Хроническая боль затрагивает до 30% взрослого населения во всем мире и часто является следствием таких заболеваний, как артрит, диабет, рак или травма.^1,2 Примечательно, что расстройство, вызванное употреблением опиоидов, ежедневно приводит к сотням смертей в США.³ Поэтому срочно необходимы новые неопиоидные методы лечения распространенных болевых состояний, таких как травмы колена, спины и шеи, а также нейропатическая боль.

Генотерапия зародилась в середине XX века с улучшением понимания структуры и функции ДНК. К 1970-м годам технология рекомбинантной ДНК раскрыла потенциал генотерапии для коррекции генетических заболеваний. В 1990-х годах было проведено первое испытание генотерапии на человеке, открывшее новую эру клинического применения.⁴ По состоянию на апрель 2024 года на сайте ClinicalTrials.gov зарегистрировано 2 606 клинических исследований. Поиск на сайте PubMed исследований по теме «генотерапия» с января 2004 года по март 2024 года дал в общей сложности 26 904 исследования, включая 705 клинических исследований, зарегистрированных на сайте ClinicalTrails.gov (рис. 1А). Появление методов редактирования генов, особенно CRISPR-Cas9, в 21 веке придало новый импульс этой области. Генотерапия в первую очередь направлена на лечение опухолей, редких заболеваний, генетических нарушений, хронических заболеваний и состояний, не имеющих эффективного медикаментозного лечения. Поиск в PubMed по запросу «генотерапия и боль» с января 2004 года по июль 2024 года выявил в общей сложности 386 исследований, включая 18 клинических исследований, зарегистрированных на сайте ClinicTrails.gov (рис. 1B). Тем не менее, исследования, направленные на изучение боли в качестве основного результата, редки, а одобренная генотерапия боли отсутствует.

Рисунок 1 Поиск в PubMed по ключевым словам «генотерапия» и «генотерапия и боль», проведенный 10 марта 2024 года

Большинство подходов к генотерапии боли было направлено на первичные сенсорные нейроны в периферической нервной системе (ПНС), включая дорсальные корешковые ганглии (DRGs) и тройничный ганглий (TG). Некоторые исследования также были направлены на ноцицептивные нейроны в центральной нервной системе (ЦНС), включая спинной и головной мозг (табл. 1). Ноцицепторы - это специализированные сенсорные нейроны, которые обнаруживают вредные тепловые, механические и химические стимулы,^5,6 а их сенсибилизация (или периферическая сенсибилизация) является самой непосредственной причиной хронической боли⁷ и наиболее подходящей мишенью для терапии боли.⁸ Ноцицепторы характеризуются молекулярным и функциональным разнообразием, включая как не-миелинизированные С-волокна, так и миелинизированные Ad-волокна в DRG, TG и глоссофарингеальном ганглии. Помимо тепловых, механических и химических стимулов, световые стимулы могут вызывать или подавлять боль, когда ноцицепторы экспрессируют светочувствительные ионные каналы с помощью оптогенетики.⁹ Недавний прогресс в транскрипционном профилировании на уровне популяции и отдельных клеток выявил молекулярное разнообразие в сенсорных нейронах мыши^10,11 и человека,^12,13 обеспечивая новые мишени и типы клеток для генотерапии. Параллельно с периферической сенсибилизацией происходит центральная сенсибилизация, опосредованная усиленной обработкой боли в спинном и головном мозге. Она может проявляться в виде повышения возбуждающей нейротрансмиссии и снижения или потери тормозной синаптической передачи (также называемой растормаживанием) в болевых цепях ЦНС.¹⁴ Накопленные данные свидетельствуют о том, что центральная сенсибилизация при хронической боли может открывать «ворота» спинного мозга, позволяя низкопороговой стимуляции Aβ-волокон (например, легкое прикосновение) вызывать механическую аллодинию или тактильную аллодинию.¹⁵

Табл.1 Table 1 Preclinical studies for gene therapy in animal models of pain with different gene editing and delivery methods

Сокращения: ACC - передняя поясная кора; AS - антисмысловая РНК; ASO - антисмысловые олигонуклеотиды; CCI - хроническая травма сужения; Chemo. g - химиогенетика; CFA - полный адъювант Фрейнда; CIPN - периферическая нейропатия, вызванная химиотерапией; CKO - условно нокаутные мыши; CX3CR1 - хемокиновый рецептор 1 с мотивом CX3C; DAVTA-нейроны - дофаминовые нейроны вентральной тегментальной области (VTA); DREADD - дизайнерский рецептор, активируемый исключительно дизайнерскими препаратами; DRG - дорсальные корневые ганглии; DRN - дорсальное ядро рапы; HSV - дефектный по репликации вирус простого герпеса; IA - внутрисуставной; ID - внутрикожный; IG - внутриганглионарный; IT - интратекальный; IP - внутрибрюшинный; IPL - внутриплантарный; MOR - мю-опиоидный рецептор; Opto. оптогенетика; PEI, полиэтиленимин; PSAM, фармакологически селективный исполнительный модуль; pSC, околощитовидный нерв; RVG, гликопротеин вируса бешенства; SC, подкожный; SDH, дорсальный рог спинного мозга; SNI, повреждение щадящего нерва; SNL - перевязка спинного нерва; SNT - перерезка спинного нерва; VGluT3 - везикулярный транспортер глутамата 3; SS-lncRNA - специфическая для сенсорных нейронов длинная не-кодирующая РНК; NIS-lncRNA - специфическая для травмы нерва длинная не-кодирующая РНК; CA8 - карбоновая ангидраза-8.

Средства доставки генов включают в себя вирусные векторы, такие как аденовирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV), вирус простого герпеса (HSV), гликопротеин вируса бешенства (RVG) и лентивирусы (LV), и не-вирусные векторы, включая липидные наночастицы, полимерные носители и наночастицы,³⁸ а также физические методы, такие как электропорация, генная пушка, сонопорация и доставка микроигл.³⁹ Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Выбор подходящего средства доставки требует учета различных факторов, включая терапевтическую цель, эффективность доставки, безопасность и стоимость.^39-41 Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) нацелены на РНК для регуляции генов. Эти инструменты в совокупности расширяют границы генотерапии, стремясь к более безопасным и эффективным методам лечения. Инструменты редактирования генов значительно эволюционировали, чтобы обеспечить более точные и эффективные средства для лечения генетических заболеваний. Среди ключевых инструментов - CRISPR-Cas9, революционный инструмент редактирования генов, созданный на основе бактериальной защитной системы. Он использует направляющую РНК и фермент Cas9 для точных разрезов в ДНК, что позволяет удалять, добавлять или изменять определенные генетические последовательности. CRISPR-Cas9 славится своей простотой, скоростью и точностью по сравнению с более старыми методами редактирования генов.⁴⁰

ASO и терапия с помощью РНК-интерференции (RNAi) являются одними из наиболее реальных и перспективных подходов к генотерапии боли⁴² (рис. 2A и 2B). Начиная с 1990-х годов, антисмысловые олигонуклеотиды ДНК или РНК широко использовались для открытия и оценки мишеней боли⁴³ (табл. 1). Короткие молекулы ДНК или РНК могут связываться с определенными последовательностями РНК, что приводит к деградации или изменению целевой РНК (рис. 2А). Нейропептид галанин был одним из первых нейронных молекул-мессенджеров, которые, как было установлено, регулируются при повреждении нервов. Он также специфически экспрессируется в небольших ноцицептивных первичных сенсорных нейронах DRG.⁴³ Одно из первых применений генотерапии в исследованиях боли показало, что локальная доставка ASO галанина в лишенный аксонов (axotomized) седалищный нерв не только снизила экспрессию галанина в нейронах DRG, но и вызвала аутотомию, связанное с болью поведение самокалечения у крыс после повреждения периферического нерва.¹⁶ Субъединица NaV1.8 натриевого канала, устойчивая к тетродотоксину (ТТХ), является одним из самых ранних выявленных маркеров ноцицепторов. Интратекальное введение ASO использовалось для изучения функции каналов, присутствующих в периферических терминалях первичных афферентных нейронов.¹⁷ Было обнаружено, что интратекальный нокдаун ASO NaV1.8, но не NaV1.9, в нейронах DRG уменьшает вызванную травмой нерва нейропатическую боль у крыс.⁴⁴ Снижение экспрессии NaV1.8 в нейронах DRG с помощью ASOs не только предотвратило перераспределение каналов в седалищном нерве, но и обратило вспять нейропатическую боль у крыс.¹⁹ Интратекальный нокдаун переходного рецепторного потенциала ванилоида 4 (TRPV4) с помощью ASOs в первичных афферентных ноцицептивных нервных волокнах уменьшал ноцицепцию, вызванную гипотоническим стимулом.^20,45 Ionis Pharmaceuticals разработала ASOs, содержащие заблокированные нуклеотиды, которые продемонстрировали длительный период полураспада (месяцы) и улучшенную потенцию. Однако они также показали токсичность для печени после системного введения.⁴⁶ Кроме того, в спинном мозге нокдаун белка постсинаптической плотности PSD-95, опосредованный ASOs, нарушил его связывание с N-метил-D-аспартатными NMDA-рецепторами (NMDARs) и предотвратил развитие антиноцицептивной толерантности, вызванной морфином.⁴⁷



Рисунок 2 (A) Antisense oligonucleotides (ASO) for mRNA degradation in the presence of RNase H. ssDNA, single-stranded DNA. (B) RNA interference (RNAi) encompasses techniques such as shRNA (short hairpin RNA), dsRNA (double-stranded RNA), siRNA (small interfering RNA), and miRNA (microRNA). RNAi causes mRNA degradation. dsRNA, double-stranded RNA; RISC, RNA-induced silencing complex. (C) CRISPR gene editing encompasses various applications, including CRISPR KO (gene knockout), CRISPRi (CRISPR interference), and CRISPRa (CRISPR activation) technologies. Top, CRISPR KO aims to achieve gene knockout by introducing double-strand breaks. Middle, Cas9 protein binds to the DNA sequence of the target gene and triggers a double-strand break. Bottom, CRISPRi employs the CRISPR system to achieve reversible gene suppression. It uses a defective form of the Cas9 protein, typically fused with transcriptional repressor domains, to block transcription of the target gene. CRISPRa aims to enhance the expression of target genes. It utilizes the Cas protein from the CRISPR system to target specific promoter regions of the gene and introduce activators, thereby enhancing the transcription of the target gene. dCas9, dead Cas9; sgRNA, single guide RNA; tss, transcription start site. (D) Chemogenetic editing tools, such as DREADDs (designer receptors exclusively activated by designer drugs) and PSAMs (pharmacologically selective actuator modules), are instrumental in manipulating cellular activity with precision. hM3Dq is engineered to be activated by a synthetic ligand, such as clozapine-N-oxide (CNO). hM4Di is engineered to be inhibited by CNO. PSEM, pharmacologically selective effector module (PSEM). (E) CellREADR (cell access through RNA sensing by endogenous ADAR) is a modular readrRNA molecule, consisting of a 5' sensor domain (sesRNA) and 3' effector domain (efRNA), separated by a T2A coding region. sesRNA is complementary to a cellular RNA and contains a stop codon that prevents efRNA translation. Base-pairing between sesRNA and target RNA recruits ADAR enzymes, which mediate A-to-I editing, converting the UAG stop to a UGG Trp codon, switching on the translation of the effector protein. ADAR, adenosine deaminases acting on RNA. (F) Various routes of administration are employed in gene therapy for pain research. These routes include intravenous (IV), intraperitoneal (IP), intramuscular (IM), intra-ganglionic for the dorsal root ganglia (IG, DRG), peri-sciatic nerve, intrathecal (IT), intra-articular (IA), intracerebral (IC), and ocular injection routes, as well as intra-nasal inhalation. Topical or transdermal delivery methods are preferred for their non-invasive nature.

RNAi - это эволюционно сохраненный механизм глушения экспрессии генов путем направленной деградации мРНК (Рисунок 2B). RNAi широко используется для направленного воздействия на экспрессию генов в болевых путях (например, в DRGs и спинном мозге). Однако этот подход ограничен проницаемостью клеточных мембран для отрицательно заряженных нуклеиновых кислот.^8,48 Различные носители, включая полимеры, липиды и пептиды, были использованы для улучшения доставки малой интерферирующей РНК (siRNA) в клетки, включая нейроны и глиальные клетки.⁴⁹ Было показано, что интратекальное введение siRNA матричной металлопротеазы-9 (MMP-9), смешанной с полимером полиэтиленимином (PEI), предотвращает вызванное травмой нерва повышение уровня MMP-9 в DRGs мыши и развитие нейропатической боли после перевязки спинного нерва.²² Однако использование PEI в качестве системы доставки ограничено его специфичностью для тканей и типов клеток. Для доставки siRNA в нервную систему были разработаны альтернативные методы. В частности, пептид RVG может доставлять siRNA в клетки нейронов после внутривенной инъекции, что приводит к специфическому глушению генов в мозге.⁵⁰

Этот метод был модифицирован для доставки siRNA к нейронам DRG путем peri-sciatic инъекции смеси пептида RVG и siRNA через ретроградный аксональный транспорт^.51 Peri-sciatic инъекция пептида RVG вместе с siRNA, нацеленной на каспазу-6 или белок программируемой смерти 1 (PD-1), не только снижала экспрессию целевого белка в нейронах DRG, но и изменяла ноцицепцию, опосредованную целевыми белками в этих сенсорных нейронах.^51-53 Примечательно, что высокие дозы siRNA могут вызывать вне-целевые анальгетические эффекты через Toll-подобные рецепторы (TLR), опосредованные реакциями интерферона типа 1 в спинном мозге.⁵⁴

Все больше данных свидетельствует о критической роли не-кодирующих РНК и эпигенетической регуляции экспрессии генов в первичных сенсорных нейронах в регуляции боли.⁵⁵ Было показано, что травма нерва увеличивает активность гистон-лизин N-метилтрансферазы-2 (G9a) для усиления нейропатической боли через эпигенетическое глушение калиевых каналов. Интратекальное введение siRNA, направленной на G9a, с помощью трансфекционного агента i-Fect, катионного липидного препарата, предназначенного для эффективной доставки siRNA в широкий спектр клеток, не только уменьшило вызванное травмой нерва повышение активности G9a и нейропатическую боль, но и обратило вспять вызванное травмой нерва снижение регуляции множества калиевых каналов в DRG.²⁵ Интересно, что специфическая для сенсорных нейронов длинная не-кодирующая РНК (lncRNA), как выяснилось, экспрессируется преимущественно в малых нейронах DRGs и значительно снижается после травмы нерва. Эта lncRNA может облегчать нейропатическую боль за счет регуляции экспрессии KCNN1 в поврежденных нейронах DRGs.⁵⁶ Кроме того, еще одна lncRNA повышается после травмы нерва, а нокдаун этой lncRNA с помощью ASO уменьшает нейропатическую боль.³⁶ Первичные сенсорные нейроны также экспрессируют кластер miR-183, который контролирует 80% генов, регулируемых нейропатической болью. Отсутствие или снижение уровня miR-183 приводило к повышению уровня генов нейропатической боли, кодирующих субъединицы a2d-1 и a2d-2 кальциевых каналов, которые являются молекулярными мишенями препарата gabapentin, вызывающего нейропатическую боль (табл. 1).²⁴

Система доставки AAV является важнейшей разработкой в генотерапии для манипуляций с генами как с потерей, так и с приобретением функции. Целевая доставка является ключевым фактором оптимизации AAV, а выступы капсида играют важную роль в целевой доставке. Взаимодействие между выступами и специфическими рецепторами имеет решающее значение для разработки капсидных мутаций.⁵⁷ Векторы AAV доступны в нескольких разработанных серотипах, каждый из которых может реагировать на различные типы клеток с различными тропизмами.⁵⁸ AAV также ограничены емкостью упаковки и их способностью трансфицировать нежелательные ткани и клетки.⁵⁸ Вирусы, содержащие AAV5, AAV6, AAV8, AAV9 и AAV9-производное, были использованы для воздействия на первичные сенсорные нейроны.⁵⁸

AAVs могут заражать периферические сенсорные нейроны путем локальной и системной доставки у грызунов. Интраганглионарная (DRG) доставка AAV5 с короткой шпилечной РНК (shRNA), направленной на NaV1.3, частично уменьшала нейропатическую боль у крыс.⁵⁹ Длинная некодирующая антисмысловая РНК против калиевого канала Kcna2 присутствует в сенсорных нейронах и увеличивается при повреждении нерва. Внутриганглионарная доставка AAV5 для уничтожения этой антисмысловой РНК спасает вызванное травмой нерва снижение регуляции Kcna2, что приводит к изменению возбудимости нейронов и устойчивому облегчению нейропатической боли у мышей.²³ Serpina3n, ингибитор сериновых протеаз, повышается в поврежденных нейронах DRG у мышей и крыс, защищая развитие нейропатической боли после травмы нерва.⁶⁰ У мышей с перевязкой спинного нерва вирус AVV2/8, несущий рекомбинантный ген Serpina3n, не только увеличивал экспрессию белка Serpina3n в DRG мыши, но и ослаблял нейропатическую боль.⁶⁰ Интратекальное введение AAV9-mCherry могло инфицировать большинство сенсорных нейронов в DRG взрослых мышей.²⁹ Было показано, что внутривенный AAV9 более эффективен, чем другие серотипы AAV, для инфицирования нейронов в ЦНС.⁶¹

Чтобы преодолеть ограничения по упаковке AAV, в исследованиях боли использовались HSV-1 и LV. HSV-1 обладает большой емкостью упаковки и естественной способностью нацеливаться на сенсорные нейроны в отдельных дерматомах посредством ретроградного аксонального транспорта.⁴¹ Экспрессия гена proenkephalin человека в нейронах DRG крысы на основе HSV после внутрикожной инъекции вызывает анти-ноцицепцию в модели формалина.¹⁸ Генотерапия боли на основе HSV была достигнута путем переноса различных генов, включая ген, кодирующий противовоспалительный цитокин интерлейкин (IL)-4, или путем доставки shRNA, которая нацелена на натриевый канал NaV1.7.^62,63 Экспрессия карбоновой ангидразы-8 (CA8) в нейронах DRG была показана для опосредования анальгезии через контроль напряжения эндоплазматического ретикулума. Опосредованная репликацией дефектного вируса простого герпеса (rdHSV) экспрессия vHCA8WT в культивируемых нейронах DRG активировала KV7 и снижала возбудимость нейронов, предлагая стратегию генотерапии для контроля боли.⁶⁴ Лентивирусные векторы являются альтернативой генотерапии по сравнению с векторами AAV и HSV-1, поскольку они могут интегрироваться в геном хозяина, обеспечивая стабильную и длительную экспрессию в нейронах (до 6 месяцев и более).⁶⁵ Подкожное введение лентивирусного вектора, кодирующего микроРНК (miRNA)-30, привело к устойчивому снижению экспрессии NMDAR субъединицы NR1 в нейронах DRGs и уменьшению воспалительной боли.⁶⁶ β-аррестин-2 играет важную роль в сигнализации рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), и негативно регулирует сигнализацию опиоидных рецепторов и опиоидную анальгезию. Поразительно, что однократная интраспинальная инъекция лентивирусного вектора, кодирующего ген β-аррестина-2, отменяла у мышей механическую аллодинию, вызванную травмой спинного нерва, более чем на три месяца.⁶⁷

Система CRISPR-Cas9 становится мощным инструментом генотерапии и показала терапевтическую эффективность на многочисленных животных моделях человеческих заболеваний. Учитывая защитную роль боли, постоянное редактирование генома, приводящее к необратимому изменению восприятия боли, может быть нежелательным. В настоящее время прилагаются значительные усилия по совершенствованию и расширению CRISPR-систем для повышения эффективности и безопасности, включая изменение регуляторных участков в геноме или CRISPR-интерференционные системы с использованием каталитически неактивного фермента Cas9 (мертвая Cas9 [dCas9]) с доменом репрессии, который подавляет или усиливает транскрипцию, не изменяя последовательность ДНК в геноме²⁹. В недавнем исследовании изучалась эпигенетическая репрессия NaV1.7 в первичных афферентах с помощью эпигеномной инженерии с использованием CRISPR-dCas9 и белков с цинковыми пальцами, а конструкция была доставлена с помощью вектора AAV9 интратекальным путем. Этот подход имеет ряд преимуществ перед традиционными, поскольку позволяет использовать минимальную вирусную нагрузку и снижает вероятность системной иммуногенности. Важно, что при этом снижается экспрессия только мРНК целевого гена без изменения исходного генома.²⁹ Несмотря на то, что до применения на людях еще далеко, технология генного сайленсинга на основе CRISPR открывает перспективы для лечения хронической боли, которая может сохраняться в течение нескольких месяцев или даже лет.⁶⁸

Оптогенетика - это новая биотехнология, объединяющая оптические и генетические технологии, которая позволяет точно воздействовать на определенную группу нейронов или конкретную нейросхему с помощью световой стимуляции.³⁷ При применении к живым животным оптогенетика является полезным инструментом для исследования нейронных цепей, связанных с определенным поведением. Перианальная инъекция AAV6 использовалась для экспрессии возбуждающего и тормозного опсина в ноцицепторах TRPV1+. Было обнаружено, что активация различных опсинов синим (ChR2) и желтым светом достаточна для того, чтобы вызвать боль или анальгезию.⁹ Использование трансгенной линии крыс, в которой ChR2 избирательно экспрессируется в Аβ-афферентных волокнах в тактильных конечных органах, вызывает болеподобное поведение и отвращение, а также возбуждение нейронов в поверхностном дорсальном роге и миндалине у крыс с повреждением нерва.⁶⁹ Однако одной только оптогенетической активации кожных афферентных А-волокон, экспрессирующих Vglut1, может быть недостаточно для возникновения болеподобного поведения⁷⁰. Оптогенетические подходы как с усилением функции (с использованием синего света), так и с ослаблением функции (с использованием желтого света) вместе с генотерапией на основе AAV выявили множество нейронных цепей для контроля хронической боли и сопутствующих заболеваний (например, депрессия, тревога, отвращение, негативное вознаграждение, ангедония и т.д.), вовлекая парабрахиальное ядро, дорсальное raphe ядро, вентральную тегментальную область и переднюю cingulate кору.^35,71,72 Таким образом, оптогенетическое управление конкретными нейронами или цепями мозга с высокой пространственно-временной точностью позволяет быстро манипулировать связанным с этим поведением. Нацеливание на конкретные ионные каналы или рецепторы в конкретных нейронах для картирования, мониторинга и контроля активности нейронов в ПНС и ЦНС, а также разработка более эффективных и безопасных методов доставки генов, генотерапия на основе света откроет новые возможности для лечения боли.

Хемогенетика основана на designer рецепторах, активируемых исключительно дизайнерскими препаратами (DREADD), которые были разработаны для точного контроля различных типов сигнализации GPCR (т.е. Gq, Gs, Gi) с помощью биологически инертных агонистов.⁷³ DREADD, такие как clozapine-N-oxide (CNO), наиболее часто используемый DREADD для хемогенетики, широко применяются для модуляции активности нейронов и исследования нейронных схем поведения.⁷⁴ Например, активация Gi DREADD в сенсорных нейронах TRPV1+ DRG снижала возбудимость нейронов и вызывала анальгезию,⁷⁵ а активация Gi DREADD в GABA-ергических интернейронах спинного дорсального рога вызывала сильное спонтанное nocifensive поведение.⁷⁶ Спонтанная боль является основной жалобой пациентов, страдающих от хронической боли, и остается проблемой лечения. Повреждение нерва вызывает кластерное возбуждение нейронов DRGs, которое провоцируется активностью симпатических нервов, прорастающих в DRGs при повреждении аксонов. Хемогенетическая манипуляция симпатической активностью с помощью интратекальной генотерапии, опосредованной AAV9, достаточна для модуляции активности кластеров DRG и спонтанного болевого поведения у мышей с нейропатической болью.³⁰ В совокупности подходы DREADD предлагают мощный инструмент для изучения и вмешательства в трансдукцию и передачу боли. Хотя оптогенетика и хемогенетика широко применяются в нейронаучных исследованиях и внесли существенный вклад в понимание механизмов боли, их клиническое применение ограничено необходимостью сочетания генотерапии, оптического активационного оборудования и совместного введения лекарств.

За последнее десятилетие был достигнут значительный прогресс в клеточной биологии боли, что свидетельствует о важнейшем участии не-нейрональных клеток в возникновении боли. Двунаправленная передача сигналов между иммунной и нервной системами играет важную роль в возникновении, сохранении и разрешении хронической боли.⁷⁷ Примечательно, что гены, связанные с иммунитетом, являются одними из наиболее значительно измененных генов в спинном мозге после повреждения нерва.⁷⁸ Нейровоспаление, характеризующееся активацией глиальных клеток в ПНС и ЦНС - таких как шванновские клетки, сателлитные глиальные клетки (SGCs), микроглия и астроциты - и активацией и инфильтрацией иммунных клеток, таких как макрофаги и Т-клетки, играет ключевую роль. В ПНС нейровоспаление приводит к периферической сенсибилизации, а в ЦНС - к центральной сенсибилизации и развитию распространенных хронических болевых состояний.^79,80 Взаимодействие между нейронами, глиальными клетками и иммунными клетками позволяет по-новому взглянуть на патогенез хронической боли и является перспективной мишенью для новых стратегий лечения боли.

Предыдущие исследования были направлены на несколько типов глиальных клеток, включая микроглии, астроциты и SGCs, а также на иммунные клетки, кератиноциты, хондроциты и стволовые клетки, с помощью стратегий генотерапии. Интратекальная генотерапия IL-10 эффективно ослабляла вызванную paclitaxel механическую аллодинию и экспрессию провоспалительных цитокинов у крыс. Интересно, что этот метод направлен на менингиальные оболочки спинного мозга, обогащенные эндотелиальными клетками и иммунными клетками. Генотерапия на основе IL-10 ассоциируется с повышением уровня IL-10 в менингиальных оболочках после интратекальной инъекции плазмиды IL-10.21

Хемогенетика, оптогенетика и генотерапия сыграли решающую роль в выяснении роли глиальных клеток, таких как микроглия, астроциты и SGCs, в обработке боли.

Было показано, что хемогенетическая и оптогенетическая модуляция микроглии спинного мозга позволяет эффективно контролировать болевую чувствительность. Например, AAV9-опосредованная экспрессия DREADD под промотором CD68 первоначально использовалась для активации или ингибирования микроглии путем интратекального введения.²⁶ Хроническое воздействие опиоидов значительно усиливало выраженность и продолжительность аллодинии после хронической констриктивной травмы у крыс. Однако интратекальное лечение ингибиторным DREADD успешно предотвратило и обратило вспять вызванную морфином болевую сенсибилизацию на срок от нескольких недель до нескольких месяцев.⁸¹ Кроме того, интратекальное введение Gq DREADD вызывало механическую аллодинию у самцов, тогда как ингибиторный Gi DREADD уменьшал симптомы нейропатической боли, вызванные травмой нерва, у самцов животных.²⁶ Кроме того, химиогенетическая манипуляция с CX3CR1-экспрессирующей микроглией с помощью ингибирующего DREADD уменьшила вызванную перерезкой спинного нерва микроглиальную реактивность и нейропатическую боль у самцов и самок мышей.⁸² Хемогенетическая манипуляция микроглии, экспрессирующей CX3CR1, с Gi DREADD посредством интратекальной инъекции CNO привела к специфическому для самцов ослаблению механической аллодинии в мышиных моделях нейропатической боли.⁸³ Недавние исследования показали, что оптогенетическая активация спинальной микроглии, достигаемая путем индуцирования красно-активированного каналородопсина в микроглии, экспрессирующей CX3CR1, может привести к стойкой боли через сигнализацию IL-1.⁸⁴ Примечательно, что CX3CR1 также экспрессируется макрофагами, а трансмембранный белок 119 (TMEM119) был определен как более специфичный маркер микроглии, чем CX3CR1.³⁴ Активация пути p38 митоген-активированной протеинкиназы (MAPK) в микроглии спинного мозга играет ключевую роль в развитии нейропатической боли. ASO, содержащие блокируемые нуклеотиды, разработанные компанией Ionis Pharmaceuticals для воздействия на альфа-изоформу p38 MAPK, продемонстрировали, что интратекальное введение эффективно подавляет механическую боль, связанную с индуцированной химиотерапией периферической нейропатией (CIPN) и активацией TLR4 у самцов мышей,²⁷ что совпадает с преобладающим у самцов подавлением боли, наблюдаемым при использовании низкомолекулярных ингибиторов p38.⁸⁵

Роль астроцитов в регуляции боли также изучалась с помощью оптогенетики и хемогенетики. Световая стимуляция спинальных астроцитов, экспрессирующих ChR2, не только вызывала активацию глии, но и приводила к выработке способствующих алгезии медиаторов и повышению болевой чувствительности.⁸⁶ Более того, нейроны вентролатерального периакедуктального серого (vlPAG) имеют решающее значение для нисходящей модуляции боли. Интересно, что активация астроцитов vlPAG с помощью Gq DREADD у наивных крыс-самцов приводила к появлению нейропатических болеподобных симптомов и отвращения к боли. И наоборот, активация Gi-DREADD в астроцитах vlPAG облегчала нейропатическую боль.⁸⁷

SGC являются наиболее распространенными не-нейрональными клетками в DRG и тесно окружают сенсорные нейроны, которые обнаруживают болевые стимулы^.88 GPR37L1, сиротский GPCR, высоко экспрессируется в SGC мышиных и человеческих DRG. Примечательно, что экспрессия GPR37L1 на поверхности снижается при нейропатической боли, например, при диабете и химиотерапии.⁸⁹ Сверхэкспрессия GPR37L1 в DRGs, достигнутая путем внутриганглионарной микроинъекции AAV9-Gpr37l1, нацеленного на SGCs (с использованием промотора Fabp7, специфичного для SGCs), привела к устойчивому облегчению нейропатической боли у мышей.⁸⁹ Таким образом, нацеливание на SGCs-GPR37L1 в ПНС посредством генотерапии может предложить новый подход к облегчению боли и модификации заболеваний.

Адоптивный (adoptive ) перенос различных типов иммунных клеток, включая макрофаги, Т-клетки, В-клетки и нейтрофилы, доказал свою эффективность в содействии разрешению воспалительных и хронических болей, служа новым методом клеточной терапии для лечения боли.

GPR37-экспрессирующие макрофаги способствовали разрешению воспалительной индуцированной боли,⁹⁰ а адоптивный перенос GPR37-экспрессирующих макрофагов защищал от сепсиса после заражения бактериями и паразитами.⁹¹ Активация GPR37 нейропротектором D1 - специализированным способствующим реакции медиатором, эндогенно вырабатываемым при осуществлении воспаления, или artesunate, противомалярийным препаратом, усиливает фагоцитоз и фенотипические изменения макрофагов, что приводит к увеличению продукции IL-10 и трансформирующего фактора роста β1 (TGF-β1). ⁹⁰ CD200-экспрессирующие макрофаги способствуют разрешению воспалительной боли путем переноса митохондрий к сенсорным нейронам в DRGs мыши, которые экспрессируют неканонический CD200R-лиганд iSec1 для взаимодействия с макрофагами⁹². Кроме того, было установлено, что адоптивный перенос CD8+ Т-клеток предотвращает и устраняет боль после CIPN посредством секреции IL-10.⁹³ CD8+ Т-клетки также способствуют разрешению CIPN посредством IL-13, который действует на макрофаги, вызывая выработку IL-10.⁹⁴ CD4+ Т-клетки необходимы для анальгетического эффекта, вызываемого агонистом аденозинового рецептора (A3AR). Активация A3AR на этих Т-клетках вызывает непрямое высвобождение IL-10. Адоптивный перенос CD4+ T-клеток в DRGs мыши восстановил опосредованное агонистом A3AR подавление нейропатической боли у мышей с дефицитом T-клеток и повреждением нерва.⁹⁵ Кроме того, нейтрофилы, наиболее многочисленные иммунные клетки в крови, также могут играть важную роль. Было установлено, что периферическая инъекция нейтрофилов предотвращает развитие длительной боли, вызванной воспалением и противовоспалительным препаратом.⁹⁶

Современные терапевтические стратегии лечения аутоиммунных заболеваний часто направлены на модулирование иммунных функций В-клеток или полное уничтожение популяции В-клеток.⁹⁷ В рандомизированных контролируемых исследованиях инфузия rituximab, истощающая В-клетки, может значительно улучшить симптомы ревматоидного артрита, включая боль.⁹⁸ Важность В-клеток также показана на модели послеоперационной боли при переломе голени и наложении гипса; истощение В-клеток с помощью внутривенных анти-CD20 антител (мышиного аналога ритуксимаба) через неделю после перелома голени уменьшает выраженность механической аллодинии и сосудистых изменений в поврежденной лапе после снятия гипса.⁹⁹ Система CRISPR-Cas9 была использована для нокаута эндогенных генов в первичных В-клетках человека с помощью вектора AAV6. Эти аутологичные В-клетки могут быть сконструированы для экспрессии терапевтических моноклональных антител (mAbs), после чего они превращаются в плазматические клетки и снова вводятся в организм хозяина. Этот процесс позволяет непрерывно выделять терапевтические мАб в сыворотку крови, что потенциально устраняет необходимость в повторных инъекциях, которые в настоящее время необходимы при терапии с помощью мАб.¹⁰⁰

Было показано, что введение мезенхимных стромальных клеток (MSCs) внутривенно или интратекально обеспечивает длительное облегчение артритической боли за счет привлечения макрофагов,¹⁰¹ а также нейропатической боли за счет нейроиммунной регуляции, такой как выработка TGF-β1 и ингибирование нейровоспаления и глиальной активации.¹⁰² Кроме того, кондиционированная сывороточная среда, характеризующаяся повышенным уровнем секретируемых экзосом и противовоспалительных медиаторов (например, IL-1Ra), продемонстрировала эффективность в устранении нейропатической боли после CIPN.¹⁰³ Человеческие MSCs полученные из жировой ткани, и их кондиционированная среда являются эффективными вариантами лечения для борьбы с гиперчувствительностью, связанной с остеоартритом (ОА). Эти методы лечения обеспечивают быстрое и устойчивое облегчение боли за счет модуляции нейровоспаления как в ПНС, так и в ЦНС, тем самым контролируя периферическую и центральную сенсибилизацию.¹⁰⁴

Генотерапия, направленная на кератиноциты и хондроциты, показала свою эффективность в облегчении клинической боли при таких заболеваниях, как ОА и серповидно-клеточная болезнь (табл. 2). Дистрофический эпидермолиз, редкое генетическое заболевание кожи, характеризующееся появлением волдырей, возникает в результате мутаций в COL7A1, который кодирует коллаген VII типа (C7). Beremagene geperpavec (B-VEC), сконструированный не-реплицирующийся вектор HSV-1, содержащий COL7A1, восстанавливает экспрессию C7 в кератиноцитах и фибробластах. Это восстановление способствует заживлению ран и облегчает боль у пациентов с дистрофическим буллезным эпидермолизом.^105,106 Недавнее исследование выявило экспрессию NaV1.7 в хондроцитах, а селективное удаление NaV1.7 в хондроцитах привело к уменьшению боли, связанной с ОА.¹⁰⁷ Таким образом, стратегии генотерапии, направленные на хондроциты для подавления экспрессии NaV1.7, могут смягчить ОА и артритическую боль.

Табл. 2

Clinical trials for pain-associated diseases and pain-specific trials IA, intra-articular; ID, intradermal; IM, intramuscular; IV, intravenous; IL-1Ra, interleukin-1 receptor antagonist; HGF, hepatocyte growth factor; FGF, fibroblast growth factor 1; VEGF, Vascular endothelial growth factor; COL7A1, collagen type XVII alpha 1 chain; TGF-Я1, transforming growth factor beta 1; HbF, hemoglobin F (fetal hemoglobin); MMP-3, matrix metallopeptidase 3.