RP может быть вызван спорадическими мутациями, которые являются наиболее частой причиной заболевания; однако генетическая предрасположенность остается основным фактором риска. В большинстве случаев RP проявляется в трех различных формах наследования: аутосомно-доминантной (ADRP; 15-25 %) [10], аутосомно-рецессивной (ARRP; 5-20 %) [11,12] и Х-сцепленной (XLRP; 10-15 %) [10]. В редких случаях встречаются также дикариотический и митохондриальный типы наследования [13]. В целом, различные генетические фенотипы RP имеют разный прогноз. Например, XLRP характеризуется наиболее тяжелыми симптомами и самым плохим прогнозом [14].

В качестве причин RP были выявлены многочисленные патогенные варианты в более чем 80 генах, что усложняет диагностику, поскольку некоторые гены имеют более одного способа наследования. В данном обзоре эти гены распределены по категориям в соответствии с их наиболее вероятным типом наследования. Большинство генетических вариантов, приводящих к RP, связаны с палочковыми фоторецепторами, в то время как некоторые из них связаны с RPE. К гибели палочковых клеток приводят различные механизмы, включая апоптоз, фототоксическое или фотоокислительное повреждение, стресс эндоплазматического ретикулума (ER), дефектный цилиарный транспорт и дефектный процессинг мРНК. Дегенерация палочковых клеток зрительного нерва изменяет среду сетчатки, что впоследствии приводит к дегенерации колбочковых клеток и RPE [15].

Мутации можно разделить на три типа в зависимости от механизма их возникновения.

Мутации с потерей функции: Эти мутации приводят к тому, что генный продукт утрачивает свою функцию, а одной копии гена оказывается недостаточно для обеспечения нормального фенотипа. Это приводит к состоянию, известному как гаплонедостаточность, которое обычно приводит к аутосомно-рецессивным расстройствам [16]. Например, двойная мутация в гене RPE65 приводит к RPE65-ассоциированному RP. Доминантные мутации, обусловленные гаплонедостаточностью, хотя и встречаются реже, но все же имеют место, например большинство мутаций в PRPF31, гомологе фактора обработки пре-мРНК 31, которые приводят к ADRP.

Мутации с усилением функции: Эти мутации наделяют белок новой функцией, которая может быть токсичной для клеток. Типичный пример - большинство мутаций в гене RHO, который кодирует светочувствительный белок родопсин, участвующий в фототрансдукции. Мутировавшие молекулы родопсина не могут функционировать должным образом, а из-за высокого уровня экспрессии родопсина в фоторецепторах большое количество мутировавших форм может подавлять клеточные механизмы, такие как транспорт или деградация белка [17].

Доминантно-отрицательные мутации: Эти мутации приводят к появлению мутантного белка, который нарушает функцию дикого типа [10]. Например, мутации в гене RP1 [18,19] кодируют специфический для фоторецепторов белок микротрубочек, имеющий решающее значение для организации мембранных дисков [20,21]. В мышиной модели knock-in изменение соотношения мутантного белка p.Gln662* RP1 и белка дикого типа задерживало регенерацию фоторецепторов [22].

Генотерапия подразумевает изменение ДНК в клетках или тканях реципиента для достижения желаемого терапевтического эффекта. Глаз имеет больший потенциал для генотерапии, чем другие органы, из-за простоты инъекционного и хирургического лечения, иммунологических преимуществ и возможности оценить структуру и анатомию сетчатки с помощью не-инвазивных методов [23]. Примечательно, что прогрессирующая дистрофия или дегенерация сетчатки обычно необратима, и успех лечения зависит от наличия живых клеток сетчатки на момент начала генотерапии. Кроме того, одногенный характер RP облегчает разработку генных методов лечения.

В зависимости от типа мутации были изучены три соответствующие стратегии генотерапии (рис. 2).



Figure 2. Flow chart showing the appropriate gene therapy based on the type of mutation.

Улучшени/замена гена: Рецессивная ретинопатия возникает в результате потери функции соответствующего белка, что требует повышения уровня белка для лечения. Поэтому для восстановления нормального фенотипа может быть достаточно добавить дополнительную копию гена дикого типа. Например, трансгенные векторы вводятся в клетки с помощью вирусных векторов или не-вирусных наночастиц, причем наиболее часто используются адено-ассоциированные вирусные векторы (AAV) из-за их высокой эффективности трансдукции и отличного профиля безопасности [24]. Кроме того, для усиления экспрессии генов может использоваться CRISPR-активация (CRISPRa). Примечательно, что комплементарные гены могут оказаться непригодными в случаях, когда клетки чувствительны к уровню продуцируемого белка.

В некоторых случаях доминантно-отрицательных мутаций также рекомендуется использовать только дополнительные гены [25-27]. Это объясняется тем, что увеличение соотношения белков дикого типа и мутантных белков поставит мутантные белки в невыгодное конкурентное положение и тем самым восстановит некоторую степень функциональности. Однако такой подход может лишь облегчить симптомы, но не обязательно обеспечить излечение. Это связано с тем, что даже если мутация проявляется в основном как доминантно-отрицательная, она может оказывать токсическое побочное действие на клетки, которое не смягчается дополнительным включением белка дикого типа [25,28]. Поэтому для лечения доминантно-негативных и gain-of-function мутаций, как правило, необходимо разрушить мутантный аллель на уровне ДНК или РНК, а затем провести генетическое усовершенствование.

Подавление/инактивация генов: Доминантно-отрицательные мутации и мутации с усилением функции проявляются в виде измененных функций белков. Наиболее прямой подход к инактивации генов заключается в подавлении производства аберрантных белков. Для этого разрабатываются молекулы, нацеленные как на мутантный, так и на дикий тип аллеля, что позволяет блокировать производство белка до введения экзогенной копии гена. Примером на уровне ДНК является транскрипционная репрессия с помощью сконструированных ZFP, которые, как было показано, успешно глушат пигмент сетчатки человека [29,30]. На уровне РНК рибозимы [31] могут разрушать целевые РНК, а методы РНК-интерференции (si/shRNA) [32] - снижать трансляцию. Другой подход заключается в специфическом воздействии на мутантные аллели при сохранении дикого типа. На уровне ДНК редактирование генома с помощью относительно новой системы CRISPR/Cas используется для введения целевых двуцепочечных разрывов для аллель-специфической абляции [33,34]. Примерами нарушения или вмешательства на уровне РНК являются рибозимы [35] и антиолигонуклеотиды [36].

Редактирование генов: Это новая захватывающая область в генотерапии сетчатки. Комбинируя методы редактирования генома с гомологичной рекомбинацией, можно специфически исправлять мутации на уровне ДНК. В отличие от стратегий замены генов, редактирование генов навсегда устраняет генетические дефекты в клетках-мишенях. Этот подход особенно применим к аутосомно-доминантным заболеваниям, при которых разрушение генов более эффективно, чем РНК-интерференция. Например, нуклеазы с цинковыми пальцами [37] и система CRISPR/Cas [38] могут вызывать двунитевые разрывы и облегчать рекомбинацию фрагментов донорской ДНК для прямого исправления мутантных генов in situ. Кроме того, технология редактирования оснований обеспечивает эффективный метод редактирования генов in situ.

Вирусные и не-вирусные векторы были оценены на предмет их эффективности в доставке нужных генов в клетки-мишени, пораженные дегенерацией сетчатки. Однако вирусные векторы наиболее популярны и широко используются в терапевтических целях. Это объясняется их высокой эффективностью трансдукции клеток-мишеней, что обеспечивает своевременную экспрессию трансгенов, а также их низкой иммуногенностью, что позволяет избежать иммунного ответа хозяина и продлить время хранения.

Существует три основных вектора на основе вирусов: аденовирус (Ad), адено-ассоциированный вирус (AAV) и лентивирус (LV) [39]. Среди них AAV является наиболее перспективным вектором для генотерапии. Впервые описанный в 1996 году, AAV представляет собой не-развивающийся икосаэдрический вирус с относительно небольшим размером 25 нм [40]. Он обладает рядом важных свойств, таких как непатогенность, низкая иммуногенность, способность трансдуцировать не-делящиеся клетки и поддерживать устойчивый уровень экспрессии терапевтических генов. Векторы AAV нацелены как на делящиеся, так и на не-делящиеся клетки, обладают широкой тропностью и могут инфицировать широкий спектр типов клеток [41,42]. AAV серотипа 2 (AAV2) наиболее часто используется для генной терапии у людей [43]. Терапия AAV-RPE65 (voretigene neparvovec) была одобрена Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США (10169 New Hampshire Ave Silver Spring, MD, USA) в 2017 году и в настоящее время успешно вступила в фазу III клинических испытаний (CHOP/Spark Therapeutics, Philadelphia, PA, USA; www.sparktx.com (дата обращения: 10 июня 2024)) [21,44]. Внутриглазная доставка AAV хорошо переносится человеческим глазом, что подтверждается данными многих испытаний глазной генотерапии [42,45,46]. Liu et al. продемонстрировали, что раннее постнатальное лечение векторами AAV, содержащими как ген hRPE65, так и антиапоптотический ген Bcl-2L10, обеспечивает усиленную и устойчивую защиту сетчатки [47]. Многие генотерапии с использованием AAV-векторов, которые являются безопасными и эффективными, также находятся на стадии доклинической оценки на животных моделях наследственной дегенерации сетчатки ( IRD) [48-53]. Однако основным недостатком AAV является его небольшая емкость упаковки, которая не позволяет переносить гены размером более 5 кб, что ограничивает его использование для доставки больших генов. В настоящее время ученые решают эту проблему с помощью нового подхода, который позволяет экспрессировать полноразмерные трансгенные белки в трансдуцированных клетках путем разделения кодирующей последовательности на разные носители AAV [54]. Этот подход показал, что способность AAV к клонированию может быть увеличена до 14 кб при использовании тройных векторов [55]. Кроме того, было показано, что использование двойных векторов для лечения болезни Stargardt у Abca4-/-мышей улучшает фенотип заболевания [56].

Недавно были разработаны новые инструменты для редактирования генов, позволяющие эффективно редактировать гены in situ. К ним относятся нуклеаза Zn-finger (ZF), нуклеаза TALE, Cas9 на основе bootstrapping CRISPR-ассоциированной РНК и редактирование оснований. Каждая из этих систем способна точно индуцировать двухцепочечные разрывы в определенных геномных локусах и восстанавливать их посредством негомологичного соединения концов, что потенциально может привести к нокауту определенных доминантных мутантных аллелей или исправлению генетических дефектов с помощью донорских ДНК-шаблонов посредством гомологично направленной репарации. Однако перед клиническим применением необходимо тщательно оценить эффекты вне-целевого мутагенеза и длительной экспрессии нуклеаз на терминально дифференцированных фоторецепторных клетках.

Способ введения вектора также играет ключевую роль в определении эффективности доставки генов, а также типа инфицируемых клеток. Для доставки генотерапии в глаз использовались субретинальные инъекции и интравитреальные инъекции, и у каждого метода есть свои преимущества и недостатки. Субретинальная инъекция предполагает введение препарата в субретинальное пространство между фоторецепторными клетками и пигментным эпителием, что предполагает отделение нейроэпителиального слоя сетчатки от пигментного эпителия для формирования субретинального пространства. Однако субретинальное введение требует специальных навыков и сопряжено с риском повреждения нежной ткани сетчатки, предрасполагая к ее отслоению и потенциально вызывая гиперплазию глиальных клеток, дегенерацию фоторецепторов и ухудшение зрительных функций. В отличие от этого, введение препаратов в стекловидное тело посредством интравитреальной инъекции проще в применении и менее рискованно, чем субретинальные инъекции. Доставка препаратов для генотерапии в стекловидную полость глаза очень желательна из-за ее менее инвазивного характера и возможности равномерно распределить генный препарат по сетчатке, что потенциально позволяет воздействовать на большее количество клеток. Однако инъекции в стекловидную полость могут с большей вероятностью вызвать высокий уровень воспаления. Кроме того, поскольку в этом случае может возникнуть гуморальный иммунный ответ против вектора, который, помимо снижения безопасности препарата, может снизить эффективность лечения и предотвратить экспрессию вектора при повторном введении, его следует избегать, если требуется последовательное лечение обоих глаз. Кроме того, инъекции в стекловидное тело легко выводятся из организма, что влияет на эффективность трансфекции. Некоторые векторы не могут достичь наружной части сетчатки, включая RPE и хориоид, из-за внутренней ограничительной мембраны, поэтому трансфекция обычно ограничивается внутренними слоями сетчатки [57].

На долю АДRP приходится примерно 30-40 % всех случаев RP, причем 38 % связаны с генетическими дефектами, нарушающими сплайсинг [57]. Неконтролируемый сплайсинг может приводить к различным заболеваниям человека, однако большинство вариаций сплайсинга ассоциируется с АДRP неизвестной причины [58]. Более 20 различных генов были идентифицированы как причины АДRP, и только некоторые из них оказывают существенное влияние на значительную часть пациентов [58]. Ниже описаны причинные гены, разделенные на наиболее распространенные и редкие (табл. 1).

Table 1. Clinical research on ADRP.

Наиболее распространенным мутантным геном, вызывающим АДRP у людей, является ген RHO с заменой пролина на гистидин в аминокислоте 23 плазмы клеток сетчатки (RHO-P23H) [4]. И наоборот, мутации ретиношизиса представляют собой преобладающую причину ADRP, эффективное лечение или излечение которого остается труднодостижимым [15]. Однако в диагностическом и терапевтическом исследовании Wang и другие [63] обнаружили, что у мышей дикого типа происходит естественная адаптация толщины сетчатки в раннем взрослом возрасте и наблюдается морфологическая компенсация дегенерации фоторецепторов, в основном во внутреннем ядерном слое (INL) сетчатки. Дальнейшее исследование INL сетчатки у RhoP23H/+ мышей выявило отрицательную корреляцию между толщиной INL и наружного ядерного слоя (INL). Кроме того, электроретинография (ЭРГ) показала увеличение соотношения b-волн к a-волнам. Эти результаты подчеркивают непрерывность морфологических явлений в данной модели и позволяют лучше понять дегенерацию сетчатки для будущих исследований.

Cas13X, новый член семейства CRISPR, демонстрирует потенциал в качестве значительного продвижения в терапии редактирования генов. Скрининг in vitro сконструированных одиночных направляющих РНК (sgRNAs), специфически нацеленных на транскрипты мутанта RHO-P23H, для деградации РНК, опосредованной Cas13x, может допускать ряд несоответствий в sgRNAs без существенного влияния на эффективность нокдауна. Yan et al. сконструировали sgRNA для hfCas13X, чтобы специфически нокаутировать транскрипт мутантного родопсина человека RHO-P23H, добившись целевого нокдауна в мышиной модели ADRP, индуцированной избыточной экспрессией RHO-P23H. Таким образом, hfCas13X обладает потенциалом для лечения ADRP, вызванного мутациями RHO и другими генетическими нарушениями [10]. Vasudeva et al. [60] наблюдали различия в клинических поражениях человека в зависимости от типа животной модели, экспрессирующей мутанты родопсина P23H, что создает проблему при оценке патогенетических механизмов. Измененная аутофагия и протеасомная активность считаются эндогенными механизмами для очистки от неправильных форм белков и снижения гибели фоторецепторных клеток [4], что делает их потенциальными мишенями для лечения P23H.

Новые варианты носителей также изучаются медицинскими исследователями в качестве альтернативных подходов к доставке генов. Sp et al. исследовали потенциал доставки с помощью наночастиц (NP) полноразмерного геномного родопсина мыши (gRho) или геномных последовательностей родопсина человека (gRHO) для противодействия основным негативным эффектам мутантного родопсина в клинически значимых гетерозиготных моделях мышей P23H+/- knock-in. Это исследование показало, что у мышей, получавших NP gRho и gRHO, наблюдалось значительное структурное и функциональное восстановление палочковых фоторецепторов, что свидетельствует о перспективном снижении дегенерации фоторецепторов [59].

Методы, снижающие агрегацию сетчатки in vitro, по-видимому, уменьшают дегенерацию сетчатки в мышиных моделях, тем самым устанавливая возможную связь между агрегацией и дегенерацией сетчатки. Кроме того, вмешательства, способствующие правильному сворачиванию мутантного ретиношизиса, такие как усиление реакции теплового шока, использование белков-партнеров или увеличение очистки неправильно сложенных мутантов ретиношизиса через аутофагию или протеасомную активность, показали благоприятный эффект в снижении дегенерации сетчатки у мышей, экспрессирующих мутанты родопсина P23H. Таким образом, терапевтические стратегии, направленные на снижение или предотвращение агрегации белков сетчатки, могут быть жизнеспособными вариантами борьбы с АДRP [59].

В целом RP остается серьезной проблемой. В настоящее время основной подход заключается в использовании новых методов доставки генов, таких как векторы AAV или наночастицы, для генетического усиления или подавления эффекта мутаций, что позволяет клеткам восстановить свои первоначальные функции. Этот принцип широко применяется при лечении мутаций в таких локусах, как P23H и PRPF31, в ADRP. Однако широкий спектр и гетерогенность локусов мутаций при АДRP приводят к высокой степени вариабельности, при этом многие типичные локусы еще недостаточно изучены или все еще тестируются на животных моделях.

Мутации в гене PRPF31 вызывают ADRP (PRPF31-RP), который демонстрирует неполный эпистаз из-за гаплонедостаточности, при которой сниженный уровень экспрессии гена мутантного аллеля приводит к развитию заболевания. В настоящее время не существует эффективного лечения этого заболевания, что делает его главной мишенью для разработки новых терапевтических стратегий.

Знание того, у кого разовьется RP, а кто останется бессимптомным, имеет решающее значение для пострадавших семей. Lisbjerg et al. предположили, что наличие или отсутствие клинических проявлений заболевания у пациентов, несущих патогенный вариант PRPF31, вероятно, связано с экспрессией аллеля PRPF31 дикого типа [64]. В этом исследовании не было обнаружено существенных различий в относительном количественном определении уровня экспрессии мРНК PRPF31 между пациентами с RP11 и NPC, что позволяет предположить, что экспрессия мРНК PRPF31 может варьировать в различных тканях и что цельная кровь не является оптимальной средой для мониторинга экспрессии мРНК PRPF31 [64]. Вариации в экспрессии генов в различных тканях создают значительные трудности при разработке простого клинического анализа. Секвенирование генов остается основным методом диагностики. В генотерапии Rodrigues и др. предположили, что прямое повышение уровня экспрессии PRPF31 в органоидах сетчатки является эффективным и достаточным для предотвращения дегенерации фоторецепторов [65].

Поздняя стадия PRPF31-RP характеризуется необратимой потерей фоторецепторов и значительным ухудшением зрения. На этой стадии генетическое усовершенствование или редактирование генома не могут возродить погибшие фоторецепторы. Однако в качестве перспективных методов восстановления зрения даже после потери фоторецепторов появились альтернативные подходы. Оптогенетика предполагает использование светочувствительных белков для стимуляции оставшихся клеток сетчатки и генерации зрительных сигналов, а клеточная терапия направлена на замену отсутствующих клеток сетчатки. Генно-редактированные клетки обходят фоторецепторы, стимулируя оставшиеся ганглиозные клетки сетчатки, которые посылают сигналы в мозг и восстанавливают зрение. Перспективным направлением терапии может стать побуждение клеток к производству светочувствительных белков с помощью методов редактирования генов, что позволит заменить некротические фоторецепторы для передачи световых сигналов.

Современные исследования направлены на выявление причинных локусов и понимание патогенетических механизмов. Одноаллельные варианты PRPF31 часто связаны с неполным экзантематозным АДRP. Wheway et al. подтвердили патогенность нового варианта PRPF31 c.341T>A, p. Ile114Asn с помощью исследований in vitro. Исследование показало, что компьютерное моделирование структурных эффектов миссенс-вариантов на крио-ЭМ разобранных белковых комплексов может помочь предсказать патогенность новых вариантов в сочетании с исследованиями in vitro и клиническими исследованиями [66]. Определение патогенного статуса этих миссенс-вариантов остается сложной задачей. Другое направление исследований включает изучение локусов и редактирование генов для направленной корректирующей терапии; однако исследования в этой области пока не продвинулись до терапевтических испытаний.

Патогенные варианты гена RP1 часто приводят к производству усеченных белков [66]. Известно, что RP1 вызывает различные заболевания, в том числе значительные дефекты поля зрения в верхней временной зоне и bony spicules, преимущественно в нижнем отделе глазного дна [67]. Пациенты с RP, ассоциированным с вариантом m1, имеют прогрессирующую и тяжелую дегенерацию сетчатки в раннем возрасте [63]. Lazaro-Guevara et al. выявили двух чистых носителей этого варианта среди трех секвенированных случаев RP и трех гетерозиготных индивидуумов с адекватным покрытием локуса RP1. Эти данные свидетельствуют о том, что сочетание информации о родословной с XLC-WGS является экономически эффективным методом выявления патогенных вариантов [61]. Основательная вставка Alu в RP1 является важной причиной аутосомно-рецессивного RP у японских пациентов и может быть пропущена при стандартном целевом повторном секвенировании. Рекомендуется оптимизированный скрининг на эту мутацию, особенно для пациентов с гетерозиготной делеционной мутацией за пределами определенной области в экзоне 4 RP1 [62].

Белки CRX являются важнейшими транскрипционными факторами, обеспечивающими функционирование и выживание фоторецепторов. Мутации в человеческом гене CRX связаны с различными со слепотой заболеваниями - от легкой макулярной дистрофии до тяжелых состояний, таких как врожденный амавроз Лебера (LCA), конусно-стержневая дистрофия (CRD) и RP. Эти заболевания неизлечимы и наследуются в основном по аутосомно-доминантному типу. Дисфункциональные мутантные белки CRX проявляют доминантно-отрицательный эффект, мешая функционированию белков CRX дикого типа. Усиление генов в настоящее время является наиболее перспективной терапевтической стратегией для лечения генетических заболеваний [4] и может стать потенциальным методом лечения CRX-ассоциированной ретинопатии.

Kruczek и др. продемонстрировали, что AAV-опосредованная терапия усиления генов CRX частично восстановила фенотип фоторецепторов и экспрессию генов, связанных с фототрансдукцией, как показало секвенирование одноклеточной РНК. Органоид сетчатки, полученный из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) пациента с доминантной CRX-LCA, несущей мутацию K88N, показал, что дефицит экспрессии зрительного белка является общим фенотипом. Этот недостаток можно устранить с помощью AAV-опосредованного улучшения CRX при врожденной темной дымке [68]. Применение аналогичных терапевтических механизмов, улучшающих память, при RP также может привести к значительным улучшениям.

XLRP, вызванный мутациями в гене RPGR, является наиболее распространенной формой рецессивного RP, составляя около 70 % всех случаев XLRP [68,69]. Ген RPGR кодирует белок, расположенный в основании ресничек фоторецепторного соединения, которое соединяет внутренний слой этих клеток (состоящий из органелл, вырабатывающих необходимые клетке белки и жирные кислоты) с внешним слоем (состоящим из перекрывающихся дисков мембран фоторецепторных клеток, окруженных клетками RPE, ответственными за цикл родопсина, который обусловливает зрение). Считается, что этот белок играет роль в организации микротрубочек и транспорте цилиарного белка. Предыдущие исследования выявили сеть взаимодействий с участием RPGR и предположили, что взаимодействующий с RPGR белок (RPGRIP1) способствует локализации RPGR на прикрепленных ресничках. Когда RPGR связывается с прикрепленными ресничками, он регулирует межклеточный транспорт белков между внутренним и внешним сегментами фоторецепторов и поддерживает правильное положение и концентрацию родопсина [70]. Однако точная функция RPGR остается неизвестной. Патогенные варианты RPGR вызывают целый ряд фенотипов, включая палочко-конусную дистрофию (RCD, также известную как RPGR-ассоциированный RP), раннюю тяжелую дистрофию сетчатки (EOSRD), конусно-шатунную дистрофию CORD, колбочковую дистрофию (COD), макулярную атрофию и синдромальную XLRP.

Многообещающие положительные результаты по безопасности и эффективности, полученные в ходе фазы 1/2 клинических испытаний, поддерживают прогресс терапии замещения гена RPGR при XLRP, повышая ожидания для текущих и предстоящих клинических испытаний фазы 3, которые могут привести к долгожданному одобрению генотерапии RPGR для лечения [70].

Sladen et al. [70] использовали известный метод редактирования генов CRISPR/Cas9 для получения изогенных RPGR-нокаутных (RPGR-KO)-iPSCs. Они дифференцировали RPGR-KO, а изогенные iPSC дикого типа дифференцировали в органоиды сетчатки для выявления клинических векторных конструкций AAV-RPGR. Трансдукция органоидов сетчатки RPGR-KO с помощью AAV-RPGR успешно восстановила экспрессию и локализацию мРНК и белков RPGR в соединительных ресничках палочковых и колбочковых фоторецепторов. Кроме того, обработка AAV-RPGR восстановила локализацию родопсина в органоидах сетчатки RPGR-KO и уменьшила его неправильную локализацию в ONL фоторецептора. Эти результаты дают представление о функциональной эффективности комплементации гена RPGRORF15 в фоторецепторах человека и подтверждают ранее сообщенные положительные результаты исследования I/II фазы с использованием этой векторной конструкции у пациентов с RPGR-ассоциированным ХLRP, которые в настоящее время проходят клинические испытания III фазы [69]. Однако генотерапия сопряжена с рисками, и ее успех зависит от эффективности доставки терапевтического трансгена в целевой тип клеток. Не все случаи доставки генов оказываются успешными, и существуют неизвестные побочные эффекты, о которых сообщалось во время клинических испытаний. Восемнадцать пациентов с генетически подтвержденными мутациями RPGR в Оксфордской медицинской школе были набраны в шесть когорт по три человека в каждой и получали возрастающие концентрации кодон-оптимизированного (co) вектора AAV2 серотипа 8 (AAV8.coRPGR). По мере снижения концентрации вектора у пациентов развивалось легкое послеоперационное воспаление, которое заживало через 6 месяцев после гормональной терапии [71].

С более глубокой молекулярной точки зрения, исследования транскриптома показали, что ген RPGR имеет сложный паттерн факультативного сплайсинга, в результате чего образуется множество транскриптов. Конститутивная изоформа, RPGRex1-19, широко экспрессируется по всему организму, в то время как основная изоформа в сетчатке, RPGR ORF15, использует большую открытую рамку считывания (ORF15) в качестве С-концевого экзона. Все известные мутации, вызывающие заболевания, происходят в изоформе RPGR ORF15. Используя образцы РНК собак и человека, Appelbaum и др. выявили несколько новых линейных РНК-транскриптов, похожих на RPGR ORF15, которые содержали криптические интроны (экзоны) в аннотированном экзоне ORF15 [72]. Результаты, полученные с помощью новой циркулярной РНК RPGR, еще больше подчеркивают структурную сложность области ORF15 RPGR и предлагают потенциальное молекулярное объяснение фенотипической гетерогенности заболевания.

Benson и др. [73] ретроспективно проанализировали серию случаев 66 пациентов с дегенерацией, опосредованной RPGR. У двенадцати пациентов (18,2 %) на цветных изображениях наблюдался блеск сетчатки, который соответствовал аномально широким гиперрефлективным эллипсоидным полосам на оптической когерентной томографии (ОКТ). Три четверти этих пациентов были мужчинами, имели CRD и мутации RPGR на 3'-конце ORF15 [72,74]. Клиническое проявление этих признаков может зависеть от степени дегенерации сетчатки и прогрессирования заболевания. Изменения внешнего вида аномальных наружных полос сетчатки, наблюдаемые на ОКТ-изображениях после длительной темновой адаптации, повышают вероятность активации относительной потери фототрансдукции [75]. Более конкретные критерии для диагностики и лечения заболеваний, связанных с RPGR, все еще изучаются, но данное исследование дает новое представление о связи между морфологическими изменениями и их патологическими последствиями.

Патогенные варианты RPGR и RP2 являются основными причинами XLRP, на долю которых приходится 80-90 % случаев. Примерно 15 % случаев XLRP обусловлены мутациями в RP2, которые потенциально приводят к усечению белка, влияющему на его транспортировку к поверхности клетки и поддержание структуры Гольджи. Однако генотерапия, направленная на этот ген, затруднена [73], а большинство носителей протекают бессимптомно, проявляя субклинические признаки, такие как височно-лобный рефлекс (TLR) и пигментные изменения [76]. RP2-связанная ретинопатия проявляется преимущественно в детском возрасте и характеризуется быстро прогрессирующей дегенерацией сетчатки, вовлечением макулы и ранней полной потерей эллипсоидной зоны [77]. К сожалению, последние пять лет исследования были сосредоточены в основном на клинических случаях и специфических фенотипических симптомах RP2, а целенаправленная терапия с помощью генного редактирования еще не разработана.

В данной статье клинические исследования XLRP представлены следующим образом (табл. 2).

Table 2. Clinical research on XLRP.

На долю ARRP приходится 50-60% всех случаев RP, причем основной причиной аутосомно-рецессивных нарушений является генетика. Хотя более 40 генов ассоциированы с ARRP, лишь некоторые из них обусловливают значительную долю случаев, как описано ниже (табл. 3).

Комплекс PDE6 регулирует концентрацию циклического гуанозинмонофосфата (cGMP) в цитоплазме фоторецептора и играет важнейшую роль в каскаде зрительной фототрансдукции. Фосфодиэстераза cGMP фоторецепторов палочек состоит из четырех субъединиц: каталитической α-субъединицы (PDE6A), каталитической β-субъединицы (PDE6B) и двух ингибиторных γ-субъединиц (PDE6G). Изменения в семействе генов PDE6, специфичных для грызунов, вызывают ARRP в 8% случаев [78], при этом основными факторами являются изменения в генах, кодирующих субъединицы PDE6A и PDE6B [79].

В каскаде зрительной фототрансдукции в клетках зрительных палочек световое возбуждение активирующих сетчатку трансдукторных белков приводит к высвобождению ингибирующей субъединицы комплекса PDE6. Это вызывает активацию каталитических субъединиц комплекса PDE6 (PDE6α и β), которые затем гидролизуют cGMP, что приводит к гиперполяризации мембраны и преобразованию света в нервные импульсы. Это приводит к постоянному открытию катионных каналов в мембранах палочковых фоторецепторов (контроль cGMP), обеспечивая приток избыточных внеклеточных ионов в клетку, что в конечном итоге приводит к апоптозу палочковых клеток [80].

Ген PDE6A, расположенный в позиции 5q32, имеет длину 87 кб и состоит из 22 экзонов, кодируя 860-аминокислотную альфа-субъединицу комплекса PDE6 [81]. Это 7-й локус, идентифицированный как способствующий развитию RP, и он вовлечен в 4% всех случаев АРRP, особенно при тяжелых формах [82,83]. Вариант PDE6A, ассоциированный с АРRP, был впервые идентифицирован в 1995 году [82], и к настоящему времени было зарегистрировано 40 патогенных вариантов этого гена, причем большинство (65%) - точечные варианты. В Северной Америке на долю гена PDE6A приходится 3-4% всех случаев ARRP, в то время как редкие случаи PDE6A-ассоциированного RP были выявлены в популяциях Испании, Японии и Великобритании. В то же время варианты PDE6A, вызванные ARRP, составляют 2%, 2%, 1,6% и 1% случаев в пакистанской, французской, немецкой и израильской популяциях, соответственно [83].

Хотя мутации в гене PDE6A были идентифицированы как причина RP у человека, окончательные методы лечения этого ослепляющего заболевания еще не разработаны. Mowat et al. провели анализ амплификации генов сетчатки у собак с мутацией Pde6a, используя мутантный AAV серотипа 8 с капсидом для доставки Pde6a. Это исследование стало первой успешной амплификацией гена Pde6a RP в крупной животной модели (табл. 3) [84]. В доклиническом исследовании генного усиления введение палочко-специфического трансгена AAV2/8(Y733F)-Rho-Pde6α до начала заболевания у мышей привело к более эффективному спасению фоторецепторных клеток [85]. Таким образом, было высказано предположение, что успех терапевтических клинических испытаний будет зависеть от способности выявлять пациентов на достаточно ранних стадиях, чтобы максимально увеличить количество жизнеспособных палочковых клеток, которые можно лечить генотерапией [73].

Таблица 3. Клинические исследования ARRP.

Ген PDE6B, кодирующий β-субъединицу комплекса PDE6, расположен в 4p16.3 и имеет общую протяженность 45 Мб. Он состоит из 22 экзонов и кодирует 854-аминокислотный белок [91,92]. Этот ген был первым идентифицирован как вызывающий ARRP. Впервые ARRP-ассоциированный вариант был идентифицирован в 1993 году. RP, обусловленный мутациями PDE6B, обычно протекает агрессивно, с ранним началом тяжелой потери зрения из-за быстрой дегенерации фоторецепторов. Генетические дефекты в этом гене составляют примерно 5-8 % случаев ARRP [92].

В многочисленных исследованиях изучались животные модели, связанные с PDE6b. Yeo et al. предположили, что у крыс Pde6b-KO дегенерация фоторецепторов протекает медленнее и анатомические структуры крупнее, чем у соответствующей мышиной модели. Следовательно, они могут быть более подходящей моделью для экспериментальной терапии, направленной на лечение RP [81]. Yang и др. описали создание новой модели крысы Pde6b-KO Long-Evans, зеркально отражающей ключевые особенности RP человека. Эта модель может быть использована в доклинических трансляционных исследованиях для дальнейшего изучения дегенерации сетчатки [93].

Что касается генной терапии, Bitoque и др. протестировали комбинацию ранее разработанного не-вирусного вектора [94] с плазмидой, оптимизированной для устойчивой экспрессии PDE6β на мышиной модели rd10. Kuehlewein et al. исследовали фенотипические и генотипические характеристики RP, ассоциированного с вариантами PDE6B. Генетически 43 % пациентов имели de novo варианты PDE6B, что значительно расширило спектр вариантов PDE6B. Кроме того, у 83 % пациентов наблюдались менее тяжелые нарушения зрения, что открывает возможности для поиска новых лекарств [95]. Han и др. описали производство двух различных векторов AAV (AAV2/1 и AAV2/5), изготовленных в соответствии с действующими стандартами надлежащей производственной практики, и продемонстрировали их способность индуцировать экспрессию человеческого PDE6B in vivo. AAV-опосредованная субретинальная генотерапия замедляет потерю фоторецепторных клеток у крыс с дефицитом Pde6b по сравнению с не-леченым контролем [86]. Qin et al. разработали инструмент для редактирования генома PESpRY, отличающийся универсальностью основного редактора (PE) и неограниченными требованиями к протоспейсерно-примыкающему мотиву (PAM) для вариантов SpCas9 (SPRY). Они использовали двойную систему AAV для трансдукции PESpRY для редактирования генома in vivo в мышиной модели RP, ассоциированной с Pde6b, нацеливаясь на не-NGG PAM. У обработанных мышей наблюдались значительные отклики на электроретинограмму, усиление оптомоторных реакций, вызванных зрительными стимулами, а также навыки в задаче визуально управляемого водного лабиринта. Это подчеркивает потенциал неограниченного редактирования генома in vivo в дегенерирующей сетчатке для предотвращения потери зрения, связанной с мутациями в генах, связанных с RP [96].

Ген USH2A, кодирующий направляющий белок, расположен на 1q41. Он имеет длину 800 кб в геномной ДНК и состоит из 73 экзонов (причем экзон 71 специфичен для кохлеарной системы). Мутации в USH2A являются основной причиной ARRP, составляя 12-25 % случаев. Этот белок играет важную роль в развитии волосковых клеток слуховой улитки и поддержании фоторецепторов. Он экспрессируется в сетчатке, особенно во внутренней части фоторецепторов, а также в поддерживающих тканях внутреннего уха [97].

Генетические вариации в гене USH2A приводят к двум различным фенотипам: несиндромальному RP и синдрому Ашера типа 2a. Выявлено более 1100 патогенных вариантов USH2A, включая миссенс, нонсенс, сплайс-мутации, делеции, инсерции, делеции и крупные перестройки [98]. Среди этих вариантов инсерционные мутации приводят к наиболее тяжелым формам АРRP, за ними следуют сплайс- и миссенс-варианты [97].

На молекулярном уровне патогенез USH2A до конца не выяснен. Однако исследования с использованием клеток USH2A и животных моделей, созданных с помощью человеческих iPSCs (hiPSCs) или технологии CRISPR/Cas9, помогут глубже раскрыть патогенез USH2A [99]. Выделение hiPSCs из пациентов с заболеваниями, ассоциированными с USH2A, дает возможность изучить молекулярные механизмы, лежащие в основе заболевания, и исследовать потенциальные инновационные методы лечения. В новаторском исследовании Tucker et al. (2013) использовался протокол 3D/2D для получения hiPSCs от пациента, несущего мутацию c.7595-2144 A > G (rs786200928) в интроне 40 USH2A и транс-мутацию c.12575G > A (rs199605265) в клетках кератиноцитов пациента, из которых были получены капсульные структуры глазницы. Хотя клетки сетчатки, полученные из USH2A, не показали значительных различий в ранних аномалиях развития по сравнению с контрольной группой, в них были повышены уровни белков GRP78 и GRP94, что указывает на потенциальное участие стресса ER в патогенезе, связанном с USH2A [100]. Liu et al. охарактеризовали модель мыши с дефицитом Ush2a, выявив полную потерю двух изоферментов usherin в сетчатке и улитке. Последующее исследование, основанное на этой модели, показало, что дегенерация сетчатки является поздней и прогрессирующей [101]. Usherin-подобная мышиная модель KMUSH/USH демонстрирует спонтанный RP и умеренную потерю слуха, а также сниженную экспрессию Pde6b и Ush2a (Yao et al., 2016). В Ush2a было выявлено несколько точечных мутаций, что позволяет предположить его патогенную роль в usherin-подобном фенотипе KMUSH/USH [102].

В настоящее время не существует утвержденных методов лечения RP, вызванного мутациями USH2A, однако соответствующие исследования продолжаются. Вирусная генотерапия с использованием AAV на сегодняшний день является наиболее безопасным и эффективным методом трансдукции клеток сетчатки. Однако, имея предел нагрузки всего в 4,7 кб, отдельные частицы AAV не способны нести полную кодирующую последовательность USH2A (15,6 кб). Чтобы преодолеть это ограничение, было изучено и оптимизировано несколько стратегий. Использование двойных и тройных систем AAV позволило расширить возможности транслокации с 4,7 кб до максимальных 14 кб. Maddalena и др. использовали интрон-опосредованную белковую трансдукцию для повышения способности AAV к транслокации в сетчатку. Однако практическое применение интрон-опосредованной трансдукции белка через векторы AAV сдерживается необходимостью встраивания цис-регуляторных последовательностей в каждый AAV, что ограничивает его универсальность [55]. Toms и др. успешно создали ДНК-плазмиды Scaffold/matrix attachment region (S/MAR), содержащие полноразмерную кодирующую последовательность USH2A человека, репортерный ген GFP и повсеместный промотор (CMV или CAG). Это было первое сообщение о векторе, способном экспрессировать полноразмерный ушерин и осуществлять функциональное восстановление [87]. Развитие технологии CRISPR/Cas9 позволило оптимизировать применение стратегий редактирования генов для исправления точечных мутаций и небольших химер, что открывает перспективные возможности для лечения наследственных заболеваний. Редактирование генов позволяет исправлять мутации USH2A непосредственно в сетчатке пациента и имеет потенциал для исправления фоторецепторов, полученных из hiPSC, для будущих целей трансплантации. К настоящему времени CRISPR/Cas9, направленный на USH2A, позволил исправить повторяющиеся мутации c.2299delG, p. Glu767Serfs*21 (rs80338903) и c.2276 G > T, p. Cys759Phe (rs80338902) в модели клеток HEK, а также отредактировать фибробласты, полученные от пациента, и hiPSCs in vitro [88,103]. Несмотря на то, что методы редактирования генов продемонстрировали успешность in vitro, остаются многочисленные проблемы с точки зрения их клинической трансляции.

Ген RPE65 человека, расположенный на 1p31, имеет длину нуклеотидов 20 кб и состоит из 14 экзонов. Он кодирует высоко-консервативный специфический для RPE белок 65 кДа, который имеет две изоформы: мембраносвязанный mRPE65 и растворимый sRPE65 [72]. Он играет ключевую роль в зрительном цикле [104], в серии биохимических реакций с участием ретинола в глазных тканях, поддерживающих зрение у позвоночных. При воздействии света на светочувствительные пигменты сетчатки 11-цис-ретиналь превращается во все транс-ретиниловые эфиры. RPE65 действует как изомераза, которая восстанавливает все транс-ретиниловые эфиры в 11-цис-ретиналь. Мутации двойной аллели в гене RPE65 могут снижать или устранять активность RPE65, нарушая зрительное кровообращение и приводя к ухудшению зрения.

Генетические дефекты в клетках RPE составляют 5% случаев RP, причем на ген RPE65 приходится половина этих случаев [105]. Мутации в RPE65 вызывают дегенерацию фоторецепторов, что приводит к RP (преимущественно ARRP и иногда ADRP) и LCA. Наследственные заболевания сетчатки, связанные с RPE65, обычно проявляются в возрасте от рождения до пяти лет, а к четвертому десятилетию жизни пациенты полностью теряют зрение (юридическая слепота). Идентифицировано более 300 вариантов гена RPE65, большинство из которых являются точечными.

В настоящее время Luxturna (voretigene neparvovec) является единственной генотерапией, лицензированной для лечения RP. Luxturna доставляет функциональную копию гена RPE65 через AAV в клетки сетчатки посредством субретинальной инъекции, способствуя нормальной экспрессии RPE65 в клетках сетчатки. Однако этот препарат лицензирован и разрешен для лечения лишь небольшой части пациентов с мутациями в RPE65. Эта избранная группа, требующая наличия двойных мутаций и жизнеспособных фоторецепторных клеток, составляет всего 0,3-1% от всех случаев RP. В клиническом исследовании III фазы 31 пациент с двусторонними мутациями гена RPE65 получал лечение воретигеном непарвовеком - вектором AAV2, несущим модифицированный ген RPE65 человека. Это вмешательство привело к значительному улучшению зрительных функций через год, которое сохранялось в течение трех-четырех лет наблюдения, без каких-либо заметных побочных эффектов [106-108]. Deng C et al. продемонстрировали реальную безопасность и эффективность генотерапии voretigene neparvovec у пациентов детского возраста с двухкопийным патогенным вариантом RPE65 [109]. Однако успех генотерапии RPE65 в долгосрочной перспективе прогрессирования ограничен областями сетчатки, где фоторецепторы остаются относительно неповрежденными на момент вмешательства. Кроме того, могут существовать неизвестные механизмы, способствующие лишь частичному терапевтическому эффекту за пределами места субретинальной инъекции [110]. Hull et al. провели клиническое обследование, визуализацию сетчатки и электрофизиологические тесты четырех пациентов из четырех семей, страдающих ранней дистрофией сетчатки. Они провели двунаправленное секвенирование по методу Сэнгера всех экзонов и границ интрон-экзон гена RPE65. Результаты показали, что низкоплоидные варианты в RPE65 ассоциируются с легкой формой заболевания в детстве и сохранением зрения во взрослом возрасте, что говорит о том, что эффективность трансдукции может быть не единственным ограничивающим фактором для улучшения зрения в испытаниях генной заместительной терапии. Напротив, для достижения оптимального восстановления зрения может потребоваться назначение заместительной генотерапии в более раннем детском возрасте [89].

Кроме того, PEs могут редактировать широкий спектр геномов, включая все 12 возможных замен оснований, а также ограниченное число вставок, делеций и их комбинаций, без необходимости двухцепочечных разрывов или экзогенных донорских шаблонов. Ожидается, что такая универсальность PEs в исправлении мутаций, вызывающих заболевания, расширит терапевтический потенциал редактирования генов. She и др. изучили применение PEs в исследовании с участием пациента, страдающего наследственным заболеванием сетчатки LCA. После субретинальных инъекций мышам rd12 с тем же наследственным заболеванием сетчатки они наблюдали, как первичные редакторы исправляют мутации, вызывающие заболевание, со значительной точностью, достигая эффективности до 16 %, без признаков вне-целевого редактирования. Это вмешательство привело к восстановлению экспрессии RPE65, спасению сетчатки и зрительных функций, а также сохранению фоторецепторов. Эти результаты послужили толчком к дальнейшим исследованиям PEs для лечения наследственных заболеваний сетчатки, вызванных различными мутациями [90].

С развитием исследований и распространением знаний область RP претерпевает значительные изменения в парадигме. В частности, стремительный прогресс в генотерапии привел к положительным поэтапным экспериментальным результатам в трансляционном применении для лечения RP. В данной статье представлен обзор последних достижений в исследованиях по редактированию генов для лечения RP, освещен текущий прогресс в стратегиях редактирования генома, направленных на коррекцию различных мутаций, вызывающих заболевание, включая клинические испытания (табл. 4). Генотерапия, будучи относительно более безопасной и менее инвазивной в краткосрочной перспективе по сравнению с другими методами лечения, стала более эффективным вариантом. Инновации в технологии генотерапии позволили модифицировать гены, вызывающие заболевания, что открыло путь к персонализированному и точному лечению RP. Несмотря на то, что методы генотерапии доказали свою эффективность в отношении многих RP, вызванных генными мутациями in vitro, остаются значительные проблемы с точки зрения их клинического применения. В настоящее время препарат Luxturna (воретиген непарвовец) является единственной одобренной генной терапией для лечения RP; однако его применение ограничено небольшим подмножеством пациентов с мутациями в гене RPE65. Кроме того, как и другие методы лечения, эффективность, безопасность и стабильность генного редактирования требуют дальнейшего совершенствования. Тем не менее, проводимые исследования показывают многообещающие результаты, что позволяет говорить о генном редактировании как о потенциально эффективной терапии RP.

Таблица 4. Сводка клинических исследований RP.