Рак печени, включающий гепатоцеллюлярную карциному (HCC), занимает шестое место среди наиболее часто встречающихся онкологических заболеваний и является третьей ведущей причиной смертности от рака во всем мире [1]. Хирургическая резекция, трансартериальная химиоэмболизация, трансплантация печени и радиочастотная абляция являются эффективными методами лечения HCC на ранних стадиях. Однако диагноз HCC часто ставится уже при прогрессировании заболевания, что ограничивает возможности для лечения прогрессирующих стадий [2-4]. Кроме того, их не-специфическое воздействие на раковые клетки имеет широкий спектр побочных эффектов. В течение нескольких месяцев у пациентов, получающих эти препараты, развивается резистентность, что приводит к необходимости перехода на терапию второго ряда, такую как regorafenib, pembrolizumab, nivolumab и cabometyx. Учитывая эти недостатки, внедрение генотерапии (ГТ) при HCC становится привлекательной альтернативой [5].

Пациенты, страдающие HCC, остро нуждаются в новых терапевтических подходах, и ГТ представляется интересным направлением, обладающим значительным потенциалом, обусловленным прежде всего особенностями кровообращения печени. Примечательно, что печень в основном кровоснабжается за счет воротной вены, и лишь 25 % приходится на печеночную артерию. В отличие от этого, опухоли HCC получают более 95 % кровоснабжения из печеночной артерии [6, 7]. Следовательно, в данном контексте введение генных терапевтических препаратов имеет уникальное преимущество. Генотерапия, обычно сдерживаемая трудностями в достижении локализованных в опухоли концентраций, достигает повышенной специфичности для HCC благодаря прямому внутри-артериальному введению в печень. Более того, интеграция этого подхода с транс-артериальной химиоэмболизацией, хорошо зарекомендовавшей себя в лечении HCC, позволяет увеличить степень доставки терапевтической нагрузки к месту опухоли [8]. Хотя печень является оптимальной мишенью благодаря своим ярко выраженным сосудистым характеристикам, для преодоления проблем, присущих доставке генов, были исследованы различные векторы доставки [9]. Многочисленные альтернативные вирусные векторы показали себя перспективными для ГТ при HCC. Тем не менее, адено-ассоциированный вирус (AAV) является хорошо зарекомендовавшим себя и широко признанным вектором доставки генов для лечения заболеваний, связанных с печенью [9]. Векторы AAV обладают значительными преимуществами благодаря редкой интеграции генома и минимальной генотоксичности [10]. AAV2, 5, 8, 9 и 3B используются в генной терапии, направленной на печень человека, на основе их естественного тканевого предпочтения (тропизма), в то время как AAV2, 9, rh10 и rh8 вводятся локально или внутривенно для терапии, затрагивающей центральную нервную систему (ЦНС). В настоящее время доклиническое применение векторов AAV, предназначенных для ГТ печени и ЦНС, также наблюдается в контексте злокачественных новообразований, происходящих из печени или ЦНС [11]. Векторы AAV почти всех серотипов демонстрируют эффективное накопление в печени при внутривенном введении благодаря присущему им сродству к печени (печеночному тропизму) [12]. AAV серотипа 3 является мощным выбором для эффективной доставки генетического материала в клетки рака печени человека. Это связано с тем, что AAV3 использует рецептор фактора роста гепатоцитов человека в качестве ко-рецептора для прикрепления к этим клеткам и проникновения в них. Следовательно, векторы AAV3 перспективны для применения в GT рака печени. Кроме того, хотя векторы на основе AAV8 демонстрируют заметную 10-100-кратную эффективность при трансдукции печени мышей по сравнению с векторами на основе AAV2 или AAV5, значительные доклинические и клинические данные свидетельствуют о том, что векторы на основе AAV8, широко используемые в современной клинической практике, не являются эффективными и избирательными мишенями для первичных гепатоцитов человека. Кроме того, результаты, полученные на доклинических моделях, не позволяют предсказать их эффективность в клинических сценариях на людях [13, 14]. Кроме того, серотип AAV6, адаптированный для иммунотерапии рака на основе дендритных клеток (DCs), представляет собой перспективную стратегию эффективного воздействия на модели рака и его лечения [15]. Примечательно, что почти все природные капсиды AAV демонстрируют адекватную способность трансдуцировать печеночную ткань после системного введения. Таким образом, рекомбинантные аденоассоциированные вирусы (rAAV) представляют собой надежную платформу для точного воздействия на печень, открывая возможности для лечения целого ряда заболеваний, включая HCC, гемофилию А и В, семейную гиперхолестеринемию, синдром Криглера-Наджяра и дефицит орнитин-транскарбамилазы [16].

Будучи зависимым парвовирусом, AAV не обладает необходимыми генами, требуемыми для репликации и экспрессии его генетического материала. Выполнение этих важнейших функций обеспечивается генами РНК аденовирусов (Ad) E1, E2a, E4 и VA [17, 18]. Геном AAV состоит из одноцепочечной ДНК, в которой размещены четыре узнаваемые открытые рамки считывания (ORF). Начальная ORF кодирует четыре гена репликации (Rep), названные в соответствии с их молекулярными массами: Rep40, Rep52, Rep68 и Rep78 [19]. Следующий ORF - это ген Cap, отвечающий за кодирование трио вирусных капсидных белков: VP1, VP2 и VP3. Эти белки соединяются в соотношении 1:1:10 для построения икосаэдрического белкового капсида, состоящего из 60 субъединиц [19]. Третий и четвертый ORF состоят из вложенных субгеномных мРНК, причем третий из них назван белком, активирующим сборку (AAP). AAP участвует в транспортировке капсидных мономеров в нуклеолу, где происходит сборка капсида [20]; также существует недавно признанный мембран-ассоциированный белок-акцептор (MAAP), чья точная функция еще не до конца выяснена [21]. 4,7-килобазный геном ограничен 145-нуклеотидными инвертированными терминальными повторами (ITRs) на обоих концах генетического материала (рис. 1). ITRs выступают в качестве само-направляющихся структур на протяжении всего процесса репликации, а также служат сигналом для упаковки, опосредованной Rep [22].



figure 1 A Genome structure of wild-type AAV and recombinant AAV. Wild-type AAV genomes consist of inverted terminal repeats (ITRs) that flank two open reading frames (ORFs), rep and cap. To generate recombinant AAV, the rep and cap genes are deleted between the ITRs, followed by the insertion of a transgene of interest at the deletion site. In trans, the rep and cap functions are implemented when the viral vector is manufactured. Rep58 and Rep68 are encoded by the p5 promoter, whereas Rep52 and Rep40 are encoded by the p19 promoter as part of the structure of the wild-type AAV genome. The assembly-activating protein (AAP), VP1, 2, and 3 are all translated from the p40 transcript encoded by the cap gene. Recombination is possible between AAV vectors carrying DNA sequences that are homologous to a particular chromosomal site and the corresponding genomic locus. loxP (locus of X-over P1) is a 34-bp site located on the bacteriophage P1. The site comprises an 8-base asymmetric sequence, variable except for the middle two bases, situated between two sets of 13-base symmetric sequences. The bacteriophage P1 life cycle depends on LoxP sites, which are essential for phage genome integrity and facilitating phage integration into the bacterial chromosome at the loxB target site (approximately every 90 kbp) [23,24,25,26]

Всего существует 13 серотипов AAV (от AAV1 до AAV13), а также множество дополнительных вариантов, происходящих от человека, других приматов и различных видов млекопитающих. Эти варианты были модифицированы и использованы в качестве векторов [27]. Кроме того, из библиотек ДНК или стратегических разработок был выбран целый ряд химерных капсидов, обладающих улучшенными характеристиками и доведенных до клинических испытаний. В настоящее время обнаружено более 100 изолятов AAV. В коллекции AAV человека и не-человеческих приматов (NHP) зарегистрировано 13 серотипов, которые объединены в шесть филогенетических кладов, определяемых их VP-последовательностями и антигенной реактивностью. Примечательно, что AAV4, AAV5, AAV11 и AAV12 являются клональными изолятами в рамках этой классификации. AAV1 и AAV6, относящиеся к кладу А, демонстрируют шесть различий среди 736 аминокислот VP1 (с пятью аминокислотами в VP3), что делает их антигенно перекрестно-реактивными. Другие представители различных кладов включают AAV2 (клада B), гибрид AAV2-AAV3 (клада C), AAV7 (клада D), AAV8 и AAV10 (клада E) и AAV9 (клада F) [28].

В зависимости от серотипа AAV проявляют предпочтение к определенным органам и тканям организма. Различные серотипы AAV демонстрируют различия во многих аспектах, изучаемых в контексте HCC. Исследования в этой области в основном сосредоточены на моделях подкожных ксенотрансплантатов, с особым вниманием к серотипам AAV2, AAV3, AAV6, AAV8 и AAV9 [29-32]. В дальнейшем каждый серотип будет рассмотрен отдельно и подробно.

AAV2 - наиболее изученный серотип. Изначально он был идентифицирован в 1965 году и появился как непреднамеренное присутствие во время приготовления симулянта Ad [33]. Тем не менее, первичный рецептор AAV2 сам по себе был недостаточен для эффективного проникновения в клетки. Поэтому было выявлено несколько ко-рецепторов, включая интегрины αVβ5 и α5β1, рецептор ламинина (LamR), рецептор фактора роста гепатоцитов (HGFR), рецептор фактора роста фибробластов человека 1 (FGFR1) и CD9 [34]. Рекомбинантные капсиды AAV2 подвергаются различным пост-трансляционным модификациям (PTM), включающим убиквитинирование, SUMOилирование, фосфорилирование и многосайтовое гликозилирование [35]. Отобранные экспрессионные кассеты инкапсулируются в различные капсиды AAV, которые нацелены на разные ткани. Обычные капсиды обычно получают от приматов и человека, а также из других природных источников. Исторически сложилось так, что из одиннадцати основных серотипов (AAV1 - AAV11), которые были клонированы на сегодняшний день, AAV2 был наиболее тщательно охарактеризован. Широко распространено мнение, что его упаковка и возможности трансдукции достаточно безопасны и эффективны. Псевдотипированные векторы, которые изменяют тканевой тропизм вектора путем инкапсуляции ITRs одного серотипа в капсид другого серотипа, часто используют его в качестве структурной основы [36]. Создание и оценка библиотек вариантов AAV стало мощным методом для поиска новых капсидов, которые могут быть использованы в ГТ. Огромное разнообразие популяций требует мультиплексного получения библиотек; этот процесс включает трансфекцию клеток, содержащих коллекцию ITR-содержащих вариантов плазмид для создания вирусной библиотеки. Эффективность этой процедуры может быть скомпрометирована перекрестной упаковкой и мозаицизмом, которые возникают, когда частицы состоят из капсидных мономеров и геномов, полученных от различных членов библиотеки. Распространенность перекрестной упаковки и мозаицизма в упрощенных, минимальных библиотеках изучается в исследовании, проведенном учеными с использованием новых анализов, специально разработанных для оценки состава и упаковки капсида [37]. Явления мозаицизма и кросс-упаковки (также известные как кросс-типирование) в AAV способствовали инкапсуляции вирусного генома одного серотипа в капсид другого. Широкий тканевый тропизм векторов AAV-2 был существенным недостатком безопасности и специфичности, так как после введения вектора была возможна трансдукция в нецелевые ткани. В последних исследованиях было показано, что кросс-упаковка векторов AAV-2 на разные серотипы повышает эффективность трансдукции. По сравнению с AAV-2, кросс-упаковка геномов AAV-2 в капсиды AAV-1, AAV-3 и AAV-4 увеличивала экспрессию генов в скелетных мышцах в 900, 30 и 3 раза, соответственно. AAV-9 демонстрирует сопоставимый с AAV-2 профиль широко распространенной трансдукции, но при этом обладает значительно более высокой эффективностью. Таким образом, использование векторов AAV-2, содержащих капсид AAV-9, потенциально может вызвать устойчивую трансдукцию в клетках. Дополнительный подход к повышению специфичности заключается в выборе промотора, который по своей природе стимулирует экспрессию определенного гена в ткани-мишени [38]. Антигенность и тканевой тропизм - характеристики вирусных частиц, определяемые геном капсида. Несмотря на значительную гомологию и идентичность капсидных генов, инфекционность AAV1 и AAV2 в мышцах заметно различается. Гладкие мышцы, скелетные мышцы, ЦНС, печень и почки - все они являются мишенями тропизма AAV2 [39]. Кроме того, AAV2 демонстрирует удивительное сродство к гепатоцитам [40]. В свете недавних клинических успехов в области ГТ AAV стали привлекать повышенное внимание как векторы для терапевтической доставки генов. Хотя прототипичный AAV2 продемонстрировал эффективную трансдукцию клеточных линий, полученных из гепатоцитов человека, in vitro, его еще предстоит превратить в эффективный вектор для ГТ, направленной на печень in vivo. Эти результаты совпадают с данными, полученными на мышах Fah - / - /Rag2 - / - /Il2rg - / - (FRG), которым пересаживали человеческую печень, что указывает на не-оптимальную функциональность AAV2 в этой модели ксенотрансплантата. Исследователи продемонстрировали, что естественные гепатотропные последовательности капсида AAV были извлечены из первичных образцов человеческой печени. Мутации капсида, которые, вероятно, были случайно приобретены во время размножения в культуре ткани, как показало исследование, снижают внутренний печеночный тропизм природного AAV2 и родственных изолятов AAV печени человека. Аминокислотные модификации, вызванные этими мутациями, повышают сродство к гепаран-сульфатному протеогликану (HSPG), основному клеточному рецептору, который способствует инфицированию гепатоцитов человека AAV2. Для облегчения прикрепления AAV2 капсидные остатки R484, R487, K532, R585 и R588 взаимодействуют с отрицательно заряженной полисахаридной цепью гепарансульфата. Адаптация к культуре ткани, наблюдаемая при размножении in vitro природных вариантов AAV, привела к снижению тропизма к гепатоцитам человека. Уменьшив связывание AAV2 с HSPG, реадаптация in vivo прототипичного AAV2 у мышей FRG с гуманизированной печенью восстановила присущий AAV2 печеночный тропизм. Результаты этого исследования опровергают гипотезу о том, что для проникновения AAV2 в гепатоциты человека требуется высокое сродство к HSPG. Вместо этого они указывают на то, что естественные капсиды AAV, происходящие из печени человека, могут быть более продуктивными, чем адаптированные к культуре AAV2, для применения в ГТ, нацеленных на печень [41, 42].

Наиболее эффективным методом трансдукции первичных человеческих гепатоцитов in vitro и «гуманизированных» мышей in vivo является использование векторов AAV серотипа 3 (AAV3). Это позволяет предположить, что векторы AAV3, экспрессирующие человеческий фактор свертывания IX (hFIX), потенциально могут служить более эффективной альтернативой для клинической ГТ гемофилии В. Исследователи развили эти открытия в настоящей работе и создали вектор AAV3 с оптимизированной последовательностью кДНК hFIX, помещенной между двумя ITR AAV3 и небольшим, но мощным промотором, направленным на печень. Этот вектор производит терапевтическое количество hFIX in vivo у пациентов с гемофилией B и у «гуманизированных» мышей, когда он заключен в капсид AAV3. В результате совместных исследований был создан вектор AAV3, который, как ожидается, будет клинически эффективен для лечения гемофилии B с помощью ГТ при более низких дозах вируса, не требующих иммунной супрессии [43]. Как и AAV2, AAV3, выделенный из человека, использует в качестве рецепторов HSPG, FGFR1, LamR и человеческий HGFR (hHGFR) [44, 45]. Гликозилирование, фосфорилирование и ацетилирование являются PTMs на капсиде rAAV3 [35]. Изначально AAV3 не использовали для ГТ из-за его ограниченной способности к трансдукции в линиях мышиных клеток и in vitro. Однако последующие исследования показали, что использование hHGFR в качестве ко-рецептора заметно усиливает трансдукцию клеток рака печени человека, а также гепатоцитов NHP и человека [46]. Действительно, AAV3 продемонстрировал исключительную эффективность в трансдукции первичных гепатоцитов человека, превзойдя в этом отношении другие серотипы [47]. После выявления особого тропизма AAV3 многие исследования были посвящены повышению эффективности трансдукции векторов rAAV3. Эти усилия включали оптимизацию векторов AAV3 путем модификации капсида, усиления экспрессии hHGFR и модификации функции тирозинкиназы [13, 48].

AAV6 демонстрирует значительное генетическое сходство с AAV1 и AAV2, однако ему был присвоен отдельный серотип. AAV6 имеет серологическую подпись, сходную с AAV1, кодирующую область с 99 % гомологией и несколько участков, сравнимых с AAV2. Таким образом, была выдвинута гипотеза о том, что он является гибридом естественного происхождения, возникшим в результате гомологичной рекомбинации между AAV1 и AAV2. AAV6 был обнаружен в образце Ad человека и, как и AAV1, в качестве основного рецептора прикрепляется к сиалилированным протеогликанам, в основном к сиаловой кислоте со связями a2,3 или a2,6. Он также связывается с гепарансульфатом [49-51]. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) является его ко-рецептором [52]. Единственным наблюдаемым PTM на капсидном белке rAAV6 является ацетилирование [35].

DCs играют важнейшую роль в регуляции адаптивного иммунного ответа, являясь антиген-презентирующими клетками (АПК). Поскольку презентация антигена является важной ролью DCs и только DCs могут вызвать первичный иммунный ответ в покоящихся наивных Т-лимфоцитах, DCs являются особыми APC и были названы «профессиональными» APC. Кроме того, значительное количество исследований было посвящено изучению генетически модифицированных DCs, и было начато множество клинических испытаний I и II фазы для оценки эффективности DCs у пациентов с карциномой. Было продемонстрировано, что различные серотипы векторов AAV могут успешно трансдуцировать различные подмножества DCs; кроме того, обсуждаются потенциальные преимущества противоопухолевой вакцины на основе AAV. Однако для достижения существенного эффекта в качестве противоопухолевой вакцины необходимо дополнительное улучшение специфичности и эффективности трансдукции генов рекомбинантными векторами AAV в DCs [53, 54]. Интерес к rAAV как к возможной вакцине велик благодаря их способности трансдуцировать DCs и вызывать Т-клеточный ответ. Здесь мы показали, что среди всех серотипов и вариаций rAAV2 псевдотип с капсидом 6-го типа (rAAV2/6) обладает самым высоким тропизмом к дендритным клеткам, полученным из моноцитов человека (MoDCs). Было показано, что одно изменение лизина на аланин в капсиде AAV6 препятствует связыванию с гепарином, и это изменение полностью останавливает трансдукцию. В отличие от rAAV2, растворимый гепарин не препятствовал трансдукции MoDCs с помощью rAAV2/6. Дополнительное увеличение трансдукции MoDC было отмечено после замены Tyr-731 в капсиде AAV6, что согласуется с представлением о том, что фосфорилирование остатков тирозина приводит к убиквитинированию капсида во время поглощения. Иммунофенотип MoDCs был лишь незначительно изменен псевдотипированными векторами rAAV2/6, несущими мутацию Y731F; эти клетки сохранили способность стимулировать антиген-специфический клон CD8+ T-клеток. Эти открытия должны способствовать развитию rAAV2/6 в качестве вакцинного вектора [55]. Кроме того, rAAV6 является более эффективным серотипом для трансдукции человеческих DCs и может реагировать на клетки Hep3b [15, 55, 56]. Путем сайт-направленного мутагенеза поверхностно-экспонированных остатков серина (S) и треонина (T), которые играют решающую роль во внутриклеточном трафике векторов AAV, был получен оптимизированный по капсиду вектор AAV6 (AAV6-T492V+S663V). По сравнению с векторами AAV6 дикого типа (WT), этот вектор с двойным мутантом AAV6 показал эффективность трансдукции в моноцитарных DCs (moDCs), которая была примерно в пять раз выше. Было установлено, что усиленная ядерная транслокация AAV6-T492V+S663V коррелирует с повышенной эффективностью трансдукции по сравнению с вектором WT-AAV6. Дальнейшие исследования промотора CD11c выявили ключевые регуляторные компоненты, которые совместимы с экспрессионной кассетой AAV и стимулируют экспрессию EGFP в moDCs. Экспрессия EGFP в moDCs была значительно увеличена путем разработки химерного промотора (chmCD11c), состоящего из функциональных модулей CD11c и усиливающего элемента, полученного из вируса Симиан (SV40). MoDC, трансдуцированные с помощью оптимизированного по капсиду вектора AAV6, несущего человеческий простатоспецифический антиген (hPSA) и CBA (AAV6-T492V+S663V-CBA-hPSA) или chmCD11c (AAV6-T492V+S663V-chmCD11c-hPSA), продуцировали более значительное количество цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) с повышенными цитотоксическими способностями против клеток аденокарциномы простаты человека (LNCaP) по сравнению с ЦТЛ, индуцированными AAV6 дикого типа. Эти исследования в совокупности указывают на то, что оптимизация капсидной и промоторной областей векторов AAV потенциально может служить жизнеспособной стратегией для эффективного воздействия на молекулярно-деструктивные клетки (МDCs) и может стать перспективным инструментом иммунотерапии рака [15].

AAV8, аналогичный AAV7, был открыт в 2002 году на макаках-резусах. AAV8 имеет тот же первичный рецептор, что и AAV2 и AAV3, - LamR [45, 57]. Капсидные белки rAAV8 фосфорилированы, гликозилированы и ацетилированы в результате PTM [35]. Серотипы AAV2, AAV5, AAV8 и AAV9 обычно используются для трансфекции клеток печени. Исследования показали, что AAV8 и AAV9 обладают заметным сродством к клеткам печени, причем AAV8 демонстрирует самую высокую степень гепатофилии. rAAV8 может трансфицировать гепатоциты приматов, собак и грызунов с высокой эффективностью и стабильностью при внутрибрюшинном введении, через портальную или периферическую вену. Исследования показали, что экспрессия целевых генов, опосредованная AAV8, в печени примерно в 10-100 раз выше, чем у других серотипов [58]. Эта эффективность превосходит почти все различные серотипы AAV в различных моделях, включая мышей, собак и NHP [59-61]. Ингибиторы протеасомы - это класс небольших молекулярных соединений, предназначенных для избирательного блокирования активности протеасом. Это приводит к накоплению убиквитинированных белков, повышению уровня внутриклеточных реактивных форм кислорода и общему снижению презентации комплексов MHCI-пептид. Механизмы деградации белков в клетках направлены на ингибиторы протеасомы, которые действуют, препятствуя β-субъединицам протеасомы 20s. Их основные цитотоксические механизмы включают активацию апоптотических путей, ингибирование путей выживания клеток и усиление стресса ER [62]. Было доказано, что ингибиторы протеасом оказывают значительное влияние на трансдукцию AAV как in vitro, так и in vivo. Исследование поляризованных эпителиев дыхательных путей легких показало, что совместное нанесение трехпептидных ингибиторов протеасом (LLnL) и AAV2 на апикальную поверхность увеличивало уровень экспрессии более чем в 200 раз. Совместное введение трехпептидных ингибиторов протеасом (LLnL или z-LLL) в легкие или печень приводило к заметному увеличению экспрессии. В то же время в скелетных и сердечных мышцах такого усиления обнаружено не было. Наблюдаемый эффект ингибиторов протеасом для усиления трансдукции AAV был задокументирован для различных серотипов и типов клеток [63]. Применение блокаторов протеасом может потенциально повысить уровень трансдукции AAV8 в определенных тканях [64]. В одном из исследований ученые продемонстрировали, что AAV-7 и -8 также демонстрируют ограниченную эффективность при трансдукции эндотелиальных клеток, а ингибирование протеасом значительно повышает уровень экспрессии трансгена. Ингибирование протеасом увеличивает ядерную транслокацию вирионов в обоих случаях. Исследователи также продемонстрировали, что это избирательно для сосудистых типов клеток, поскольку ингибирование протеасомы не влияет на трансдукцию гладкомышечных клеток. Эти результаты были дополнительно подтверждены анализом интактных кровеносных сосудов, который показал, что деградация протеасом является преобладающим фактором, препятствующим трансдукции эндотелиальных клеток векторами AAV [64].

AAV9 был первоначально идентифицирован в образце человека в 2004 году и охарактеризован как новый серотип из-за его отличительных серологических признаков по сравнению с существующими AAV. Однако последующие исследования выявили его тесную связь с кладами, содержащими AAV7 и AAV8 [65]. Основным рецептором для AAV9 является терминальная N-связанная галактоза. Кроме того, AAV9 использует LamR и потенциальный интегрины в качестве ко-рецепторов [66, 67]. Капсид rAAV9 демонстрирует самый разнообразный спектр PTM, включающий ацетилирование, убиквитинирование, фосфорилирование, SUMOилирование и гликозилирование [35]. В большинстве тканей AAV9 демонстрирует лучшие возможности трансдукции клеток по сравнению с другими вариантами AAV. В мышиной модели, включающей системное введение AAV1-9, AAV9 продемонстрировал самое быстрое начало действия, оптимальное рассеивание своего генома и самые высокие уровни экспрессии белка [68]. Используя модель химерной печени человека (табл. 1), исследователи обнаружили, что AAV9 является перспективным кандидатом для переноса генов и в печени человека [69].

Table 1 The inception of prominent AAV isolates within clinical applications of liver-specific GT, encompassing their receptor affinities and tissue selectivity

В rAAV гены Rep и Cap вырезаются и заменяются единицей экспрессии трансгена. В результате единственными последовательностями вирусного генома остаются ITR, которые играют решающую роль в упаковке векторного генома [27]. Процессинг геномов векторов rAAV зависит от клеточного механизма хозяина, включая системы репарации ДНК, для обеспечения стабильной трансдукции. При трансдукции вектора AAV одноцепочечные геномы вектора rAAV являются чертежами для формирования двухцепочечных (ds) линейных мономеров rAAV [16]. Впоследствии эти ds линейные мономеры прогрессируют для создания ds циркулярных мономеров и конкатемеров ДНК под руководством ДНК-полимераз хозяина и путей репарации ДНК. AAV дикого типа (WT) могут сохраняться либо в виде эписомы, либо интегрироваться в геном клетки-мишени. Этому процессу интеграции способствует Rep, который предпочитает определенный локус на хромосоме 19 у человека. Интеграция также может происходить в различных других хромосомных сайтах [74]. В отличие от WT AAV, в ДНК rAAV отсутствует активный процесс интеграции, облегчаемый Rep, и преимущественно сохраняется круговая конкатемерная эписомная конфигурация. Тем не менее, векторы rAAV демонстрируют низкую частоту интеграции в геном клеток-мишеней, причем это явление потенциально направляется эндогенными ферментами, изменяющими ДНК клетки-хозяина. Этот механизм интеграции вызывает опасения относительно возможности генотоксичности в результате интеграции генома rAAV [75].

Онколитические вирусы (OVs) представляют собой новую категорию противораковых препаратов, которые способствуют регрессии опухоли путем избирательной репликации в опухолевых клетках. Они достигают этого путем индуцирования иммуногенной гибели клеток и активации противоопухолевого иммунного ответа хозяина. В настоящее время четыре OVs получили глобальное одобрение для лечения таких распространенных видов рака, как меланома, карцинома носоглотки и глиобластома [76, 77]. Эти результаты послужили толчком к переходу к использованию OVs, в результате чего они превратились из исключительно литических агентов в агенты, стимулирующие противоопухолевый иммунный ответ. Соответственно, эту область теперь правильнее называть «онколитической иммунотерапией». Еще одним новым аспектом OVs является их способность сочетать традиционные и современные методы лечения рака, в частности ингибиторы иммунных контрольных точек (ICI) и препараты, ориентированные на Т-клетки [78, 79]. Успех онколитической вирусная терапии и ГТ зависит от правильного переноса вирусного вектора и точного нацеливания на целевые ткани. Основной проблемой, которая часто снижает эффективность этих методов лечения, является недостаточная трансдукция тканей-мишеней, что приводит к недостаточной экспрессии терапевтического трансгена [80]. Оптимальный кандидат на онколитический вирус должен обладать определенными характеристиками, включая глубокое понимание его биологии и генетики. Выбранный онколитический вирус должен быть иммуногенным, способным вызывать лизис клеток в инфицированных раковых клетках и не иметь потенциала вызывать хронические инфекции или инфекционные заболевания. Кроме того, он не должен обладать способностью встраиваться в геном человека [81]. Например, благодаря наличию тканеспецифичных промоторов экспрессия полезной нагрузки вектора может быть более тонко ограничена конкретными типами клеток (рис. 2). В частности, интеграция рекомбиназы Cre вместе с промотором, специфичным для гепатоцитов, таким как промотор тироксин-связывающего глобулина (TBG), в геном AAV8 может предложить целевую стратегию экспрессии рекомбиназы Cre в гепатоцитах. Было продемонстрировано, что такой подход влияет на клеточный цикл гепатоцеллюлярных клеток и запускает ответ на повреждение ДНК, при этом предотвращая непреднамеренную экспрессию в не-печеночных клетках [82, 83]. В настоящее время клинические испытания показали, что онколитическая терапия AAV приводит к минимальному количеству побочных явлений, что подчеркивает благоприятный профиль безопасности этого подхода [84].



figure 2 Diagram of rAAv transduction pathway. Adeno-associated virus (AAV) is recognized by glycosylated cell surface receptors of the host. This triggers the internalization of the virus via clathrin-mediated endocytosis. AAV then traffics through the cytosol mediated by the cytoskeletal network. Owing to the somewhat low pH environment of the endosome, the VP1/VP2 region undergoes a conformational change. Following endosomal escape, AAV undergoes transport into the nucleus and uncoating. AAV can also undergo proteolysis by the proteasome. There are currently two classes of recombinant AAVs (rAAVs) in use: single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV). ssAAVs are packaged as either sense (plus-stranded) or anti-sense (minus-stranded) genomes. These single-stranded forms are still transcriptionally inert when they reach the nucleus and must be converted to double-stranded DNA as a prerequisite for transcription. This conversion can be achieved by second-strand synthesis via host cell DNA polymerases or by annealing the plus and minus strands that may coexist in the nucleus. Because scAAVs are already double-stranded by design, they can immediately undergo transcription. The viral ITRs present in the rAAV genome can drive inter-molecular or intra-molecular recombination to form circularized episomal genomes that can persist in the nucleus [16]