, мы ожидаем, что фенотипический спектр CHD2 будет и дальше расширяться.

Выявление новых пациентов с гаплонедостаточностью CHASERR является гораздо более сложной задачей, поскольку CHASERR не только не предлагается в геномных панелях, упомянутых на рисунке 4, но и не входит ни в одну из генетических панелей, предлагаемых на их веб-сайтах. В настоящее время пациенты выявляются только с помощью геномного секвенирования, а не с помощью небольших генных панелей или экзомного секвенирования, которые чаще всего используются в клинической практике. Чтобы подчеркнуть сложность поиска пациентов, отметим, что между первым случаем CHASERR и вторым случаем прошло почти 2 года, и такой же разрыв между вторым и третьим случаями. Поскольку Alu-опосредованная неаллельная гомологичная рекомбинация является причинным механизмом трех известных случаев, повторный анализ данных хромосомных микрочипов может дать дополнительные случаи при условии охвата CHASERR.⁵ Поскольку симптомы CHASERR могут проявляться вскоре после рождения, предполагается, что расширенное использование секвенирования генома, особенно у новорожденных и детей, поступивших в отделение интенсивной терапии новорожденных (NICU) в возрасте до 1 года, принесет пользу, поскольку многочисленные исследования указывают на преимущества этих подходов в клинической практике.^{19 -24} По мере становления методов секвенирования генома²⁵ и добавления дополнительных методов, таких как RNASeq,²⁶ результативность исследований должна повышаться, а диагностическая одиссея для пациентов сокращаться.

Следующий шаг после постановки диагноза - вовлечение пациентов и поощрение их стать частью нашего сообщества и участвовать в текущих и будущих исследованиях. Другими словами, нам нужно, чтобы пациенты находили CCC. Для этого используются рекомендации компаний, занимающихся генетическим тестированием (например, GeneDX, Invitae), привлечение медицинских работников, которые заказывают генетическое тестирование (неврологов, генетиков, генетических консультантов, других врачей и т. д.), повышение осведомленности о CCC на профессиональных конференциях (например, AES), оптимизация поисковых систем и органический поиск, который приводит семьи на наш сайт www.curechd2.org. Как только пациент/семья переходит на сайт CCC, им предлагается зарегистрировать своего близкого в качестве подтвержденного случая, чтобы считать его уникальным пациентом. Их данные также вносятся в глобальную карту случаев, которая отображается на сайте CCC (см. Рисунок 5). Мы также участвуем в некоммерческой программе Google, которая позволяет нам покупать рекламу по ключевым словам (например, «CHD2») и продвигать сайт CCC среди потенциальных посетителей. Кроме того, CCC поддерживает присутствие в социальных сетях Facebook, Instagram, X и LinkedIn. Кроме того, Facebook зарекомендовал себя как важный канал связи, социальной поддержки и поиска информации для семей, страдающих CHD2, а страница поддержки «Поддержка и исследования CHD2» в Facebook демонстрирует высокую активность пользователей нашего сообщества: по состоянию на 5/7/2024 в нем насчитывается 850 человек.



Figure 5. World Map highlighting location of people with CHD2 in CCCs contact registry.

Эта карта пациентов с CHD2 позволяет нам наглядно представить районы по всему миру, где диагноз CHD2 не ставится или где CCC необходимо расширить охват, чтобы вовлечь эти сообщества. Она также позволяет нам увидеть случаи, зарегистрированные на местном уровне, и выявить пробелы в общении с пациентами. Например, мы знаем, что в Бостонской детской больнице есть невролог, который наблюдал довольно много пациентов, но наша карта регистрации пациентов в Новой Англии малонаселенная. Мы надеемся восполнить эти пробелы с помощью более эффективной работы с населением». Потенциальные промышленные партнеры, рассматривающие возможность инвестирования в разработку терапии редкого заболевания, могут рассматривать реестры как способ оценки вовлеченности сообщества пациентов, выявления географических «горячих точек», которые могут стать хорошим местом для проведения клинических исследований, и облегчения общения с отдельными пациентами.

Мы реализуем множество проектов, направленных на вовлечение выявленных пациентов в активные клинические исследования, включая изучение естественной истории болезни и сбор показателей результатов. Разработка и валидация показателей для CHD2-RD очень важны для клинических испытаний. В настоящее время мы используем платформу RARE-X, размещенную компанией Global genes, которая представляет собой платформу для сбора исследовательских данных. Лица, ухаживающие за больными, или люди с конкретными расстройствами заполняют валидированные опросники по широкому спектру вопросов, связанных со здоровьем, включая качество жизни. Таким образом, оценивается весь фенотип. Эти опросы можно повторять с течением времени, чтобы начать сбор продольных данных, которые могут помочь определить регрессию. В настоящее время в RARE-X нет механизма сбора информации о назначенных лекарствах. Некоторые из показателей результатов RARE-X могут быть использованы в клинических испытаниях. RARE-X позволяет пациентам/опекунам владеть своими данными; они могут выбирать, кто будет видеть их данные, и могут отказаться от них в любое время. Данные RARE-X, полученные от лиц, осуществляющих уход, должны быть сопоставлены с данными, собранными врачом. CCC включила пациентов, проживающих в США, в платформу Ciitizen. Ciitizen собирает, обобщает и предоставляет участникам цифровой доступ к их полной медицинской карте. Исследователи могут подать заявку на доступ для тех, кто дал согласие на изучение конкретного заболевания. Медицинские карты де-идентифицированы. Для количественного анализа этих медицинских карт используется метод анализа под названием Human Phenotype Ontology. Это стандартизированный набор фенотипических терминов, которые используются в вычислительном анализе для получения данных. Преимущество платформы Ciitizen в том, что это объективные данные, собранные врачом, с данными за определенный период времени, но они ретроспективны и ориентированы на аспекты фенотипа, оцениваемые врачом, а не на весь фенотип. Например, невролог может не указывать симптомы со стороны желудочно-кишечного тракта. Метод RARE-X и метод Ciitizen необходимо сопоставить с результатами очных проспективных оценок врачей, чтобы триангулировать данные и получить более объективную информацию о меньшей группе пациентов. Такая углубленная работа началась в лаборатории доктора Хизер Меффорд в детской больнице Святого Иуды.

Модели CHD2 необходимы для того, чтобы мы могли понять фундаментальную науку, которая приводит к патологии, и проверить потенциальные терапевтические средства. Модели заболевания включают в себя модели человеческих клеток (клетки пациентов или клетки, сконструированные таким образом, чтобы иметь вариант CHD2) или модельные организмы, такие как мышь, рыбки данио, муха или лягушка. В идеале модель CHD2 демонстрирует ключевые признаки CHD2-RD; наиболее измеримым фенотипом могут быть судороги, показания ЭЭГ (электроэнцефалограммы) или электрофизиологические аномалии в клетках. В мире существует несколько линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток CHD2 (iPSC) как человека, так и CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat) клеток. В настоящее время существует грант NIH на расширение линии iPSCs в кортикальные органоиды для моделирования клеточных и молекулярных механизмов, лежащих в основе патофизиологии мутаций CHD2.²⁷

Существует несколько итераций мышиной модели CHD2. Первая модель мыши была направлена на 27-й интрон CHD2, в результате чего был получен белок, в котором отсутствовал ДНК-связывающий домен. Фенотип мышей включал дефекты роста, аномалии почек и раннюю летальность; однако спонтанных припадков не наблюдалось.²⁸ В обзоре CHD2 отмечается, что эта модель, возможно, имела некоторое усиление функции CHD2, что является интересным наблюдением в ретроспективе, учитывая опыт CHASERR и сверхэкспрессии CHD2.²⁹ Лаборатория Ханта из Калифорнийского университета в Ирвине создала новую модель мыши CHD2, в которой мишенью был 3-й экзон CHD2, и продемонстрировала дефицит пролиферации нейронов и сдвиг в возбудимости нейронов, включающий дивергентные изменения в возбуждающей и тормозной синаптической функции³⁰. В этой модели также не возникало клинических припадков и не наблюдалось 50% снижения белка CHD2 по сравнению с контролем при количественном определении белка.³⁰ Лаборатория Улицкого создала другую мышиную модель CHD2 (снова основанную на третьем экзоне CHD2), в которой также произошел сдвиг рамки смены двух нуклеотидов.¹⁰ Эта модель мыши, охарактеризованная доктором Мораном Рубенштейном из Тель-Авивского университета при частичном финансировании гранта CCC, имела некоторые измеряемые фенотипы и необычную активность ЭЭГ, но также не имела клинических припадков (рукопись находится на рассмотрении, предварительные данные будут представлены на семейной конференции CHD2 в 2023 году). Одним из возможных сценариев создания более совершенной модели CHD2 является использование CRISPR для удаления экзонов в дальнейшей части белка или для моделирования известных патогенных мутаций CHD2 у человека. Такой подход к воспроизведению человеческих мутаций был использован в недавней модели крыс для SYNGAP1³¹, другой генетической формы эпилепсии, и представлен на семейной конференции 2022 года. Модель SYNGAP1, основанная на делеции экзонов 8-12, действительно приводила к измеряемой судорожной активности на ЭЭГ у гетерозиготных крыс Syngap1.³¹ Несмотря на то что CHD2 и SYNGAP1 - разные заболевания со своей биологией, поиск животной модели с измеряемыми судорогами является важной целью для CHD2, и их успех не должен игнорироваться.

Существуют и другие модели CHD2, включая модель рыбок данио из Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF), созданную в лаборатории Барабана³². Также у личинки рыбок данио, которым вводили E2I2-MO, демонстрировали значительные морфологические и поведенческие изменения, включая отек перикарда, микроцефалию, искривление тела, отсутствие плавательного пузыря, замедленный рост и эпилептиформные разряды.³³ Лаборатория Уиллси в UCSF недавно исследовала потерю CHD2 у Xenopus tropicalis (диплоидных лягушек). У Xenopus, по неизвестным нам причинам, наблюдается более сильный фенотип при использовании морфолино³⁴ , чем при CRISPR-редактировании (неопубликованное исследование, финансируемое CCC), и для более детального изучения этого различия необходимы дальнейшие исследования. Фенотип спонтанных судорог в животных моделях многих различных DEEs (эпилептических энцефалопатий развития) (не ограничиваясь CHD2), как оказалось, распространен гораздо меньше, чем предполагалось, причины этого остаются неясными, но могут свидетельствовать о видовой чувствительности к функции гена DEE, которая особенно выражена у человека.

Если не ограничиваться моделями животных, то существуют и другие возможности расширить наше понимание CHD2. Одна из возможностей - поиск закономерностей на ЭЭГ когорты пациентов с CHD2 для выявления «биомаркера» ЭЭГ. Другая возможность - взять кровь, мочу или другие биопробы у пациентов с CHD2 и поискать другие биомаркеры CHD2, обнаруженные в этих жидкостях. В настоящее время CCC участвует в предконкурсном исследовании биомаркеров, изучая метаболиты и белки, благодаря нашему членству в COMBINEDBrain (сокращение от Consortium for Outcome Measures and Biomarkers for Neurodevelopmental Disorders), который является некоммерческим консорциумом, призванным ускорить путь к клиническому лечению пациентов с редкими неврологическими расстройствами. Наконец, у CHD2 есть доказанная сигнатура метилирования в крови¹⁸ , и есть возможность поиска сигнатур в других типах клеток.

Разработка моделей гаплонедостаточности CHASERR намного сложнее из-за трудностей, присущих работе с lncRNA, одной из главных проблем является изменчивость последовательности.³⁵ Даже будучи одной из наиболее эволюционно сохранных lncRNA,³⁶ CHASERR не застрахован от этих проблем. Сотрудники Центра модельных организмов Сети не диагностированных заболеваний, занимающиеся созданием и изучением животных моделей на рыбках данио, плодовых мушках и червях, не верили, что смогут создать модель CHASERR с полезными сведениями. Лаборатория Улицкого создала модель мыши CHASERR с выраженным фенотипом, включая почти двукратное увеличение выработки CHD2.¹⁰ Однако эта линия мышей имеет раннюю летальность, что не является аномальным для генов, связанных с гипомиелинизацией, таких как POLR3B.³⁷ Модель условного нокаута может решить проблему ранней летальности, подобно новой модели мыши, недавно разработанной для лейкодистрофии 4H.³⁸

Вместо того чтобы использовать метод нокаута CHASERR, который теоретически приводит к полной потере функции (но может быть подвержен альтернативным сайтам начала транскрипции), можно перейти к подходу, использующему CRISPR для нацеливания на очень специфические последовательности CHASERR, которые кажутся важными, и затем изучить изменения в этих последовательностях. lncLOOM - это инструмент для выяснения наиболее консервативных последовательностей lncRNAs, и он выявил несколько хорошо законсервированных последовательностей CHASERR, в основном вокруг последнего экзона CHASERR и ближе к началу CHD2.³⁹ Мы полагаем, что работа над консервативными последовательностями CHASERR продолжается и что результаты будут опубликованы где-то в 2024 году. Др. возможность заключается в использовании биоинформационных подходов для изучения других последовательностей CHASERR, которые не сохраняются, но, судя по их аминокислотной структуре, имеют наибольший потенциал биологического воздействия.

Наконец, мы считаем, что существует большая возможность расширить работу над моделями Xenopus для CHD2 и CHASERR, поскольку эти модели лягушек относительно недороги и позволяют проводить высокопроизводительный скрининг лекарств.⁴⁰ Мы понимаем, что как недоэкспрессия, так и избыточная экспрессия CHD2 у Xenopus демонстрирует сильный фенотип, хотя эти экспериментальные результаты были получены путем манипулирования белками, а не в виде настоящих моделей in vivo для патогенных мутаций.

Предыдущие исследования на Xenopus показали, что CHD2 локализуется на микротрубочках, что позволяет предположить, что белок CHD2 может играть роль в регуляции тубулина в дополнение к регуляции гистонов, подобно другим ремодельерам хроматина³⁴. Интересно, что фенотип человека CHASERR приводит к значительным проблемам с мозолистым телом, фенотип, который был назван классической цилиопатией^41,42 и как гипоплазия мозолистого тела, так и вентрикуломегалия (наблюдаемая на двух МРТ пациентов CHASERR)⁵ были связаны с известными цилиопатиями⁴³. Изменения микротрубочек могут не быть причиной фенотипа пациентов с CHD2 или CHASERR, а наблюдаемые на МРТ изменения не являются исключительной особенностью цилиопатий, но мы считаем, что эти первые результаты заслуживают дальнейшего изучения и могут дать представление о том, является ли биология тубулина доза-зависимой. Xenopus - идеальная модель для оценки этой биологии.^44,45

Для ССС важно понять фундаментальные основы CHD2 и то, как это приводит к патологии. Изначально было неизвестно, почему патологические варианты, влияющие на CHD2, приводят к эпилепсии или фенотипам отклонения нейроразвития. CHD2 - один из девяти хромодоменных хеликазных ДНК-связывающих белков семейства, ответственных за ремоделирование хроматина, который контролирует трехмерную архитектуру генома и экспрессию генов.¹⁰ Большинство патологических вариантов в CHD2 приводят к усечению, в то время как патогенные миссенс-варианты обычно происходят в высоко консервативных ДНК-связывающих или хеликазных доменах, что, вероятно, препятствует способности CHD2 ремоделировать хроматин.¹

Модели эмбриональных стволовых клеток человека дикого типа и гаплонедостаточных CHD2 сравнивались для определения механизмов, с помощью которых CHD2 регулирует развитие мозга человека. Было установлено, что во время дифференцировки кортикальных интернейронов (hcIN) CHD2 имеет геномные профили связывания.⁴⁶ CHD2 играет роль в стимулировании экспрессии генов во время развития hcIN. У CHD2 есть прямые мишени и механизмы, с помощью которых CHD2 предотвращает преждевременную дифференцировку hcIN, и это один из механизмов, когда патогенные варианты CHD2 могут вызывать нарушения развития.⁴⁶ Также было показано, что гаплонедостаточность CHD2 может вызывать повышенную экспрессию многих нейронных генов, что может приводить к аутизму и другим нарушениям нейроразвития.⁴⁶

Работа in vivo на модели лягушки Xenopus показала, что белок CHD2 локализуется на микротрубочках митотического веретена.³⁴ Патологические варианты CHD2 приводят к нарушению локализации на микротрубочках и остановке клеточного цикла, что приводит к повреждению ДНК и гибели клеток.³³ Биология тубулина довольно сложна,^34,47 и неизвестно, в какой степени дефекты микротрубочек определяют патологию заболевания по сравнению с транскрипционными изменениями.³⁴ Xenopus может быть идеальным организмом для изоляции влияния дефектов микротрубочек благодаря возможности использовать систему бесклеточного цитоплазматического экстракта яиц Xenopus, где веретена могут формироваться в отсутствие ядер.^34,48

Для CHASERR и CHD2, по-видимому, существует возможность изучить специфичность клеточного типа и рассмотреть типы клеток помимо нейронов. Young обнаружил, что CHD2 широко экспрессируется в олигодендроцитах, почти в той же степени, что и в нейронах, но, по общему признанию, не изучал этот тип клеток в своей мышиной модели CHD2 и указал на олигодендроциты и астроциты как на потенциальные объекты для дальнейшего изучения.³⁰ Такой подход особенно важен, поскольку экспрессия lncRNA может быть более специфичной для разных типов клеток.^49,50

Наконец, количественное определение белка CHD2 - важный вопрос, который необходимо решить в будущем. CHD2 слабо экспрессируется в некоторых типах клеток, и бывает трудно найти хорошие контрольные образцы. В некоторых мышиных моделях CHD2 наблюдаются неоднородные результаты, включая модели CHD2+/-, в которых не удается достичь 50-процентного снижения белка³⁰, и модели CHD2-/-, в которых белок все еще можно измерить при Вестерн-блот анализе.¹⁰ Чтобы лучше понять CHD2, нам нужно работать с экспертами по белкам, чтобы отточить наши методы измерения CHD2 и создать научные протоколы по измерению CHD2.

Нацеливание на патологические варианты CHD2-RD затруднено по целому ряду причин, но CCC и наши исследователи видят возможность для глубокого осмысления и применения новых подходов. Традиционные векторы адено-ассоциированных вирусов (AAVs) для генотерапии способны вводить до 4,7 кб одноцепочечной ДНК⁵¹; длина белка CHD2 составляет 1828 аминокислот, а вся кодирующая последовательность CHD2 превышает 5 кб. Помимо проблем с размером гена, цис-действующая петля обратной связи между CHD и CHASERR10, вероятно, создаст дополнительные трудности для терапии путем замены гена.

Одним из наиболее перспективных подходов для лечения CHD2-RD является использование антисмысловых олигонуклеотидов (ASO), которые представляют собой небольшие одноцепочечные нуклеотиды, нацеленные на определенную РНК для изменения экспрессии белка.⁵² В случае CHD2 целью будет увеличение экспрессии CHD2 для преодоления гаплонедостаточности. Особое внимание необходимо уделить балансу увеличения экспрессии CHD2, учитывая, что сверхэкспрессия CHD2 может привести к более тяжелому фенотипу, как это наблюдается у людей с делециями CHASERR с повышенной экспрессией CHD2, а также помнить, что увеличение экспрессии CHD2 может также увеличить экспрессию патологического аллеля, что может привести к пагубным последствиям. В настоящее время изучается возможность целенаправленного воздействия lncRNA CHASERR с помощью ASO. У мышей таргетирование Chaserr для снижения ее экспрессии приводит к увеличению уровня мРНК CHD2 и последующего уровня белка.¹⁰ Нам сообщили, что в настоящее время изучаются и другие мишени ASO, которые могут увеличить экспрессию CHD2.

Еще одним терапевтическим направлением является использование микроРНК (miRNA). Это небольшие не-кодирующие РНК, которые регулируют экспрессию белков и имеют решающее значение для развития мозга. Дисрегуляция системы миРНК может привести к эпилепсии.⁵³ Поскольку миРНК могут манипулировать множеством РНК-мишеней, они могут стать терапевтическими, если использовать их для избирательной регуляции отдельных транскриптов, что позволит преодолеть гаплонедостаточность^.53 Необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, можно ли манипулировать ими для лечения CHD2-RD. ASO уже прошли клинические испытания, и мы ждем, когда миРНК добьются того же, чтобы проложить путь вперед для этого терапевтического подхода.

В настоящее время проводятся скрининги целевых лекарственных препаратов на животных моделях, и этот подход успешно применяется при других редких заболеваниях. Самым известным препаратом в области эпилепсии является fenfluramine.⁵⁴ Изначально разработанный как средство для подавления аппетита, сейчас он разрешен для лечения синдрома Dravet по программе контролируемого доступа, чтобы минимизировать риск.⁵⁴ В случае ADNP (activity dependent neuroprotector homeobox), еще одного гена, связанного с ремоделированием хроматина, с неврологическими симптомами, применение ketamine в малых дозах привело к заметному улучшению поведения.⁵⁵ Хотя эти примеры - не более чем стимулы для уверенности, можно и нужно рассматривать скрининг малых молекул для поиска потенциального малого молекулярного средства для модификации болезни при CHD2-RD.

Еще один метод, который следует рассмотреть, - это терапия прочтения стоп-кодона для нонсенс-вариантов. При этом рибосома считывает стоп-кодон и продолжает трансляцию, а не приводит к образованию усеченного белка.⁵⁶ Однако этот метод может быть использован только для пациентов с нонсенс-вариантами конкретных аминокислот и не может быть полезен для всего сообщества CHD2-RD, что делает его менее приоритетным.

При гаплонедостаточности CHASERR потенциальные методы лечения осложняются неизвестностью и сложностью биологии CHASERR/CHD2. С точки зрения размера, CHASERR, по-видимому, поддается генотерапии AAV, но неизвестно, сможет ли трансген снизить уровень CHD2, учитывая цис-действующую природу CHASERR. РНК-интерференция (RNAi)⁵⁷ может стать хорошим инструментом для снижения уровня CHD2 при условии, что уровень белка можно будет контролировать таким образом, чтобы не допустить слишком низкого уровня CHD2. Другая возможность - направить активатор на последний экзон CHASERR, поскольку он содержит наиболее консервативные последовательности в CHASERR, и эти мотивы могут быть движущей силой регуляции уровня экспрессии CHD2.³⁹ CHASERR был представлен фонду n-Lorem, но не был принят, в частности, из-за отсутствия фармакодинамического биомаркера для измерения CHD2.

Биомаркеры - ценный инструмент для независимого подтверждения эффективности лечения. В случае CHD2-RD это очень важно, поскольку слишком большое количество CHD2 (как в случае патологического варианта CHASERR) также вызывает фенотип. Вероятно, существует терапевтическое окно, которое необходимо установить, и поиск клинически полезного биомаркера может помочь нам титровать терапию до наиболее эффективной дозы. Мы также должны помнить, что для того, чтобы потенциальный терапевтический препарат достиг пораженной ткани в организме (например, мозга), он, скорее всего, будет введен непосредственно в спинномозговую жидкость (CSF). Поэтому эффективный биомаркер должен либо измеряться в CSF, либо эффект терапии должен преодолеть гематоэнцефалический барьер, чтобы его можно было считать в плазме крови. Метилирование ДНК является сильным кандидатом в биомаркеры, учитывая сильную сигнатуру метилирования при гаплонедрстаточности CHD2.¹⁸ Обращение вспять или изменение этой сигнатуры после терапевтического воздействия может помочь определить эффективность терапии.

Важно отметить, что дорожная карта исследования - это не прямая дорога с поворотами, а многополосное шоссе, где множество проектов движутся рядом друг с другом, и все они могут влиять друг на друга. Работа по изучению естественной истории будет способствовать развитию фундаментальной науки. Лучшим примером этого является наша первая семейная встреча, организованная CCC в июне 2023 года. Наше сообщество выиграло от встречи с другими людьми, страдающими от CHD2-RD и от общения с экспертами в этой области, которые представили клинические и научные доклады высокого уровня. Наряду с этим исследователи также получили огромную пользу от встречи с представителями сообщества. Это позволило им углубить свое понимание CHD2-RD на фоне первого в истории собрания пациентов, понять влияние CHD2-RD на отдельных людей и их семьи, а также повлиять на будущие направления исследований. Такой постоянный обмен знаниями важен для информирования наших семей, чтобы повысить их вовлеченность, а исследователей - для более полного понимания заболевания.

Сотрудничество - это ключ к успеху не только среди наших исследователей и пациентов, но и среди представителей других редких заболеваний и связанных с ними групп по защите прав пациентов (PAG). Мы можем многому научиться на примере успехов и неудач друг друга, понять фундаментальную науку и то, как каждое заболевание может пересекаться не только в симптомах, но и в механизмах развития болезни. Мы начали изучать другие редкие генетические заболевания, связанные с хроматином и транскрипцией. Фонд синдрома Koolen De–Vries (ген KANSL1) - это PAG, стремящийся получить ASO через регуляторную lncRNA, схожую с CHASERR58, и мы полагаем, что синдром Kleefstra (EHMT1) и ADNP также могут иметь схожие регуляторные lncRNA. Интересно, что CHD2, KANSL1, EHMT1 и ADNP имеют различные сигнатуры метилирования¹⁶ и учитываются в тесте EpiSign Complete.

Наши главные приоритеты, которые необходимо решить, чтобы привести к излечению, отвечающему приоритетам общества, - это разработка животной модели, которую можно было бы использовать для терапевтических испытаний; разработка биомаркера для титрования и измерения ответа; и дальнейшая разработка терапии для лечения CHD2-RD. В краткосрочной перспективе мы надеемся подготовить к публикации результаты репозиционирования лекарственных препаратов и работу по изучению естественной истории болезни. Мы надеемся, что работа по изучению естественной истории болезни поможет разработать клинические рекомендации, которые помогут нашему сообществу в краткосрочной перспективе. Чтобы продвинуть нашу дорожную карту вперед, в середине 2024 года мы проведем очную научную встречу для исследователей CHD2, чтобы встретиться, обменяться знаниями и определить наиболее важные научные приоритеты, а также поощрить сотрудничество в рамках этих проектов.

CCC продолжает создавать и информировать наше сообщество. Наши увлеченные и знающие исследователи регулярно обновляют информацию. К нашему сообществу присоединяются новые исследователи. Мы продолжаем повышать осведомленность о CHD2-RD и учиться у других сообществ, занимающихся проблемами нейроразвития. Мы продолжаем собирать средства, проводить вебинары и другие мероприятия, чтобы поддерживать наше сообщество в актуальном состоянии. Все это делается в надежде довести многополосное шоссе до финишной черты и создать успешную терапию для CHD2-RD в том числе вызванных CHASERR.