Многие LSDs, включая GD, сопровождаются неврологическими нарушениями. Генотерапия дает особое преимущество при неврологических расстройствах, поскольку многие векторы обладают уникальными свойствами, позволяющими им проникать через BBB. Векторы AAV эффективно и высоко-селективно трансдуцируют ткани по всей нервной системе при использовании в сочетании с промоторами и энхансерами, специфичными для конкретного типа клеток [47,48], что позволяет доставлять их в пораженные участки мозга. AAV могут доставлять терапевтические белки, антитела, микро-РНК или точные вставки и делеции ДНК для изменения геномного профиля клеток-хозяев [49]. Доклинические исследования показали, что прямая внутривенная доставка AAVs может быть столь же эффективна в обращении нейронопатических фенотипов, как и интрацеребровентрикулярные инъекции, направленные исключительно на центральную нервную систему (ЦНС) [50]. Более того, несколько предыдущих и текущих клинических исследований дают осторожно-оптимистичный взгляд на терапевтический потенциал векторов AAV для лечения неврологических заболеваний [51], подтверждая их безопасность в клинических условиях и общую эффективность. Также было замечено, что рекомбинантные адено-ассоциированные вирусные векторы менее иммуногенны во всех типах тканей (включая нейронные), чем аденовирусные векторы [52-54]. Эти клинические испытания подтверждают безопасность генотерапии AAV при лечении наследственных заболеваний и неврологических расстройств, что делает ее целесообразным терапевтическим подходом при GD.

Несмотря на то, что в настоящее время не существует одобренных FDA методов генотерапии GD интерес к этой области был значительным на протяжении нескольких десятилетий, включая работы, проводимые с различными мышиными моделями и вирусными векторами. Несколько исследований создали исторический прецедент, демонстрирующий перспективность GD как кандидата на генную терапию. Choudary et al. [55] одними из первых исследовали генотерапию GD и успешно индуцировали экспрессию глюкоцереброзидазы человека в клетках млекопитающих с помощью ретровирусного переноса генов. Однако экспрессированный фермент был неактивен и не восстанавливал уровень GCase. Вскоре после этого было сообщено об успешной трансплантации трансфицированных клеток костного мозга в мышиные модели с восстановлением макрофагов и микроглии центральной нервной системы [56]. Schiffman и др. подтвердили эффективность ретровирусной трансплантации костного мозга мышей с длительным выживанием благодаря повторным инъекциям трансфицированных стволовых клеток [57]. В 1997 и 1998 годах три отдельные группы провели клинические испытания для оценки развивающейся технологии. Schuening et al. вводили пациентам репопулирующие клетки периферической крови, трансдуцированные ретровирусным вектором. Однако им не удалось добиться успешного приживления трансдуцированных клеток [58]. В 1998 году Dunbar и др. продемонстрировали долгосрочное эффективное приживление трансдуцированных генн-маркированных клеток, но не смогли показать улучшение активности GCase у пациентов [59]. Barranger и др. трансплантировали реципиентам модифицированные CD34+ клетки и смогли наблюдать устойчивую выработку фермента у одного пациента в течение как минимум девяти месяцев [60]. Сообщаемые уровни были достаточны для того, чтобы отлучить пациента от ERT, но через 27 месяцев уровень фермента снизился, и пациенту пришлось возобновить инфузионную терапию. Некоторые из этих ранних исследований поддержали использование вирусной генотерапии, но при этом предупредили о возможных проблемах безопасности, связанных с потенциальными онкогенными и иммуногенными побочными эффектами терапии [61]. Недостатки этих клинических испытаний подтвердили необходимость проведения более тщательных доклинических исследований.

Целью данного обзора было описание потенциальной эффективности различных вирусных векторов in vivo для генотерапии GD. Мы оценили данные, представленные в предыдущих исследованиях, на основе мышиных моделей, использованных для определения осуществимости методов генотерапии и их переносимости, а также векторных конструкций и путей введения, чтобы понять их эффективность и избирательность в отношении определенных типов тканей (табл. 1).

Таблица 1. Краткое описание доклинических исследований генной терапии болезни Гоше.

После неудовлетворительных клинических результатов генотерапии GD ex vivo последующие исследования переключились на методы in vivo. Однако проведение исследований на животных для лечения GD по-прежнему сдерживается отсутствием подходящей животной модели, которая точно повторяла бы фенотипы, наблюдаемые у человека [71,72].

Возможность генотерапии GD in vivo впервые была продемонстрирована на моделях мышей BALB/c и C57Bl/6J, не относящихся к группе Гоше, что позволило установить способность вирусных векторов создавать терапевтические и супрафизиологические уровни GCase в сыворотке и тканях, пораженных болезнью Гоше [62,64,65]. Marshall et al. также использовали искусственно вызванную мышиную модель GD леча мышей BALB/c conduritol-β-epoxide (CBE) и глюкоцереброзид-содержащими липосомами для ингибирования активности GCase и повышения уровня гликосфинголипидов, соответственно. Эти мыши накапливали GluCer в лизосомных компартментах макрофагов печени (клетки Купфера), эффективно воспроизводя одну из биологических отличительных черт GD. Группа продемонстрировала, что индуцированная переносом генов секретируемая GCase может локализоваться в клетках Купфера, несмотря на свою не-модифицированность, и что она имеет более длительный период полураспада, чем модифицированный фермент, вводимый в рамках ERT. Успешное нацеливание GCase, доставленной в макрофаги, эффективно устранило накопление GluCer в печени, подтвердив, что GD является жизнеспособным кандидатом для генотерапии in vivo [62].

Несмотря на относительную простоту и низкую стоимость создания мыши CBE, в конечном итоге это негенетическая модель, которая не является достаточной для оценки эффективности генотерапии у пациентов. Кроме того, эта модель может быть довольно вариабельной, поскольку проявление симптомов в значительной степени зависит от дозы CBE, продолжительности лечения, а также возраста и штамма мыши [73]. Таким образом, для более точных доклинических исследований генной терапии GD in vivo необходима генетическая модель мыши, демонстрирующая постоянный фенотип.

Создание модели мыши D409V/null, проведенное Xu et al. в 2003 году, позволило продолжить изучение этой терапевтической стратегии [63,66,74]. Хотя этот вариант GBA1 не часто встречается у пациентов с GD у мышей с генотипом D409V/null наблюдалось более чем 94% снижение активности GCase, накопление гликосфинголипидов и аномальные клетки-накопители в висцеральных тканях. Мыши D409V/null отличались нормальным поведением, фертильностью и продолжительностью жизни. Неврологических проявлений не наблюдалось, и, следовательно, они наилучшим образом моделировали мягкий, не-нейронопатический GD [74]. Однако с возрастом у этих мышей наблюдались нарушения памяти, связанные с накоплением α-синуклеина [75]. Этот факт может затруднить использование данной линии мышей в исследованиях по генотерапии, поскольку у них появляются дополнительные симптомы, связанные с патологиями, для лечения которых векторы не предназначены.

Предыдущие попытки создать полный нокаут Gba1 у мышей приводили к быстрой неонатальной смерти из-за нарушения формирования кожного барьера [76]. Чтобы обойти этот летальный фенотип кожи, Enquist и др. создали условную модель нокаута Mx1-Cre+ Gba1flox/null, которая была способна нормально развиваться в коже плода [67]. Используя систему Mx1/Cre-loxP, Cre-опосредованная делеция экзонов 9-11 Gba1 была постнатально индуцирована путем введения полиинозиновой полицитидиловой кислоты, которая активирует промотор Mx1. После вырезания экзонов активность GCase была устранена в селезенке и значительно снижена в печени и костном мозге. У индуцированных Gba1-нокаутных мышей наблюдался высокий уровень GluCer, спленомегалия и микроцитарная анемия, а в кроветворной ткани были обнаружены клетки Гоше. Из-за ограниченной активности промотора Mx1 в мозге не было выявлено поражения ЦНС, а продолжительность жизни была нормальной, что делает эту модель наиболее похожей на симптоматический GD 1 типа [67,68].

Создание моделей нейронопатических форм GD было сопряжено с трудностями [77]. Группа Karlsson создала нокаутную линию мышей K14-lnl в попытке решить проблемы, связанные с созданием мышиной модели НGD [78]. loxP-neomycin дезадаптация Gba1 у этих мышей была соединена с Cre-рекомбиназой, регулируемой промотором K14, специфичным для кератиноцитов. Эта модель обеспечивала экспрессию Gba1 в коже, что предотвращало неонатальную смерть. Примерно в возрасте 10 дней состояние мышей быстро ухудшалось. У них развилась двигательная дисфункция и судороги, а невропатологическое обследование выявило потерю нейронов, микроглиоз и астроглиоз. У мышей K14-lnl заметно снижена активность GCase и аномальные уровни GluCer в мозге, печени и селезенке, а также присутствуют клетки Гоше в висцеральных тканях. Как правило, они погибали в течение первых 2 недель жизни, что позволило создать актуальную, хотя и недолговечную модель, отражающую тяжелую форму GD 2 типа.

Чтобы выяснить роль микроглии с дефицитом GCase в невропатологии GD 2-го типа, Enquist и др. скрестили мышей Gba1^flox/flox с мышами Nestin-Cre, чтобы получить мышь Nestin-^flox/flox [67,78]. В этой модели Gba1 был нокаутирован исключительно в предшественниках нейронов и нейроглиальных клетках, не нарушая GCase в микроглии. У мышей Nestin-flox/flox развивались симптомы, сходные с симптомами мышей K14-lnl, включая аномальную походку, ригидность конечностей и паралич в конечной стадии. Однако появление и прогрессирование симптомов было отсрочено по сравнению с моделью K14-lnl.

Du et al. использовали модель мыши Gba1^flox/flox для создания другой модели НGD наряду с моделью мыши Nestin-flox/flox [69,78]. Они скрестили Gba1^flox/flox с мышами UBC-CreERT2 и Nestin-Cre, чтобы получить генотипы Gba1^flox/flox, UBC-CreERT2 и Gba1^flox/flox, Nestin-Cre, соответственно. Подобно мышам Mx1-Cre+ Gba1^flox/null, Gba1^flox/flox;UBC-CreERT2 является условной моделью нокаута Gba1. В этой модели рекомбиназа Cre, связанная с мутантным рецептором эстрогена (T2), активируется только после воздействия химического вещества тамоксифена. Эта активация, управляемая промотором UBC, впоследствии удаляет Gba1 во всем организме. После многократных внутрибрюшинных инъекций тамоксифена мыши Gba11^flox/flox;UBC-CreERT2 быстро теряли вес, испытывали двигательную дисфункцию (включая аномальную походку и гиперэкстензию шеи) и судороги, а через 7 дней после индукции погибали. Клетки Гоше были обнаружены в мозге, печени и селезенке, а активность GCase была значительно снижена в мозге, печени и селезенке [69]. Мышь Gba1^flox/flox, UBC-CreERT2 представляет собой жизнеспособную модель, имитирующую системное поражение и поражение ЦНС, наблюдаемое при НGD а условная природа модели позволяет гибко изучать эффекты терапии на мышах разного возраста.

Глюкоцереброзидаза секретируется только тогда, когда клетки экспрессируют высокий уровень фермента. Таким образом, сконструированные векторы должны быть способны очень эффективно стимулировать выработку GCase, чтобы оказывать терапевтический эффект при сохранении благоприятного профиля безопасности [62]. Для достижения такого результата были испытаны различные комбинации вирусных векторов, серотипов и промоторов для доставки человеческого GBA1 (huGBA).

Для генотерапии GD было рассмотрено несколько не-AAV векторов, включая аденовирус [62], ретровирусы [67,79] и лентивирусы [68].

Marshall и др. создали рекомбинантный аденовирусный вектор, заменив область E1 аденовируса серотипа 2 (Ad2) на немедленный ранний промотор и энхансер цитомегаловируса человека (CMV) [62]. Высокая доза этого вектора у мышей дикого типа увеличивала экспрессию GCase в 100 раз в печени и в 10 раз в селезенке и легких, а также способствовала секреции GCase в сыворотку. Тестирование их конструкции на мышиных моделях, вызванных CBE, показало, что как внутривенное, так и интраназальное введение может привести к образованию GCase, нацеленной на клетки Купфера, это может уменьшить накопление GluCer в печени. Низкая доза вектора также была способна очистить клетки Купфера от GluCer, несмотря на то, что уровень GCase не был обнаружен в сыворотке крови, что, вероятно, объясняется повышенной способностью аденовирусов к прямой трансдукции клеток Купфера [62]. Однако аденовирусы, как правило, обладают высокой иммуногенностью, и поглощение аденовирусов клетками Купфера через врожденный иммунный ответ парадоксальным образом снижает эффективность и продолжительность жизни вирусного вектора [80,81].

Enquist и др. использовали ретровирусный вектор с энхансер-промотором фокусообразующего вируса селезенки (SFFV) для индукции экспрессии GCase в гемопоэтических стволовых клетках, которые затем были трансплантированы мышам GD. Этот вектор был способен повышать активность фермента GCase в костном мозге, селезенке и печени и впоследствии нормализовать уровень субстрата, несмотря на относительно низкое маркирование гена. Клетки Гоше были почти полностью уничтожены в модели, прошедшей лечение, тогда как у не-леченых мышей фенотип GD продолжал развиваться и проявляться [67]. Однако ретровирусы обладают риском генотоксичности, особенно в сочетании с сильным энхансером-промотором с длинным терминальным повтором, таким как SFFV, и поэтому могут не обладать подходящим профилем безопасности для клинической генотерапии [82,83].

Лентивирусы, такие как HIV-1, обладают узким тропизмом к не-делящимся клеткам, таким как первичные Т-лимфоциты, CD34+ клетки, дендритные клетки и макрофаги, что позволяет улучшить доставку к желаемым мишеням генотерапии для GD [84]. Лентивирусы также демонстрируют большую безопасность и меньший риск активации инсерционного протоонкогена, чем гаммаретровирусы [85]. Kim et al. оценили жизнеспособность лентивирусного вектора на основе HIV-1, управляемого человеческим фактором элонгации 1-α (EF-1α), который является универсальным и относительно мощным промотором, особенно в гемопоэтических стволовых клетках [65,86]. EF-1α обладает повышенной стабильностью, экспрессией трансгена и эффективностью трансфекции по сравнению с традиционными вирусными промоторами, такими как CMV [87]. У мышей C57BL6/J этот вектор широко распространялся в различных клетках и вызывал супрафизиологические уровни активности GCase в различных висцеральных тканях через восемь недель после введения в портальную вену или хвостовую вену. Эта повышенная экспрессия сохранялась в этих тканях в течение четырех месяцев исследования, хотя в мозге мышей, прошедших лечение, трансдукции не наблюдалось. У мышей, которым вводили препарат через портальную вену, активность GCase была выше, чем у мышей, которым вводили препарат через хвостовую вену, но после инъекции развивалась легкая печеночная токсичность.

Несмотря на продемонстрированную эффективность лентивирусов на основе HIV-1, источник вектора вызывает опасения, что родительский вирус может реконструироваться в репликационно компетентный вирус [88]. Чтобы снять это беспокойство и еще больше снизить онкогенный риск, были разработаны самоинактивирующиеся (SIN) лентивирусные векторы, удаляющие транскрипционные элементы HIV-1 [89,90]. Dahl et al. трансдуцировали клетки костного мозга лентивирусными векторами SIN и пересадили их предсимптоматическим и симптоматическим мышам Mx1-Cre+ Gba1flox/null. Они сравнили безопасность и эффективность двух лентивирусных векторов SIN, содержащих промоторы фосфоглицерат-киназы человека (PGK) и CD68, соответственно, с лентивирусным вектором SIN с промотором SFFV [68]. PGK - относительно слабый промотор, который приводит к физиологической, а не супрафизиологической экспрессии генов и экспрессируется повсеместно, тогда как CD68 - специфический для макрофагов промотор [91,92]. Оба вектора успешно устраняли спленомегалию, повышали активность GCase и предотвращали накопление GluCer в костном мозге, селезенке и печени, если их вводили до появления симптомов. У мышей, у которых уже развились симптомы, оба вектора также значительно повышали активность GCase. Однако, в отличие от SFFV-позитивного контрольного вектора, который увеличивал активность до 9,5 раз от уровня дикого типа, ни PGK, ни CD68 SIN лентивирусные векторы не восстанавливали активность GCase до уровня дикого типа. Тем не менее, полученного уровня активности было достаточно для снижения накопления GluCer и резкого уменьшения количества клеток Гоше. У мышей, обработанных любым из векторов, также наблюдался почти нормальный размер селезенки, а также улучшение нескольких показателей крови. Все векторы демонстрировали устойчивую экспрессию по крайней мере до 20 недель. Промотор SFFV обеспечивал самый высокий уровень экспрессии GBA1 во всех исследованных типах тканей и клеточных подмножествах, включая клетки предшественники. Промоторы CD68 и PGK оба экспрессировали трансген в тканях, лимфоидных компартментах и гранулоцитах, но промотор CD68 привел к более высокой экспрессии трансгена в моноцитах и макрофагах. Таким образом, хотя промоторы PGK и CD68 дали менее надежные результаты, чем промотор SFFV, они все же были способны предотвратить и обратить вспять фенотип GD1 без риска для безопасности, связанного с более сильным промотором, таким как SFFV.

Адено-ассоциированные вирусы были основным вирусным вектором, используемым для генотерапии GD in vivo, благодаря их относительной безопасности по сравнению с аденовирусами и лентивирусами, способности поддерживать производство трансгенного продукта и возможности доставлять продукт как в делящиеся, так и в не-делящиеся клетки. Хотя существуют десятки серотипов AAV, только некоторые из них были изучены в качестве векторов для GD так как они, по-видимому, обладают наиболее подходящими тропизмами.

Серотип AAV2 широко используется в генотерапии, и большинство рекомбинантных AAV содержат последовательность AAV2 ITR [93]. Этот серотип проявляет преимущественный тропизм к гладкой мускулатуре, скелетным мышцам, ЦНС, печени и почкам [94]. Hong et al. объединили вектор AAV2 с промотором EF-1α и ввели его через портальную или хвостовую вену, чтобы определить терапевтическую целесообразность его применения при GD [64]. Хотя распределение вектора, экспрессия GCase и активность GCase различались в зависимости от типа ткани, времени и способа доставки, у всех обработанных мышей наблюдалось значительное повышение уровня активности GCase в печени, селезенке и легких в течение двух-шести недель после инъекции. Однако через 20 недель после инъекции активность начала снижаться, причем активность GCase в легких упала до исходного уровня. У обработанных мышей не наблюдалось признаков токсичности или аномального поведения, что свидетельствует о многообещающем профиле безопасности этого рекомбинантного вектора AAV2. Несмотря на доказанную эффективность, долговечность вектора не была установлена, и Hong и др. предположили, что серотип AAV8 был бы более оптимальным вариантом для GD из-за его более сильной экспрессии в печени [64].

Впоследствии Marshall и др. сравнили эффективность серотипа AAV2 с псевдотипом AAV2/8 [63]. Псевдотип AAV2/8 представляет собой химерную упаковочную плазмиду, в которой капсид AAV2 удален, а ген AAV2 слит с капсидом AAV8. Этот псевдотип был разработан, чтобы воспользоваться преимуществами хорошо изученной долговечности серотипа AAV2, а также иммунологическими особенностями и большим тропизмом AAV8 к печени [95]. Marshall и др. сконструировали свои векторы с промотором DC172, который обеспечивал значительно более высокую экспрессию печеночно-ограниченного трансгена GCase, чем промоторы CMV или DC190. Этот тканеограниченный промотор снижает риск вне-целевых эффектов и нежелательного иммунного ответа хозяина. Оба вектора продуцировали сверхфизиологические уровни GCase, которая выделялась в системную циркуляцию и нормализовала уровень GluCer у обработанных мышей после внутривенного введения. Однако вектор AAV2/8 был в 50-100 раз эффективнее вектора AAV2, что указывает на то, что серотип AAV8 действительно больше подходит для GD [63].

Затем та же группа протестировала псевдотипированный вектор AAV8 с промотором DC172, который вводили внутривенно пред-симптоматическим и симптоматическим мышам. У до-симптоматических мышей McEachern и др. обнаружили сверхфизиологические уровни GCase в сыворотке и печени и 50 % от нормального уровня в селезенке и легких. Эти данные сопровождались нормальным уровнем GluCer и отсутствием клеток Гоше, что указывает на то, что вектор способен предотвратить развитие патологии GD. У старых симптомных мышей также были достигнуты сверхфизиологические уровни GCase, хотя и дозозависимым образом. Даже самой низкой испытанной дозы было достаточно, чтобы устранить накопление и хранение GluCer. В обеих группах улучшение уровня GCase сохранялось в течение как минимум шести месяцев, что свидетельствует о долгосрочной эффективности вектора [66].

Для определения эффективности генотерапии при НGD Massaro и др. разработали вектор AAV9 с промотором человеческой β-глюкуронидазы (GUSB) [47]. Было показано, что AAV9 преодолевает BBB и обеспечивает широкую экспрессию в нейронах, а также в печени, сердце и скелетных мышцах [96]. У мышей с НGD которым вводили препарат in utero, в течение 35 дней не развивались поведенческие симптомы, нейровоспаление, потеря нейронов или признаки хранения. Более долгосрочный анализ показал, что мыши, получившие инъекцию in utero, были нормальными и фертильными на 70-й день. Однако к 100-му дню эти мыши хуже справлялись с двигательными заданиями, весили меньше, чем однопометники дикого типа, и демонстрировали более высокую, чем обычно, активацию микроглии и астроглиоз. Активность GCase и уровень GluCer были сходны с диким типом, хотя были обнаружены более высокие уровни других гликосфинголипидов. Таким образом, этот вектор AAV9 был эффективен для предотвращения неонатальной гибели и задержки появления симптомов, но, по-видимому, терял свою эффективность на более поздних стадиях развития. Massaro и др. также исследовали полезность своего вектора при внутривенном или внутрибровентрикулярном введении новорожденным. Никаких поведенческих изменений или потери веса у мышей с НGD не наблюдалось в течение как минимум 180 дней, независимо от способа введения. Супрафизиологические и физиологические уровни GCase наблюдались в различных областях мозга. В нескольких областях мозга мышей, получавших внутривенную инфузию, наблюдались признаки потери нейронов и истончения коры. В висцеральных органах оба способа доставки значительно повышали уровень GCase, причем внутривенное введение предотвращало спленомегалию и развитие клеток Гоше. Однако интрацеребровентрикулярное введение не способствовало развитию висцеральной патологии, несмотря на повышение уровня GCase. Таким образом, хотя вектор AAV9 был способен предотвратить неонатальную летальность во всех случаях, он был наиболее эффективен в отношении неврологических и висцеральных симптомов при постнатальном внутривенном введении [50].

Du et al. испытали вектор AAV9, экспрессирующий мышиный Gba1 под управлением CMV-промотора, на мышах с GD вызванной тамоксифеном. Группа вводила конструкцию за 15 и 30 дней до индукции тамоксифеном, чтобы достичь пика экспрессии до появления симптомов, так как спад после введения тамоксифена происходит слишком быстро, чтобы вектор смог достичь эффективного уровня экспрессии. Введение вектора за 15 дней до индукции тамоксифеном не показало терапевтического эффекта, лишь продлив выживание на один-два дня. Однако внутривенное введение вектора за 30 дней до индукции тамоксифена существенно увеличило продолжительность жизни до 14 раз по сравнению с не-лечеными мышами и значительно улучшило двигательное поведение. Активность GCase значительно повышалась в мозге, печени и селезенке, а токсических эффектов не было обнаружено даже при самой высокой дозе. Однако задержка в трансдукции привела группу к выводу, что этот вектор не является целесообразным подходом для GD2 [69].

Du et al. также разработали вектор AAV9, направленный именно на nGD, стимулируя экспрессию Gba1 с помощью нейрон-специфического промотора Synapsin 1 (hSyn1) у мышей, у которых ген Gba1 был удален только в нейронных и глиальных клетках. Вектор вводили внутрибрюшинно до появления симптомов, что позволило обеспечить нормальный набор веса и удвоить продолжительность жизни мышей, прошедших лечение. Активность GCase была значительно повышена в коре головного мозга мышей, подвергшихся лечению nGD, по сравнению с не-лечеными, хотя печень и легкие не были затронуты. Потеря нейронов, астроглиоз и микроглиальная активация также уменьшились, но не полностью. Таким образом, вектор AAV9-hSyn1 способен ослабить, но не предотвратить поражение мозга, не затрагивая при этом висцеральный аппарат. Более того, только самая высокая доза, которая была протестирована, оказалась эффективной, что указывает на то, что вектор AAV9-hSyn1 требует относительно больших доз, что может снизить профиль безопасности этой конструкции [69].

Massaro et al. также протестировали одноцепочечный вектор AAV9-hSyn1, содержащий пост-транскрипционный регуляторный элемент (WPRE) вируса гепатита глухаря, для экспрессии человеческого GBA1. В мозге вектор был специфичен для нейронов, а экспрессия была обнаружена также в нескольких висцеральных органах. Вектор был введен мышиной модели nGD в день рождения, что позволило продлить жизнь и обеспечить нормальный набор веса без признаков нейротоксичности. По сравнению с контрольной группой дикого типа у мышей, получавших лечение, наблюдалось сходное двигательное поведение, уровень гликосфинголипидов и нейровоспалительных маркеров в мозге в возрасте 60 и 66 дней. Активность GCase в мозге обработанных мышей составляла около 68 % от дикого типа, но эта разница не была существенной. В отличие от конструкции AAV9-GUSB, вектор AAV9-hSyn1 Massaro и др. полностью предотвратил потерю нейронов и сохранил толщину коры. Вектор AAV9-hSyn1 также улучшил висцеральную патологию, предотвратив спленомегалию и накопление клеток Гоше в печени, селезенке и сердце. Таким образом, эта конструкция показала перспективность для лечения обеих нейронопатических форм GD [70].

Несколько факторов могли повлиять на расхождение результатов исследований Massaro et al. и Du et al. Например, Massaro et al. испытали в 8 раз большую дозу препарата и вводили его мышам в более раннем возрасте [70]. Кроме того, было продемонстрировано, что WPRE усиливает экспрессию трансгенов в одноцепочечных векторах AAV, что, вероятно, также способствовало большей эффективности по сравнению с вектором, созданным Du et al [97].

В настоящее время существует несколько активных клинических испытаний генотерапии для лечения GD. Первое (GALILEO-1), «Исследование генной терапии у пациентов с болезнью Гоше 1 типа» (NCT05324943), проводимое компанией Freeline Therapeutics, предполагает введение участникам ssAAV, направленного на печень, в виде однократной внутривенной инфузии. Группа создала 37 конструкций GBA1 AAV, которые при введении мышам RC-04-26 привели к активному поглощению GCase клетками селезенки, костного мозга и легких [98]. На данный момент о результатах исследования на пациентах не сообщалось. Еще одно активное клиническое исследование, «Клиническое испытание PR001 в фазе 1/2 у младенцев с болезнью Гоше 2 типа (PROVIDE)» (NCT04411654), проводится компаниями Prevail Therapeutics и Eli Lilly & Company. В рамках этого испытания LY3884961, AAV9-конструкция, кодирующая GBA1 дикого типа, вводится внутрикожно младенцам с болезнью Гоше 2 типа, получающим предварительную терапию метилпреднизолоном и сиролимусом. Одновременно принимается пероральный преднизон. Исследование направлено на оценку иммуногенности AAV9 и измерение уровня GCase в крови и спинномозговой жидкости. На данный момент результаты не сообщаются. Те же компании также начали исследование фазы 1/2 по сравнению с заместительной ферментной терапией для лечения GD1 (NCT04145037 PROCEED) с внутривенным введением своей конструкции. Исследования по оценке эффективности и безопасности генной терапии аутологичных гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) с использованием лентивирусного вектора для GD1 и GD3 (NCT05815004) компании Avrobio были недавно добровольно прекращены, причем не по причинам безопасности или медицинским показаниям. Однако результаты, полученные от нескольких пациентов, завершивших 52-недельное клиническое исследование, показали низкое количество копий вектора на клетку, небольшое уменьшение размеров селезенки и печени, незначительное снижение уровня глюкозилсфингозина, отсутствие изменений в уровне гемоглобина и тромбоцитов, а также минимальное повышение активности фермента GCase, которое со временем снизилось.

4. Будущие направления генной терапии болезни Гоше При разработке генной терапии GD основное внимание уделялось адено-ассоциированным вирусным векторам из-за их относительно низкого риска иммуногенности и стабильной экспрессии гена-мишени. Хотя стабильная экспрессия целевых генов в нервной системе является наиболее важным фактором для разработки AAVs для лечения НGD также желательно экспрессировать GBA1 системно для лечения патологии в висцеральных органах. Поскольку комбинация вектора серотипа AAV9 с конститутивным промотором (например, GUSB) отвечает критериям неврологической и висцеральной экспрессии, эта комбинация широко используется в клинических испытаниях генотерапии для лечения неврологических расстройств [99] и других НЗС [100], а также в доклинических испытаниях для лечения GD [50,70]. Напротив, повсеместная экспрессия AAV9 может привести к нежелательным побочным токсическим эффектам вне цели [101]. Чтобы преодолеть это ограничение, были разработаны другие серотипы, такие как AAVrh10. Было показано, что эти серотипы усиливают экспрессию трансгенов в центральной нервной системе при меньших иммуногенных побочных эффектах по сравнению с AAV9 [102]. Однако для анализа их эффективности в лечении НGD требуются дальнейшие испытания.

Большинство AAV, используемых в доклинических испытаниях, разработаны на основе генома одноцепочечной ДНК (ssAAV). Время достижения пика экспрессии для этих векторов ограничено, поскольку для начала экспрессии генов их необходимо преобразовать в двухцепочечную ДНК, что может представлять трудности для успешного лечения форм GD симптомы которых развиваются перинатально [103]. Преобразование ssAAV в их двухцепочечные аналоги также может снизить эффективность вектора. В качестве альтернативной конструкции AAV был предложен самокомплементарный вектор (scAAV), содержащий геном с инвертированным димерным повтором, который сворачивается в дсДНК без помощи молекул синтеза ДНК. Эти векторы оказались весьма эффективными при трансдукции различных типов тканей, включая нервную, и позволили обойти ограничения, связанные с преобразованием ssAAV. Размер векторной конструкции в scAAV должен быть уменьшен примерно до 2500 пар оснований, чтобы димерные повторы не превышали ограничений по размеру нормальной емкости упаковки AAV (примерно 4700 нуклеотидов); таким образом, две половины scAAV являются комплементарными. Эффективность трансдукции scAAV следует учитывать при разработке векторов для будущих исследований генотерапии в GD [103].

При разработке эффективной конструкции необходимо также учитывать способ введения и время доставки вектора. Интрацеребровентрикулярная инъекция может быть самым надежным методом преодоления BBB, но эта процедура рискованна и инвазивна и может привести к неравномерному распределению вектора. Системное введение, таким образом, является более безопасным и предсказуемым, но эти способы обычно приводят к снижению экспрессии вектора и маркировки генов, что может снизить эффективность [104].

Для обеспечения успешных клинических исследований генотерапии необходимо провести более тщательные доклинические испытания, чтобы установить эффективность и безопасность различных аденоассоциированных вирусных векторов, а также их вариаций (включая scAAVs и AAVrh10). Кроме того, необходимо провести продольные исследования, чтобы установить продолжительность адекватной экспрессии GBA1. Это может показать необходимость периодических дополнительных инъекций вектора или необходимость дополнения других методов лечения, таких как SRT или ERT.

Хотя AAV не вызывают значительной инфекции без помощи вторичного вирусного хозяина, они все же могут вызвать непредсказуемый иммунный ответ по целому ряду причин. Антитела к предыдущей инфекции, вызванной AAV или аденовирусами, могут снизить ответ на терапию или полностью предотвратить ответ, что может быть опасно для пациента [105]. Предшествующая аденовирусная инфекция сходным серотипом аденовируса может привести к сильному иммунному ответу после лечения. Это может привести к серьезным осложнениям, включая менингит, энцефалит и, в редких случаях, смерть. На иммуногенность также может повлиять инсерционный мутагенез, который может исключить генотоксичность [106]. Имеются тревожные сообщения о генотоксичности, приводящей к развитию гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) как в моделях млекопитающих, так и у людей [107], несмотря на то, что большинство случаев у людей являются эписомальными и доброкачественными. Таким образом, во избежание канцерогенных последствий крайне важно продумать дизайн вектора с учетом возможных нежелательных интеграций в геном хозяина [101]. Одним из побочных эффектов, который наблюдался в клинических испытаниях генотерапии AAV при других неврологических заболеваниях, является тромботическая микроангиопатия, связанная с иммунной активацией, которая приводит к сосудистым патологиям и может привести к ишемии мозга и других органов [99]. Эту проблему можно решить, рассмотрев альтернативные пути введения AAV, такие как интратекальные инфузии (intra-CSF), которые могут снизить доступность циркулирующих AAV [99].

Лечение GD2 представляет особую сложность, поскольку промежуток времени между моментом постановки диагноза и необратимым неврологическим повреждением может быть очень мал. Однако кампании по скринингу новорожденных позволяют выявлять случаи заболевания до появления симптомов, что может стать залогом достаточно раннего лечения, способного кардинально изменить течение болезни. Однако остается вероятность того, что необратимое повреждение ЦНС при GD2 уже началось в пренатальный период, поскольку повышенный уровень глюкозилсфингозина был зафиксирован на ранних сроках беременности [108]. Тем не менее, мы сохраняем осторожный оптимизм в отношении того, что вирусная генотерапия может быть использована для облегчения симптомов по крайней мере некоторых форм нейронопатического GD. Эти методы лечения должны быть тщательно изучены и разработаны для улучшения исходов для людей с НGD.

Существуют некоторые этические проблемы, связанные с использованием генотерапии у молодых пациентов. Пока еще недостаточно клинических данных, чтобы сделать вывод о том, что эти методы генной терапии полностью обратят вспять или излечат прогрессирование и проявления болезни. Таким образом, они могут лишь частично лечить заболевание пациента, что потенциально требует очень больших затрат [100]. Частичная терапия GD2 может продлить, но не предотвратить течение нейродегенерации. Кроме того, пациентам может потребоваться продолжение дополнительной дорогостоящей терапии. Таким образом, риск минимального улучшения качества жизни пациента важно учитывать и продолжать изучать в ходе текущих доклинических и клинических испытаний. Однако есть указания на многообещающие результаты вирусной генотерапии при других LSDs [100]. Таким образом, мы считаем, что дальнейшая разработка и оценка усовершенствованных векторов генной терапии, способов введения и оптимизации конструкций в конечном итоге может принести значительную пользу пациентам со всеми формами GD.