РАК

Лечение нанолдипосомами

Nanoliposomes as nonviral vectors in cancer gene therapy
Safiye Nur Yildiz, Maliheh Entezari, Mahshid Deldar Abad Paskeh, et al.
MedComm, Volume 5, Issue 7 e583

Nonviral vectors, such as liposomes, offer potential for targeted gene delivery in cancer therapy. Liposomes, composed of phospholipid vesicles, have demonstrated efficacy as nanocarriers for genetic tools, addressing the limitations of off-targeting and degradation commonly associated with traditional gene therapy approaches. Due to their biocompatibility, stability, and tunable physicochemical properties, they offer potential in overcoming the challenges associated with gene therapy, such as low transfection efficiency and poor stability in biological fluids. Despite these advancements, there remains a gap in understanding the optimal utilization of nanoliposomes for enhanced gene delivery in cancer treatment. This review delves into the present state of nanoliposomes as carriers for genetic tools in cancer therapy, sheds light on their potential to safeguard genetic payloads and facilitate cell internalization alongside the evolution of smart nanocarriers for targeted delivery. The challenges linked to their biocompatibility and the factors that restrict their effectiveness in gene delivery are also discussed along with exploring the potential of nanoliposomes in cancer gene therapy strategies by analyzing recent advancements and offering future directions.

BBB | CP | DCs | GUVs | MLVs | EMT | PEG | PCP | SUVs | TME |

Лечение рака - очень сложный процесс, требующий применения фармакологических и генетических вмешательств для борьбы с заболеванием. Такие методы лечения направлены на воздействие на основные механизмы развития раковых клеток с целью подавления их роста и пролиферации. Эти мероприятия могут осуществляться с помощью различных подходов, включая химиотерапию, лучевую терапию, иммунотерапию и генную терапию. Генотерапия выделяется среди этих методов и направлена на профилактику или лечение различных заболеваний путем исправления или замены мутировавших генов, вызывающих определенные нарушения. Генотерапия стала предметом интереса с 1960-х годов и с тех пор добилась значительного прогресса.¹ Генотерапия обладает огромным потенциалом в ближайшее время и готова стать важной областью в здравоохранении. Последние достижения в области молекулярной биологии, в частности вирусные векторы и методы редактирования генома, значительно повысили точность и эффективность генотерапевтических вмешательств.^2-5 Это привело к тому, что ранее неизлечимые генетические заболевания стали поддаваться лечению, что дает надежду пациентам и их семьям. Однако разработка безопасных и эффективных методов генотерапии сопряжена с определенными трудностями. Доставка генотерапии в клетки-мишени - это серьезное препятствие, которое необходимо преодолеть исследователям. Для этого необходима система доставки, способная доставить терапевтический ген в клетки-мишени, не вызывая при этом никаких побочных эффектов. Кроме того, необходимо тщательно учитывать возможность вне-целевого воздействия и риск иммуногенности. Несмотря на эти трудности, преимущества генной терапии огромны, и эта область быстро развивается⁶.

В контексте лечения рака применение генетического вмешательства обычно подразумевает использование множества агентов. Малые молекулярные агенты, такие как cisplatin (CP), doxorubicin и temozolomide, страдают от лекарственной устойчивости к ним, что делает их непригодными для подавления некоторых типов рака.^{7, 8} Поэтому усилия были направлены на использование генетических вмешательств для воздействия на гены, ответственные за рост и злокачественность рака.^9-11 Различные генетические инструменты, включая siRNA, shRNA и кластерные регулярно перемежающиеся короткие палиндромные повторы (CRISPR)/Cas9, используются для воздействия на гены в терапии рака. Однако существуют ограничения, связанные с вышеупомянутыми инструментами, такие как их вне-целевое воздействие, деградация ферментами и наличие физиологических препятствий в виде гематоэнцефалического барьера (BBB) и гематоопухолевого барьера.^{9, 12-14} Следовательно, необходимо разработать системы доставки для высвобождения генетических инструментов в месте опухоли, что позволит увеличить их накопление в раковых клетках и усилить их действие против раковых клеток.

Две основные категории для доставки генетических инструментов - это вирусные и невирусные носители. Особое внимание уделяется не-вирусным векторам благодаря их биосовместимости, безопасности и меньшей иммуногенности по сравнению с вирусными векторами.¹⁵ Кроме того, лиганды могут модифицировать не-вирусные векторы, значительно повышая их селективность в отношении раковых клеток. Выбор подходящего вектора имеет решающее значение для обеспечения эффективности лечения.¹⁶ Для передачи генетического материала были проведены обширные исследования двух типов носителей генов, а именно нанолипосом и поликатионных векторов. В последнее время нанолипосомы стали очень перспективными благодаря своим преимуществам перед поликатионными векторами. Эти везикулы на основе липидов, очень маленькие по размеру, состоят из амфифильных липидных молекул. Они имеют широкий спектр применения и обычно используются для введения лекарств и генотерапии. Нанолипосомы имеют ряд преимуществ по сравнению с поликатионными векторами в контексте доставки генов. Их способность хорошо взаимодействовать с биологическими системами, меньшая вероятность вызвать иммунный ответ, способность оставаться стабильными, гибкость в модификации их поверхности и возможность крупномасштабного производства делают их привлекательными. Различные невирусные векторы, такие как дендримеры и наносферы, уже использовались в генотерапии.¹⁷ Тем не менее, нанолипосомы, в частности, представляют собой перспективную основу для генотерапии рака, предлагая сочетание адресной доставки, адаптируемого груза и регулируемого высвобождения. Эти отличительные преимущества вызвали значительный интерес к данной области (рис. 1).

FIGURE 1

Advantages of nanoliposomes in gene therapy.

2 LIPOSOME: BASICS, SYNTHESIS, AND BIOMEDICAL APPLICATIONS

Alec Bangham впервые идентифицировал липосомы в 1965 году. Было приложено много усилий для их использования в терапии рака.¹⁸ Существует две основные категории липосом - малые и большие униламеллярные везикулы с размером частиц в диапазоне 100-250 нм.¹⁹ Среди них малые униламеллярные везикулы (SUVs), которые в основном применяются для доставки лекарств.²⁰ Для синтеза липосом используются молекулы фосфолипидов, такие как холестерин и другие вспомогательные липиды.²¹ Липофильные цепи жирных кислот образуют гидрофобный хвост молекул фосфолипидов, а гидрофильные фосфатные эфирные группы - полярную головку. Для синтеза липосом можно использовать ряд липидных молекул, среди которых катионные, анионные, цвиттерионные и поли(этиленгликоль) (PEG)-липиды, способные этерифицироваться с образованием различных фосфоглицеридов.²² При формировании липосом предпочтение отдается холестерину, поскольку он обеспечивает текучесть липидной мембраны, что важно для стабильности липосомных носителей. Кроме того, для улучшения функциональности фосфатные группы малых липидных молекул могут быть подвергнуты модификации.²³ Обычно липосомы состоят из одной или нескольких двухслойных фосфолипидных везикул (гидрофобной природы), окружающих водное ядро.²⁴ Они являются идеальными кандидатами для доставки лекарств благодаря повышенной абсорбции, увеличенному периоду полураспада, сниженному метаболизму и минимальной токсичности для нормальных клеток.²⁵ Свойства липосом зависят от размера, заряда, состава липидов и метода синтеза. Некоторые свойства липосом, которые улучшили их биомедицинское применение, включают биосовместимость, стабильность, контролируемое высвобождение и биоразлагаемость.²⁶ Кроме того, модификация поверхности липосом позволяет избирательно воздействовать на определенные клетки, особенно раковые.²⁷

2.1 Synthesis

На сегодняшний день для синтеза липосом применяются различные методы. Стоит отметить, что для различных типов липосом, таких как SUVs, мультиламеллярные везикулы (MLVs) и гигантские униламеллярные везикулы (GUVs), были применены различные стратегии их синтеза. Электроформация, гелеобразование и эмульсионный перенос фазы - это методы, используемые для синтеза GUV. Инжекция растворителя используется для синтеза SUV, в то время как микрофлюидика может быть использована для приготовления SUV и GUV. Для синтеза SUV и MLV применяются методы регидратации пленки и регидратации твердого вещества. Эти методы определяют такие характеристики липосом, как размер, выход, тип и полидисперсность. Например, липосомы, приготовленные с помощью пленочной регидратации, твердой регидратации и инжекции растворителя, обладают большой полидисперсностью. В то же время электроформация, гидратация с помощью геля, фазовый перенос эмульсии и микрофлюидика позволяют получить липосомы с низкой полидисперсностью.²⁸ Одним из наиболее важных аспектов получения липосом является то, что формирование везикул должно происходить при температуре выше Tm используемого липида. Это является важной проблемой при синтезе липосом, так как может повлиять на инкапсуляцию компонентов и макромолекул, чувствительных к температуре. Например, белки и ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) чувствительны к высоким температурам и могут потерять свою функцию.²⁹ При приготовлении липосом могут применяться различные стратегии, которые можно разделить на два основных класса: без растворителя и с вытеснением растворителя. В методах без растворителя для синтеза везикул не используются органические соединения, а амфифилы подвергаются гидратации в водной среде. В отличие от этого, в методе вытеснения растворителя органический растворитель используется для растворения амфифилов, а затем удаляется путем помещения их в водную среду.^{30, 31} Пленочная регидратация, твердая регидратация, электроформация и гидратация с помощью геля - это методы без растворителя, а инжекция растворителя, перенос эмульсионной фазы и микрофлюидика - это методы вытеснения растворителя.²⁸

2.2 Biomedical applications

Примечательно, что липосомы могут использоваться для лечения различных заболеваний. Например, при сахарном диабете липосомы применяются для доставки пептида инсулина.³² Липосомы могут проникать в макрофаги и значительно снижать секрецию провоспалительных факторов, что приводит к облегчению состояния при ревматоидном артрите.³³ Липосомы могут доставлять противовоспалительные медиаторы, такие как интерлейкин-10 (IL-10), для лечения атеросклероза.³⁴ Липосомы также эффективны в лечении неврологических расстройств благодаря своей способности преодолевать BBB; кроме того, модификация их поверхности с помощью трансферрина (Tf) повышает их эффективность.³⁵ Липосомы также широко применяются в лечении рака,³⁶ чтобы способствовать доставке лекарств в раковые клетки. Кроме того, липосомы могут повышать эффективность химиотерапевтических препаратов при лечении рака, обеспечивая адресную доставку в опухоль.³⁷ Доклинические исследования показали роль липосомных наноносителей в подавлении рака.^{38, 39} Следует отметить, что биомедицинское применение липосом не ограничивается доклиническими исследованиями, поскольку несколько липосомных препаратов были одобрены для клинического применения. Среди них DaunoXome для лечения саркомы, NX211 для терапии рака яичников, Platar для терапии солидных опухолей и т.д.⁴⁰ Необходимо предпринять дальнейшие попытки создания липосомных носителей, содержащих генетические инструменты, для использования в лечении онкологических больных. Методы синтеза и различные биомедицинские применения нанолипосом приведены в табл. 1.

TABLE 1. Synthesis methods of nanoliposomes and various biomedical applications.

3 LIPOSOMES AND GENE DELIVERY

Применение нанолипосом в терапии рака значительно расширилось благодаря включению в них различных молекул нуклеиновых кислот, в том числе коротких интерферирующих РНК (siRNA), коротких шпилечных РНК (shRNA), микроРНК (miRNA), длинных не-кодирующих РНК (lncRNA) и CRISPR/Cas9. Благодаря своим уникальным свойствам нанолипосомы служат эффективными носителями этих нуклеиновых кислот, обеспечивая их адресную и контролируемую доставку в раковые клетки. siRNA и shRNA используются для глушения специфических генов, связанных с раком, а miRNA регулируют экспрессию генов на посттранскрипционном уровне. lncRNA функционирует как модулятор различных клеточных процессов, обеспечивая дополнительные уровни контроля. Революционная система CRISPR/Cas9, используемая для точного редактирования генов, также включена в нанолипосомы, чтобы воздействовать на специфические мутации, связанные с раком. Этот комплексный подход, использующий потенциал различных методов лечения нуклеиновыми кислотами с помощью нанолипосомных носителей, обеспечивает универсальность. В этом разделе мы рассмотрим генетические инструменты, используемые в генотерапии рака.

3.1 DNA and mRNA delivery

Эффективная и специфическая доставка терапевтического генетического материала - важнейший компонент быстро развивающейся области генотерапии рака. Липосомы, представляющие собой крошечные везикулы, состоящие из липидов, стали перспективным методом транспортировки ДНК и мРНК. Они представляют собой универсальную платформу для точного и контролируемого высвобождения внутри раковых клеток. В этом разделе рассматривается роль липосом в транспорте ДНК и мРНК в генотерапии рака, освещаются механизмы их действия, преимущества и современные тенденции исследований. ДНК и мРНК можно стабилизировать и защитить от деградации нуклеазой, соединив их с положительно заряженными липидами, что обеспечивает их доставку в клетки-мишени. Процесс доставки включает адсорбцию липосом на поверхности клетки, затем эндоцитоз и высвобождение в клетку.⁴⁸ Они обладают рядом преимуществ, включая инкапсуляцию и защиту ДНК, улучшенное поглощение клетками и адресную доставку. Эти преимущества делают липосомы привлекательным вариантом для исследователей и клиницистов, стремящихся разработать эффективную и безопасную генотерапию для лечения рака. Липосомы как системы доставки лекарств могут быть модифицированы для улучшения поверхностных свойств и повышения клеточного поглощения. Это особенно важно в генотерапии рака, где эффективная доставка терапевтической ДНК в раковые клетки является залогом эффективности лечения. Изменяя свойства поверхности липосом, исследователи могут оптимизировать их способность проникать через клеточную мембрану и доставлять терапевтические агенты непосредственно в клетки-мишени. Метод инкапсуляции - перспективная техника, которая может быть использована для защиты ДНК от ферментативной деградации и распознавания иммунной системой. Инкапсуляция ДНК в липосомы позволяет доставить терапевтическую ДНК в клетки-мишени с большей стабильностью.

Этот метод гарантирует, что терапевтическая ДНК останется неповрежденной на пути к клеткам-мишеням, повышая тем самым эффективность лечения.⁴⁹ Значительных успехов в борьбе с раком удалось добиться с помощью вакцин против рака на основе мсенджер РНК (мРНК). Эти вакцины используют мРНК для обучения клеток вырабатывать определенные белки, связанные с раком, вызывая сильную иммунную реакцию против опухолей. Вакцинация на основе мРНК стимулирует иммунный ответ против этих специфических мишеней, кодируя антигены, связанные с опухолью или раковыми клетками. Пандемия COVID-19 ускорила развитие технологии мРНК благодаря быстрому производству и утверждению вакцин COVID-19 на основе мРНК. Этот импульс положительно повлиял на прогресс в исследованиях мРНК-вакцин против рака. Липосомальные наночастицы представляют собой сложную и разнообразную платформу для доставки мРНК. Они обеспечивают защитный, регулируемый и целенаправленный метод. Как уже говорилось ранее, содержание липидов в липосомах можно регулировать для повышения стабильности, биосовместимости и контролируемого высвобождения при транспортировке мРНК. Таким образом, они защищают мРНК от ферментной деградации и гарантируют ее целостность при транспортировке в клетки-мишени.⁵⁰ Была разработана новая система доставки, в которой используется катионный пептид DP7, модифицированный и обладающий иммуноадъювантными свойствами липосом. Основной целью этой системы было усиление экспансии дендритной доставки мРНК, кодирующей индивидуализированные неоантигены (DCs), и усиление активации DCs. В доклинических исследованиях подкожное введение комплексов мРНК, кодирующих неоантиген, значительно стимулировало выработку антиген-специфических реакций лимфоцитов.⁵¹ Подводя итог, можно сказать, что липосомы представляют собой разнообразную и перспективную платформу для транспортировки ДНК и мРНК в генотерапии рака. Благодаря своей способности инкапсулировать, защищать и транспортировать генетическую информацию в конкретные клетки с повышенной специфичностью, они рассматриваются как важнейшие инструменты для более эффективной и индивидуализированной терапии рака. Преимущества модификаций липосом приведены в таблице 2. Сочетание липосомальной технологии с генной терапией рака способно значительно повлиять на лечение рака, предоставляя новые возможности для терапевтического вмешательства на генетическом уровне.

TABLE 2. Advantages of chemical modification of liposomes.

3.2 Доставка SiRNA

РНК-интерференция (RNAi) на основе siRNA обеспечивает глушение генов на посттранскрипционном уровне. Она обеспечивает эффективную деградацию или ингибирование трансляции целевой мРНК.⁵⁷ RNAi предпочтительнее обычных терапевтических средств, включая известные механизмы глушения генов, благодаря быстрому и высоко-селективному связыванию и возможности нацеливаться на любые гены, включая те, которые кодируют белковые продукты, не поддающиеся лечению.⁵⁸ Типичные siRNA имеют длину 21-23 нуклеотида и могут быть получены из длинных фрагментов двухцепочечной РНК с помощью специфических ферментов.⁵⁹ RNAi-терапия с использованием siRNA представляет собой новую форму лечения различных заболеваний, включая рак, вирусные инфекции, глазные болезни и другие заболевания, при которых происходит дисрегуляция генов.60, 61 Однако, некоторые проблемы связаны с нокдауном генов с помощью siRNAs, включая деградацию нуклеолитическими ферментами, поглощение иммунными клетками и недостаточное проникновение в ткани.62 Поэтому были разработаны наноразмерные системы доставки для оптимизации доставки siRNA, чтобы расширить их применение в терапии рака.^{10, 63} Липосомы могут интернализировать siRNA в опухолевые клетки через эндоцитоз (клатрин-опосредованный эндоцитоз и микропиноцитоз), а также через холестерин-зависимые процессы в клеточной мембране.⁶⁴

3.2.1 SiRNA- and antitumor compound-loaded liposomes

На сегодняшний день для лечения рака разработано множество противоопухолевых соединений. В связи с этим можно рассмотреть возможность использования наноносителей для комбинированной доставки противораковых соединений и генетических инструментов. В данном разделе рассматривается использование липосом для совместной доставки siRNA и противоопухолевых соединений при раке. Устойчивость раковых клеток к апоптотической клеточной гибели в основном опосредована сигнальным трансдуктором и активатором транскрипции 3 (STAT3).^65-67 Кроме того, этот путь способствует метастазированию через индукцию эпителиально-мезенхимного перехода (EMT) и участвует в лекарственной устойчивости.^68-71 Липосомы, содержащие curcumin и STAT3-siRNA, были разработаны для лечения рака кожи. Эти катионные липосомы представляют собой не-инвазивный топический ионтофоретический метод. Эти липосомы попадают в раковые клетки через клатрин-опосредованный эндоцитоз. После поглощения эти наноносители вызывают апоптоз и значительно снижают рост раковых клеток.⁷² В другом исследовании роль липосом, нагруженных куркумином и STAT3-siRNA, оценивалась в контексте терапии рака кожи. Интересно, что по сравнению с внутриопухолевым введением ионтофоретическое введение способствует уменьшению прогрессии опухоли, подавлению роста in vivo и индуцированию апоптоза; это говорит о потенциале липосом, нагруженных siRNA и куркумином, в лечении рака.⁷³

Paclitaxel (PTX) - хорошо известный химиотерапевтический препарат, который может подавлять пролиферацию раковых клеток, вызывая остановку клеточного цикла.^{74, 75} Это приводит к изменению микротрубочек и предотвращению деполяризации микротрубочек.⁷⁶ Устойчивость к PTX - распространенное явление, и одна из возможных стратегий ее преодоления может заключаться в использовании siRNA.⁷⁷ Катионные липосомы, нагруженные PTX и survivin-siRNA, были разработаны для воздействия на раковые стволовые клетки при лечении глиомы головного мозга. После успешного проникновения через BBB липосомы избирательно воздействовали на клетки глиомы и эндотелиальные клетки микрососудов мозга (BCECs). Примечательно, что эти липосомы вызывали апоптоз только в стволовых клетках глиомы, но не в BCECs, что свидетельствует об их высокой биосовместимости. У мышей, несущих опухоль глиомы, введение липосом, нагруженных siRNA и PTX, улучшает выживаемость. Этот эксперимент показывает, что вызванное siRNA снижение регуляции гена survivin, являющееся механизмом сенсибилизации, делает раковые клетки чувствительными к PTX-опосредованной клеточной гибели⁷⁸.

Микроокружение опухоли (TME) - это сложное пространство, содержащее различные типы клеток, такие как фибробласты, раковые стволовые клетки, эндотелиальные и иммунные клетки.⁷⁹ Конкуренция между раковыми клетками за пролиферацию приводит к гипоксии. Все больше доказательств демонстрируют роль гипоксии в индуцировании химиорезистентности.^{5, 80, 81} Целенаправленное воздействие глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH) может быть важен в терапии рака из-за снижения уровня АТФ и ингибирования аутофагии. С этой целью были разработаны липосомы, нагруженные GAPDH-siRNA и PTX. Для получения липосом была использована новая стратегия, известная как криогенная внутренне-внешняя двойная обращенно-фазовая эмульсия. Доклинические эксперименты подтвердили потенциал липосом для снижения уровня GAPDH и повышения эффективности PTX при химиотерапии рака. Важно отметить, что эта стратегия позволяет преодолеть резистентность раковых клеток HeLa и MCF-7, опосредованную гипоксией.⁸² Аналогичная стратегия была принята для доставки docetaxel (DTX) для лечения рака. Поскольку индукция ангиогенеза способствует прогрессированию рака благодаря фактору роста эндотелия сосудов (VEGF),^83-85 были проведены работы по созданию VEGF-siRNA- и DTX-нагруженных липосом. Благодаря поверхностной модификации липосом с помощью Angiopep-2 и tLyP-1, липосомы могут проникать в раковые клетки через рецептор-опосредованный эндоцитоз, что приводит к усиленному внутриклеточному накоплению siRNA и DTX. Кроме того, структура липосом обеспечивает выход siRNA и DTX из эндосом и лизосом. Дополнительные исследования показали, что VEGF-siRNA- и DTX-нагруженные липосомы эффективно индуцируют апоптоз и подавляют ангиогенез при лечении глиобластомы. При этом не наблюдается иммунной реакции, что подтверждает высокую биосовместимость этих липосомальных наноносителей. Комбинация двух рецептор-специфических пептидов, Angiopep-2 и tLyP-1, опосредует работу липосом, как показано на рисунке 2. При этом происходит глушение генов VEGF, антиангиогенез и апоптоз опухолевых клеток.⁸⁶

FIGURE 2

Применение липосомных наноструктур для доставки siRNA и DTX для подавления рака. Конъюгация липосом с Angiopep-2 и tLyP-1 повышает их селективность в отношении раковых клеток. Липосомы проникают в клетки путем эндоцитоза и обеспечивают эндосомный выход. Повышенная внутриклеточная доставка DTX и siRNA-VEGF подавляет рост рака и ангиогенез, представляя собой перспективный инструмент для контрастирования раковых клеток. siRNA - малая интерферирующая РНК; DTX - доцетаксел; EPR - повышенная проницаемость и удержание; мРНК - мессенджерная РНК; SPC - соевый фосфатидилхолин; DOTAP - 1,2-диолеоил-3-триметиламмоний-пропан; VEGF - фактор роста эндотелия сосудов. Воспроизведено с разрешения из ссылки. 86, Copyright (2014), Elsevier.

3.2.2 Surface-modified liposomes

Модификация поверхности липосом различными лигандами и полимерами считается важной стратегией в терапии рака, поскольку этот метод может значительно повысить селективность липосом по отношению к раковым клеткам. Поэтому очень важно определить, какие рецепторы на раковых клетках могут стать мишенью и какие агенты могут быть использованы для поверхностной модификации липосом. В этом разделе мы расскажем о поверхностно-модифицированных липосомах для доставки siRNA при лечении рака.

В прогрессировании рака участвуют различные клетки организма, в том числе и TME. Th17-клетки, которые вырабатывают вещество под названием IL-17, и которое способствует метастазированию клеток рака желудка. Недавние исследования показали, что белок Tetraspanin 1 (TSPAN1) играет роль в активации CD4+ клеток в Th17. Был разработан метод лечения рака желудка, состоящий из липосомного комплекса поликатион-ДНК, нагруженного TSPAN1-siRNA и модифицированного Th17-антителами. Препятствуя превращению CD4+ клеток в Th17 клетки, этот подход активно препятствует прогрессированию рака желудка.⁸⁷ Приготовление липосом для доставки siRNA показало потенциал при использовании катионных липидов DC-Chol и нейтральных липидов DOPE. Однако использование катионных липосом имеет ряд ограничений, включая их взаимодействие с отрицательно заряженными плазматическими клетками, такими как клетки крови и белки сыворотки.⁸⁸ Это взаимодействие приводит к их быстрому клиренсу и выведению из кровообращения, что препятствует их терапевтическому применению. Кроме того, катионные липосомы склонны к агрегации, что еще больше затрудняет их использование для доставки siRNA.⁸⁹

Чтобы преодолеть эти трудности, для повышения стабильности липосом в сыворотке, предотвращения агрегации и улучшения их циркуляции в кровотоке используется PEGylation. Было показано, что ПЭГилированные катионные липосомы повышают эффективность siRNA в снижении экспрессии веретенообразного белка кинезина для подавления роста опухоли при лечении опухолей яичников. ПЭГилирование также снижает абсорбцию и метаболизм в печени, увеличивая при этом накопление в месте опухоли. Это объясняется снижением клиренса в крови и ускоренным иммунным распознаванием.⁹⁰ Предпочтительно образовывать комплекс между siRNA и полиэтиленимином (PEI), который имеет положительный заряд. Такое комплексообразование способствует стабильности и способности липосом к взаимодействию. ПЭГилированные липосомы были использованы в терапии опухолей шейки матки, где было показано, что они увеличивают накопление siRNA в раковых клетках и снижают уровень гена вируса папилломы человека (HPV). Для повышения селективности в отношении раковых клеток была также включена модификация AG86 таргетным пептидом-amphiphile, связывающимся с интегрином α6β4.⁹¹ Эти исследования позволяют предположить, что PEGylation липосом является перспективной стратегией доставки siRNA при лечении рака. Было показано, что PEGylation повышает стабильность липосом, уменьшает их выведение из крови и улучшает их накопление в месте опухоли. Кроме того, использование пептида-амфифила AG86, связывающегося с интегрином α6β4, повышает их селективность в отношении раковых клеток. Таким образом, применение ПЭГилированных липосом для доставки siRNA может стать эффективной терапевтической стратегией для лечения рака.

Хотя в некоторых исследованиях сообщалось, что использование PEGylation в липосомах дает положительный эффект, существуют и опасения. Эти опасения достаточно серьезны, чтобы рассмотреть альтернативы PEGylation. При использовании наночастиц, покрытых PEG, они могут препятствовать взаимодействию наночастиц с клетками, снижать клеточную интернализацию, вызывать выработку антител IgM, ускорять очистку крови и активировать систему комплемента.^92-96 Поэтому в качестве альтернативы PEG был предложен PEI. PEI обладает высоким положительным зарядом, что позволяет siRNA конденсироваться за счет электростатического взаимодействия.^{97, 98} Кроме того, PEI может разрушать эндосомные везикулы за счет «эффекта протонной губки».⁹⁹ Модифицированные PEI липосомы использовались для доставки siRNA и PTX для лечения лекарственно-устойчивых опухолей, и они продемонстрировали более высокую проникающую способность по сравнению с ПЭГилированными липосомами в 3D сфероидах.

3.2.3 Advanced liposomes

pH-реактивные липосомы

По сравнению с нормальными и здоровыми тканями, раковые ткани имеют более кислый рН (6,5-7).¹⁰⁰ Наночастицы широко применяются для увеличения накопления в раковых опухолях за счет усиления проницаемости и удержания (EPR).^101-106 Низкий рН в месте опухоли обусловлен быстрой прогрессией опухолей и плохим кровоснабжением.¹⁰⁷ Для обеспечения специфической доставки в место опухоли были разработаны рН-чувствительные наноносители. РН-чувствительные наноносители синтезируются с использованием различных типов полимеров. Катионные полимеры с аминогруппами, анионные полимеры с карбоксильными группами, полимеры с имидазольными группами, поли(β-аминоэфиры), гидразоны, ацетали, орто-эфиры или полимеры с виниловыми эфирами, а также внутриклеточные чувствительные катионные полимеры - вот некоторые из широко используемых полимеров для этой цели. Полимеры с имидазольными группами, полимеры с гидразиновыми связями, а также полимеры с ацетальными или сложноэфирными связями относятся к тем, которые наиболее часто используются для синтеза рН-чувствительных наноносителей. Примечательно, что рН-чувствительные липосомы были разработаны для генотерапии рака путем доставки siRNA. Выбранный полимер должен быть расщепляемым при рН опухоли. Иногда такие полимеры способствуют интернализации липосом в опухолевых клетках. Включение этих полимеров в состав липосом, чтобы сделать их рН-чувствительными, дает множество преимуществ. Недавно доставка siRNA была осуществлена с помощью конъюгата диолеилфосфат-диэтилентриамин (DOP-DETA) - модифицированных липосом. Этот полимерный конъюгат чувствителен к рН благодаря наличию триамина и может высвобождать siRNA в месте локализации опухоли, усиливая их накопление в раковых тканях. Примечательно, что эта модификация усиливает способность липосом сливаться с мембраной и опосредует их проникновение в раковые клетки через макропиноцитоз.1⁰⁸ Исходя из этих данных, рН-чувствительные липосомы имеют ряд преимуществ, и выбор полимера для конъюгации имеет большое значение. Сообщалось, что рН-чувствительные липосомы могут обеспечить синергетический эффект при лечении рака за счет совместной доставки противоопухолевых соединений и siRNA.

Модификация липосом carboxymethyl chitosan также привела к образованию рН-чувствительных наноносителей. Загрузка противоопухолевого препарата sorafenib и VEGF-siRNA приводит к синергетическому эффекту, вызывающему апоптоз в клетках гепатоцеллюлярной карциномы.¹⁰⁹ Эксперименты in vivo на опухолевых мышах показали, что рН-чувствительные липосомы могут достичь опухоли быстрее, чем другие органы, проявляя специфичность по отношению к раковым клеткам и тканям.¹¹⁰ Основой для разработки рН-чувствительных липосом является разрушение структуры при слабокислом рН с высвобождением груза в опухолевые клетки.¹¹¹ Сочетание различных полимеров может ускорить распад полимера при низком рН, что способствует высвобождению siRNA и повышает шансы на успех терапии рака. ПЭГилирование липосом приводит к защите siRNA от деградации и внутриклеточной доставке siRNA в эндосомы. Встраивание 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропана, титруемого липида, в эти катионные липосомы приводит к усилению катионной природы липосом. Таким образом, при слабокислом pH TME происходит деградация полимера и слияние мембран, что важно для доставки siRNA.¹¹² В целом, эти исследования показывают, что липосомы могут быть модифицированы различными полимерами, чтобы сделать их чувствительными к pH; эта особенность повышает эффективность трансфекции и приводит к увеличению доставки siRNA в опухолевые клетки и улучшению эффективности нокдауна генов.

Redox-responsive liposomes

Опухолевые клетки имеют redox-потенциал, определяемый уровнями окисления и восстановления глутатиона (GSH) и NADPH. В восстановительных условиях уровень GSH повышается, модулируя окислительно-восстановительное микроокружение раковых клеток.^{113, 114} GSH контролирует окислительно-восстановительные процессы путем снижения уровня реактивных видов кислорода (ROS) и посредством образования и фрагментации дисульфидных связей.^115-117Для лечения рака были разработаны различные наноносители, реагирующие на окислительно-восстановительные процессы, чтобы продлить время их нахождения в циркуляции и обеспечить деградацию после интернализации, облегчая тем самым доставку лекарств и генов.¹¹⁸ Наряду с этим, для доставки siRNA были разработаны липосомы, реагирующие на окислительно-восстановительные процессы. Несмотря на то что в нескольких исследованиях оценивалась роль redox-реактивных липосом в доставке siRNA, для оценки потенциала этих липосом в терапии рака еще требуется значительная работа. Ранее была проведена работа по внедрению redox-реактивных олигопептидных липосом в терапию опухолей молочной железы с помощью survivin-siRNA и PTX. Для создания redox-реактивных липосом были объединены катионные липиды (LHSSG2C14), натуральный соевый фосфатидилхолин (SPC) и холестерин. Затем PTX загружался в бислой липосом посредством гидрофобных взаимодействий, а siRNA прикреплялась к катионным липосомам посредством электростатических взаимодействий. Использование катионного липида (LHSSG2C14) в этих липосомных наноносителях выгодно тем, что он обеспечивает эндосомный выход наночастиц благодаря протонной губке гистидина в его структуре; далее, в восстановительной среде цитоплазмы, дисульфидная связь в его структуре расщепляется, что приводит к высвобождению груза редокс-реактивным способом. Доклинические исследования показали, что эти redox-реактивные липосомы эффективно подавляют рост рака и метастазы в легких благодаря высокой эффективности трансфекции.¹¹⁹ Однако необходимы дополнительные исследования для модификации липосом с помощью различных полимеров, чтобы сделать их redox-реактивными и увеличить доставку siRNA при лечении рака.

Светочувствительные липосомы

Внешние стимулы, такие как свет, полезны для доставки грузов в опухолевые очаги в терапевтических целях.¹²⁰ Свет - это чистый и пространственный стимул, который может применяться для диагностики, высвобождения грузов и лечения заболеваний путем изменения таких параметров, как длина волны, полярность, продолжительность и интенсивность облучения.¹²¹ Кроме того, свет может вызывать высвобождение грузов при фототерапии, повышая эффективность лечения заболеваний.¹²² Ультрафиолет (УФ) является наиболее распространенным типом облучения, применяемым для светочувствительных наноносителей, учитывая большое количество полимеров, реагирующих на УФ и обеспечивающих достаточную энергию для расщепления и высвобождения груза.¹²³ Такая стратегия была разработана для доставки siRNA в опухоль с использованием света в качестве внешнего стимула.¹²⁴ Как и для других видов умных липосом для доставки siRNA, тип полимера важен для разработки светочувствительных липосом в терапии рака. В предыдущей работе для доставки siRNA использовались липосомы, содержащие фотолабильный пептид (PCP). В этом случае остатки лизина на проникающем в клетки пептиде (CPP) покрывались защитными группами, образуя PCP. После облучения ближним инфракрасным светом (NIR) защитные группы расщепляются, и CPP вновь приобретает функциональность. Затем CPP усиливает интернализацию липосом в раковые клетки, увеличивая доставку siRNA к месту опухоли.¹²⁵ Применение CPP обусловлено повреждением клеток, вызванным ультрафиолетовым излучением. Рисунок 3A иллюстрирует механизм действия этих липосом, прошедших двойную модификацию. Воздействие каждого типа липосом, загруженных c-myc siRNA, приводило к обилию апоптотических клеток, как показано на рисунках 3B и C. Клетки, обработанные CPP pcCPP/NGR-LP и загруженные c-myc siRNA, показали самый высокий процент индуцированного апоптоза (рисунок 3D). В этом случае лизиновые остатки CPP связаны со светочувствительными группами для нейтрализации заряда. Воздействие инфракрасного излучения связано с размыканием фоточувствительных групп, что способствует взаимодействию CPP с клеточной мембраной и интернализации siRNA в опухолевые клетки.¹²⁶ Эти усовершенствованные липосомальные наноформулы весьма актуальны для терапии опухолей за счет повышения интернализации siRNA. Использование поверхностно-модифицированных липосом в качестве средств доставки siRNA и противоопухолевых агентов, которые усиливают подавление рака и способствуют их интернализации в раковые клетки посредством эндоцитоза, показано на рисунке 3E.^127-136 В таблице 3 приведены липосомы, применяемые для доставки siRNA при лечении рака.

FIGURE 3 Визуальное представление pcCPP/NRG-LP и измерение мРНК c-myc с помощью qRT-PCR. (A) Приготовление дважды модифицированных липосом для целевой доставки в опухоль после модификации лигандом NGR. Облучение этих липосом БИК-светом приводит к высвобождению PG и последующему взаимодействию CPP с клеточной мембраной для опосредованного проникновения липосом в раковые клетки; (B) применение Вестерн-блот анализа для исследования уровня экспрессии белка c-myc. (C) Наличие апоптоза. (D) Апоптоз клеток после воздействия различных составов. Воспроизведено с разрешения из ссылки. 126. Copyright (2015), Elsevier. (E) Поверхностно-модифицированные липосомы для доставки siRNA вместе с противоопухолевыми агентами с целью подавления рака. Модификация поверхности способствует проникновению липосом в раковые клетки путем эндоцитоза. Рисунок создан с помощью программы BioRender.com.

TABLE 3. he advantages of liposomal nanostructures in siRNA delivery.

3.3 shRNA delivery

shRNA - это дополнительные генетические инструменты, применяемые для лечения рака. shRNA относятся к семейству коротких не-кодирующих РНК (нкРНК) и снижают экспрессию генов аналогично siRNA. И shRNA, и siRNA - это короткие нкРНК, которые можно использовать для нокдауна генов. В предыдущем разделе мы обсудили роль siRNA и доставку липосом. Как и siRNA, использование shRNA имеет некоторые недостатки. По этой причине были разработаны различные векторы для доставки shRNA; они производят короткие дуплексные РНК в клетках, чтобы затем снизить экспрессию генов.¹⁴⁸ Процесс регуляции генов с помощью shRNA состоит из нескольких этапов. После того как векторы доставляют shRNA в клетки и после образования шпилечных РНК в ядре, происходит цитоплазматическая транслокация, обеспечивающая расщепление shRNA Dicer и ее последующее превращение в siRNA. Затем экспрессия гена-мишени снижается после встраивания siRNA в RISC.¹⁴⁹ С этого момента наблюдается большое сходство между siRNA и shRNA в сайленсинге генов.

Светочувствительные липосомы

3.3.1 Повышение эффективности shRNA

Основное преимущество использования липосом для доставки shRNA заключается в том, что эти наноносители могут обеспечивать длительное глушение генов-мишеней. Вирусные частицы могут опосредовать длительное глушение через доставку siRNA.¹⁵⁰ Однако липосомальные векторы предпочтительнее из-за их безопасности. Вирусные векторы ассоциируются с воспалением, иммуногенностью, мутагенезом и, что более важно, с риском онкогенной трансформации.^{151, 152} Кроме того, действие shRNA может продолжаться в течение длительного времени.¹⁵³ Именно поэтому в настоящее время исследования сосредоточены на разработке липосом для доставки shRNA и подавления рака. Недавно методом тонкопленочной гидратации были разработаны катионные липосомы с ПЭГилированием. Плазмиды, экспрессирующие shRNA Eg5, были сгенерированы с помощью инвертированных терминальных повторов (ITR). Этот процесс приводил к образованию шпилечной РНК Eg5, которая находилась под контролем промотора U6. Использование ITR при конфигурировании плазмид, содержащих Eg5 shRNA, позволило эффективно экспрессировать желаемый генетический материал¹⁵⁴.

Следующим шагом будет определение молекулярных путей, участвующих в выживании и пролиферации рака, с последующим введением соответствующих shRNA для снижения регуляции некоторых из этих путей. Повышение уровня Survivin часто встречается в различных видах рака и связано с ингибированием апоптоза.^155-157 Липосомы с Survivin-shRNA применялись для лечения различных видов рака, включая рак груди, печени, меланому и рак шейки матки. Снижение уровня Survivin под действием липосом происходит на уровне мРНК и белка, что имеет значение для сенсибилизации раковых клеток к апоптозу.¹⁵⁸ Другой важной мишенью в терапии рака является тимидилатсинтаза (TS), фермент, участвующий в биосинтезе опухолевой ДНК и сверхэкспрессирующийся при раке яичников.^{159, 160} Для ограничения перитонеального распространения рака яичников были применены катионные липосомы, нагруженные TS-shRNA. Эти нагруженные липосомы, содержащие различные концентрации TS-shRNA (0,5, 1 и 2 мг), вводили мышам внутрибрюшинно. Дальнейшие исследования показали, что сочетание липосом, нагруженных shRNA, с противоопухолевым препаратом PTX усиливает противоопухолевое действие препарата. Интересно отметить, что липосомы, нагруженные shRNA, при внутрибрюшинном введении обнаруживались в асците через 24 часа, что свидетельствует о высокой стабильности в перитонеальной полости. Кроме того, их системная токсичность была сведена к минимуму, поскольку они не попадали в кровоток.¹⁶¹ Путь введения также является важным аспектом, влияющим на профиль безопасности липосом, что было продемонстрировано в случае внутрибрюшинного введения.

Еще один способ улучшить способность липосом доставлять siRNA - совместить их с фокусированным ультразвуком (FUS). Наличие BBB снижает эффективность терапии рака мозга. Помимо диагностического применения, FUS можно использовать для открытия BBB не-инвазивным и обратимым способом.¹⁶² Это важно для повышения эффективности доставки shRNA липосомами и, следовательно, для лечения опухолей мозга.¹⁶³ Кроме того, разрушение микропузырьков, обусловленное ультразвуком, значительно повышает потенциал липосом, нагруженных shRNA в подавлении рака.¹⁶⁴ В целом, все эти исследования подтверждают использование липосом в качестве носителей для доставки shRNA и лечения рака. Липосомы, нагруженные shRNA воздействуют на различные гены, такие как Hsp70, eIF3i и WT1, и требуются дополнительные исследования, чтобы нацелить их на дополнительные молекулярные пути, ответственные за прогрессирование рака.^{18, 165, 166}

3.3.2 Повышение эффективности химиотерапии

Применение генетических инструментов, таких как shRNA, влияет на пролиферацию и инвазию раковых клеток и регулирует их ответ на терапию. Индуцирование клеточной гибели, например апоптоза, является распространенной и важной стратегией. Противоопухолевые соединения, как синтетические, так и природные, способны вызывать апоптоз.^167-169 Эта стратегия известна как химиотерапия и считается золотым стандартом лечения рака. Однако, поскольку раковые клетки могут активировать механизмы восстановления повреждений ДНК или запускать пути, способствующие развитию опухоли, чтобы предотвратить апоптоз, может развиться химиорезистентность.¹⁷⁰ Среди различных стратегий, применяемых для преодоления химиорезистентности, рассматривается использование shRNA, поскольку этот генетический инструмент может снизить экспрессию таких генов, как WT1, AMBRA1, Bcl-xL и PLK1, что в конечном итоге повышает химиочувствительность раковых клеток.^{171, 172} Преимущество использования липосом заключается в том, что они могут повышать эффективность подавления генов с помощью shRNA и одновременно служить платформой для доставки shRNA и противораковых соединений и достижения синергетического эффекта в терапии рака. На сегодняшний день в различных экспериментах использовались липосомы, нагруженные shRNA для химиотерапии рака. Катионные липосомы являются важным инструментом доставки генов благодаря их низкой иммуногенности и простоте синтеза.¹⁷³ Однако их эффективность трансфекции низка, что ограничивает их применение для лечения рака.¹⁷⁴ Поэтому модификация поверхности липосом такими агентами, как фолиевая кислота (ФК), может повысить их селективность по отношению к раковым клеткам.¹⁷⁵ shRNA обладает отрицательным зарядом, и катионные липосомы могут быть успешно использованы для их доставки. Для синтеза катионных липосом используются поверхностно-активные вещества Gemini, поскольку они имеют положительный заряд, многовалентные полярные головные группы и способны конденсировать отрицательно заряженную ДНК.^{176, 177} Для повышения эффективности терапии против гепатоцеллюлярной карциномы были разработаны катионные липосомы с тиоредоксин-1-shRNA и доксорубицином. Катионные липосомы, содержащие Gemini ПАВ с симметричными С16 алифатическими цепями (L16-2-16), обладают высокой клеточной абсорбцией и способностью к конденсации ДНК. Их модификация с помощью фолиевой кислоты способствует проникновению в раковые клетки, нацеливаясь на фолатные рецепторы и вызывая липидный raft/кавеолозависимый эндоцитоз. Комплекс shRNA/доксорубицин был соединен с катионными липосомами посредством электростатических взаимодействий. Комплекс успешно снижал жизнеспособность клеток, индуцируя апоптоз.¹⁷⁸ Кроме того, магнитные катионные липосомы, способные доставлять STAB1-siRNA и доксорубицин, были применены для эффективного лечения рака желудка. Доклинические эксперименты подтвердили роль липосом, нагруженных shRNA и доксорубицином, в снижении роста рака. Такой подход к совместной доставке более эффективен, чем одиночная доставка, что способствует синергетическому воздействию доксорубицина и STAB1-shRNA.¹⁷⁹ Помимо доксорубицина, липосомы способны обеспечивать адресную доставку DTX как еще одного мощного противоракового соединения.^{180, 181} Кроме того, shRNA и соответствующие системы доставки также применялись в комбинации с DTX.^{182, 183} Фактически, цель использования липосом в качестве наноструктур - обеспечить адресную доставку, что представляет интерес для повышения потенциала shRNA в глушении генов. Такая стратегия не только нарушает молекулярные пути, способствующие развитию опухоли, но и повышает чувствительность опухолей к химиотерапии.¹⁸⁴ В совокупности эти данные подтверждают использование липосом, нагруженных shRNA для повышения чувствительности рака к химиотерапии.¹⁸⁵

3.3.3 Advanced liposomal nanocarriers

В разделе 3.1 мы рассмотрели различные типы «умных» липосом для доставки siRNA. Аналогичным образом были разработаны усовершенствованные липосомальные носители для доставки shRNA. На сегодняшний день только pH- и GSH-чувствительные липосомы применялись для доставки shRNA при лечении рака, и в этом отношении необходимо проводить больше экспериментов. Недавно для лечения рака молочной железы были разработаны pH- и GSH-чувствительные липосомы, содержащие shRNA нацеленную на сурвивин. Липосомы были получены методом послойного нанесения, а полисахариды (хитозан и гиалуроновая кислота) были использованы для модификации поверхности, чтобы обеспечить чувствительность к окислительно-восстановительным процессам и способствовать проникновению в раковые клетки путем эндоцитоза. Затем Survivin-shRNA загружали в липосомы. Получился продукт HA/HAase/CS/liposome/survivin-shRNA (HCLR), как показано на рисунках 4A и B. Благодаря отрицательному заряду, обеспечиваемому гиалуроновой кислотой, эти липосомы продемонстрировали высокую стабильность в кровотоке. Воздействие слабокислого рН ТМЭ (рН = 6,5-6,8) приводит к деэкранированию гиалуроновой кислоты и протонированию хитозана, что подтверждается изменением дзета-потенциала от -23,1 до +29,9 мВ. Кроме того, воздействие на липосомальные наноносители 10 мМ GSH индуцирует высвобождение shRNA. Благодаря увеличению клеточного поглощения липосомы, нагруженные shRNA успешно снижали экспрессию сурвивина и подавляли рост рака.¹⁸⁶ Эти липосомы были использованы для совместной доставки shRNA и химиотерапевтических соединений. Адресная доставка DTX и сиртуина-1 (SIRT1)-shRNA с помощью липосом приводит к значительному уменьшению опухолевого бремени. Кроме того, pH-чувствительные липосомы более эффективны в терапии рака молочной железы по сравнению с не pH-чувствительными липосомами и клиническими аналогами, такими как Taxotere. Нагруженные shRNA липосомы, которые влияют на пролиферацию и метастазирование раковых клеток путем глушения целевого гена в лечении рака, обобщены на рисунке 4C и в таблице 4.187.

FIGURE 4 Изготовление наноносителей HCLR и нацеливание доставки генов in vivo. (A) Приготовление липосомальных наноносителей, чувствительных к рН и окислительно-восстановительным процессам, для высвобождения shRNA в месте расположения опухоли. (B) Путь синтеза. Воспроизведено с разрешения из Ref. 186, Copyright (2020), Американское химическое общество. (C) Подобно siRNA, эффективность shRNA в регуляции генов может быть повышена при использовании липосом для их доставки. Поверхностные модификации липосом не только улучшают их биосовместимость, но и повышают их селективность по отношению к раковым клеткам. Заглушение гена-мишени влияет на пролиферацию и метастазирование раковых клеток. Рисунок создан с помощью программы BioRender.com.

TABLE 4. ShRNA-loaded liposomes in cancer therapy.

3.4 MicroRNA delivery

МиРНК являются ключевыми представителями нкРНК. Большинство экспериментов, связанных с нкРНК, включают миРНК, что подтверждает их роль в различных заболеваниях. миРНК - это эндогенные короткие нкРНК длиной 18-24 нуклеотида, способные снижать экспрессию генов при связывании с 3'-нетранслируемой областью (3'-UTR) мРНК. миРНК осуществляют свою регуляцию на посттранскрипционном уровне.^189-192 Процесс биогенеза миРНК начинается в ядре. За ним следует транслокация в цитоплазму, где важную роль играют различные ферменты, такие как Drosha, Dicer и РНК-полимераза II. Свою полную функцию миРНК приобретают после встраивания в РНК-индуцированный комплекс сайленсинга (RISC) и взаимодействия с Argonaute.¹⁹³ МиРНК регулируют такие биологические события, как апоптоз, пролиферация, метастазирование и терапевтический ответ. Они дисрегулируются при различных заболеваниях, включая рак, и регулирование их уровня важно для лечения рака.^{76, 194, 195}

3.4.1 Совместная доставка

Как уже упоминалось в предыдущих разделах, химиорезистентность представляет собой все большую проблему в лечении раковых больных, и для ее преодоления необходимо применять новые стратегии. Генотерапия с использованием миРНК может рассматриваться как перспективная стратегия в этом отношении. Доксорубицин широко применяется для лечения гепатоцеллюлярной карциномы, а его совместное назначение с икаритином усиливает элиминацию рака за счет индукции иммуногенной гибели клеток.¹⁹⁶ Усиление экспрессии миРНК - еще одна стратегия, позволяющая потенцировать противоопухолевую активность доксорубицина.¹⁹⁷ Даунрегуляция miRNA-375 происходит в раковых клетках, устойчивых к доксорубицину, и усиление экспрессии miRNA-375 может помочь преодолеть резистентность к препарату.¹⁹⁸ Для эффективного лечения гепатоцеллюлярной карциномы были разработаны липосомы, нагруженные miRNA-375 и доксорубицином. Во-первых, высвобождение miRNA-375 из липосом значительно уменьшает прогрессирование гепатоцеллюлярной карциномы за счет индукции апоптоза. При этом происходит регрессия Bax, каспазы-3, JNK и p38, как показано на рисунке 5А. Кроме того, miRNA-375 может стимулировать арест клеточного цикла (фаза G2/M) и препятствовать прогрессии рака путем снижения регуляции молекулярных путей, таких как AEG-1, YAP1 и ATG7. Важно отметить, что липосомы, нагруженные miRNA-375, могут снижать уровень гена множественной лекарственной устойчивости 1 (MDR1), что повышает чувствительность клеток гепатоцеллюлярной карциномы к доксорубицину. В сравнении с контрольной группой по общей морфологии, другие группы показали явный эффект подавления роста опухоли (рис. 5B). Изучение рисунков 5C и D показывает, что в группах, получавших L-miR-375/DOX-NPs, опухоль постоянно подавлялась, имела наименьший объем, и среди этих групп не наблюдалось значительного снижения массы тела.¹⁹⁹

РИСУНОК 5 Комплексное изображение L-miR-375/DOX-NPs, которые работают в синергии для борьбы с опухолями и обращения вспять механизма лекарственной устойчивости при HCC. (A) Липосомальные наноносители в целевой доставке. МиРНК-375 действует в цитоплазме, а DOX - в ядре, подавляя прогрессирование рака. (B) Размер опухоли. (C и D) Кривые роста. Воспроизведено с лицензией CC-BY по ссылке. 199, Copyright (2017), Elsevier.

МиРНК-101 - еще один фактор-супрессор опухолей, который снижает экспрессию миелоидноклеточного лейкоза 1 (Mcl-1) и способствует повышению химиочувствительности (доксорубицин).²⁰⁰ Кодоставка миРНК-101 и доксорубицина с помощью липосом значительно повышает их внутриклеточное накопление в клетках гепатоцеллюлярной карциномы, что особенно важно для противоопухолевой активности. Проникая в ядро, доксорубицин индуцирует апоптоз за счет повышения активности Bax, JNK, p387 и p53. Кроме того, высвобождающаяся из липосом miRNA-101 снижает экспрессию NLK, Rab5A, Mcl-1, EZH2 и STMN1, которые отвечают за злокачественность рака. Наибольший ингибирующий эффект наблюдается при использовании липосом, нагруженных миРНК-101 и доксорубицином.²⁰¹

CP - еще один известный химиотерапевтический препарат, применяемый в лечении рака.²⁰² Из-за развития лекарственной устойчивости для доставки этого препарата были разработаны наночастицы, такие как липосомы.^{203, 204} МиРНК-1284 является супрессорным фактором, усиливающим противоопухолевую активность CP за счет снижения уровня бокса высокой подвижности 1 (HMGB1), ингибирования апоптоза и пролиферации.¹⁶³ При подавлении прогрессии рака шейки матки кодовое введение миРНК-1284 и CP через липосомы приводит к значительному апоптозу (60%) по сравнению с CP (20%) или только миРНК-1284 (12%). Увеличивая время циркуляции и снижая клиренс, липосомы эффективно доставляют миРНК-1284 и CP для снижения роста опухоли in vivo.²⁰⁵ Не существует однозначного плана по преодолению лекарственной устойчивости, каждый эксперимент предлагает свою стратегию. Исходя из уже проделанной работы, наилучшим вариантом считается совместная доставка генов и химиотерапевтических агентов с помощью наноносителей. Помимо благоприятного профиля биосовместимости и способности усиливать накопление генов и противоопухолевых агентов, липосомы применяются для преодоления лекарственной устойчивости. В следующем разделе мы покажем, как поверхностная модификация липосом может улучшить их профиль в качестве наноносителей для доставки генов и подавления рака.

3.4.2 Поверхностно-модифицированные липосомы

Липосомы могут быть настроены для воздействия на раковые клетки с помощью специфических рецепторов, которые избыточно экспрессируются на этих клетках. Выявив эти рецепторы, можно модифицировать липосомы, чтобы повысить их селективность по отношению к раковым клеткам. Tf - это белок плазмы крови, который необходим для транспортировки железа в клетки после связывания с рецептором Tf (TfR). TfR избыточно экспрессируется в гепатоцеллюлярной карциноме, что делает его отличной мишенью для поверхностной модификации липосом.^206-208 Химически модифицированные липосомы с Tf в качестве целевого лиганда были использованы для доставки анти-миРНК-221, которая подавляет рост рака печени, повышая уровни экспрессии гомолога фосфатазы и тензина (PTEN) и тканевых ингибиторов металлопротеиназы 3 (TIMP3).²⁰⁹ Помимо модификации лигандов, липосомы могут быть модифицированы различными полимерами, такими как ПЭГ, которые, как сообщается, улучшают их доставку и фармакокинетические характеристики.^{210, 211} ПЭГилирование улучшает системную циркуляцию липосом, что увеличивает их накопление в опухоли за счет эффекта ЭПР.¹⁴² Недавние достижения в области адресной доставки лекарств привели к разработке ПЭГилированных липосом на основе а-токоферола для доставки миРНК-134. Было установлено, что использование а-токоферола усиливает противоопухолевую активность липосом и обеспечивает синергетический эффект за счет ингибирования P-гликопротеина (P-gp). Доставка миРНК-134 через липосомы приводит к снижению регуляции вилочковой головки M1 (FOXM1), что приводит к последующему снижению пролиферации и выживаемости раковых клеток. Кроме того, было показано, что липосомы с miRNA-134 вызывают апоптоз раковых клеток до 38 %.²¹² Преимущество липосом заключается в том, что они обеспечивают адресную доставку miRNA, при этом обладают высокой биосовместимостью и оказывают минимальное негативное воздействие на эритроциты.²¹³

Повышение эффективности трансфекции - важнейший аспект доставки, опосредованной наноносителями, и аптамеры продемонстрировали свои перспективы в этом отношении.²¹⁴ В отличие от обычных антител, аптамеры обладают низкой иммуногенностью, высокой нацеливающей способностью, большей стабильностью и могут быть легко синтезированы.²¹⁵ Это делает их идеальным кандидатом для повышения селективности наноносителей. Сверхэкспрессия молекулы адгезии эпителиальных клеток (EpCAM) является отличительной чертой различных видов рака, в то время как в здоровых клетках она сохраняет нормальную экспрессию.^216-218 Аптамер EpCAM может быть использован для более специфичного воздействия на эти раковые клетки. С этой целью были разработаны функционализированные аптамерами EpCAM катионные липосомы для доставки миРНК-139-5p. Эти липосомы имеют размер частиц 15,3 нм и круглую форму. Дальнейшие исследования показали, что эти наноносители обладают незначительной скоростью гемолиза. После доставки они эффективно доставляли miRNA-139-5p в опухоль, что приводило к снижению роста и инвазии колоректального рака (рис. 6А-С)²¹⁹.

FIGURE 6 The fabrication of NPs and ANPs and in vivo targeting and биораспределение ANPs. (A) Приготовление наночастиц. (B) Флуоресцентные изображения in vivo ксенотрансплантированных мышей после внутривенного введения свободного DiR, DiR-NPs и DiR-ANPs в течение 1, 8, 24 и 48 ч. Пунктирными кругами обозначены опухолевые очаги у мышей. (C) Размеры опухолей. Воспроизведено с разрешения из ссылки. 219, Copyright (2019), American Chemical Society. (D) Липосомальные наноносители являются эффективными векторами для доставки миРНК и способствуют подавлению рака. Рисунок создан с помощью программы BioRender.com.

В отдельной серии экспериментов исследователи использовали аптамер AS1411 для модификации поверхности липосом для использования в терапии рака яичников. Результаты показали, что липосомы с аптамером miRNA-19b эффективно снижают пролиферацию и жизнеспособность клеток в данном конкретном контексте.²²⁰ Эти данные подчеркивают, что липосомы являются перспективным кандидатом для доставки миРНК, что может помочь ограничить прогрессирование рака. Кроме того, в сочетании с химиотерапевтическими препаратами липосомы могут повысить чувствительность раковых клеток. Также было показано, что встраивание миРНК в липосомы ингибирует нижележащие мишени, ответственные за прогрессирование рака.²²¹ Потенциал липосом, нагруженных миРНК, в терапии рака подробно рассмотрен в Таблице 5. Кроме того, на рисунке 6D схематично представлены липосомы, нагруженные миРНК, и механизмы их действия в подавлении рака.

TABLE 5. MiRNA-loaded liposomes in cancer therapy. Nanoarchitecture liposome composition

3.5 lncRNA delivery

LncRNAs - это нкРНК с различными физиологическими функциями в клетках.^223-225 LncRNAs имеют длину более 200 нуклеотидов и не кодируют белки.^226-228 РНК-полимераза II транскрибирует lncRNAs без трансляции. Все больше фактов свидетельствует о том, что lncRNA регулируют такие биологические события, как апоптоз, пролиферация и миграция, которые дерегулируются в различных опухолях.^{11, 229, 230} По этой причине lncRNA могут рассматриваться как диагностические и прогностические инструменты в онкологии.^231-234На сегодняшний день несколько исследований изучали роль липосом в доставке lncRNA и все они подтвердили потенциал этих наноносителей. Недавние работы показали, что липосомы, нагруженные анти-lncRNA, могут влиять на химиочувствительность опухоли шейки матки. Целенаправленная доставка анти-lncRNA редактора контрольной точки повреждения ДНК 1 через липосомы значительно уменьшает прогрессирование опухоли шейки матки. Эта противоопухолевая активность повышает чувствительность к оксалиплатину (рис. 7A-D).²³⁵

FIGURE 7 Доставка lncRNA с помощью нанолипосом для генной терапии рака. (A) Процедура введения препарата. (B) Введение препарата мышам. (C и D) Противоопухолевые испытания in vivo (C: размер пересаженной опухоли, D: кривая выживаемости). **p < 0.0001. Воспроизведено с лицензией CC-BY по ссылке. 235, Copyright (2017), International Journal of Nanomedicine. Это схема получения E/M@FA-LPs и их противоопухолевого эффекта. (E) Синтез наночастиц. (F) TEM-изображения. (G) МТТ-тест. (H) Исследование миграции опухолевых клеток, подвергшихся воздействию липосом. Воспроизведено с лицензией CC-BY по ссылке. 237, Copyright (2020), журнал Nature.

lncRNA metallothionein 1D pseudogene (MT1DP) - еще один фактор, экспрессия которого снижается при различных видах рака. Было показано, что повышение уровня экспрессии MT1DP коррелирует со снижением жизнеспособности и колониеобразования опухоли печени.²³⁶ Адресная доставка lncRNA MT1DP с помощью фолат-модифицированных липосом индуцирует ферроптоз в опухоли легкого. Таким образом, MT1DP способствует стабильности miRNA-365a-3p, что приводит к снижению уровня ядерного фактора эритроидного 2-родственного фактора 2 (Nrf2). При ингибировании Nrf2-сигнализации повышается уровень ROS, что приводит к ферроптозу и снижению жизнеспособности клеток рака легких (рис. 7E-H).²³⁷ Предыдущие работы показали, что липосомы, нагруженные siRNA, могут способствовать уничтожению рака. Поскольку siRNA является перспективным инструментом для снижения уровня lncRNAs. siRNA-нагруженные липосомы применялись для воздействия на lncRNAs при других заболеваниях.²³⁸ Поэтому данная стратегия может быть использована в будущих работах для воздействия на lncRNAs, ответственные за рост опухоли. Липосомы как эффективные наноносители могут повысить эффективность глушения генов.

3.6 Доставка CRISPR/Cas9

Системы CRISPR/CRISPR-ассоциированных белков (Cas) относятся к адаптивным иммунным системам архей и бактерий. В последние годы были предприняты значительные усилия, чтобы сделать CRISPR применимой для лечения заболеваний.^239-241 CRISPR/Cas9 - наиболее распространенный тип CRISPR-системы, которая вызывает расщепление двухцепочечной ДНК с помощью Cas9, эндонуклеазы, направляемой crRNA.²⁴² После расщепления ДНК активируются молекулярные механизмы, ответственные за редактирование генома, такие как негомологичное соединение концов (NHEJ) и пути гомологично направленной репарации.²⁴³ Эти механизмы могут приводить к соединению концов, вставке и делеции оснований или направленной мутации с использованием шаблона гомологичной репарации.^244-246 Недавно система CRISPR/Cas9 была применена для лечения различных видов опухолей, включая рак молочной железы, шейки матки, яичников и легких, путем воздействия на сигнальные сети. Помимо снижения прогрессии опухоли, система CRISPR/Cas9 может применяться для повышения чувствительности к лекарствам. Однако эта система страдает от вне-целевых эффектов, которые можно преодолеть с помощью векторов.^247-253 В этом разделе мы обсудим использование липосом для адресной доставки системы CRISPR/Cas9 при лечении рака.

Как уже упоминалось, система CRISPR/Cas9 - это новая стратегия регуляции генов, и благодаря простоте использования и синтеза она находит все большее применение в различных условиях. Двумя важными проблемами, ограничивающими ее эффективность при глушении генов, являются эффект «вне мишени» и деградация под действием ферментов. Сообщалось, что инкапсуляция системы CRISPR/Cas9 в липосомы защищает ее от деградации под действием ДНКазы I, обеспечивая при этом адресную доставку. Кроме того, липосомы позволяют контролировать высвобождение системы CRISPR/Cas9, что важно для повышения эффективности генной регуляции.²⁵⁴ В предыдущих разделах мы обсуждали разработку усовершенствованных липосом для доставки генов.²⁵⁵ Большинство липосом создаются на основе их реакции на внутренние стимулы, наиболее важным из которых является рН. Для улучшения адресной доставки CRISPR/Cas9 были созданы рН-чувствительные катионные липосомы, которые эффективно подавляют онкоген HR-HPV16E6/E7, что приводит к индукции апоптоза и снижению пролиферации клеток рака шейки матки. Эти липосомы обладают длительным временем циркуляции и высокой биосовместимостью. Кроме того, при интратуморальном введении мышам nude значительно снижается рост опухоли.²⁵⁶ По всем этим причинам они являются перспективными кандидатами для доставки CRISPR/Cas9 при лечении рака шейки матки.

Недавно была предпринята попытка использовать липосомно-темплатные гидрогелевые наночастицы (LHNPs) для доставки CRISPR/Cas9. По сравнению с другими типами наноносителей, такими как липидные наночастицы²⁵⁷ и наночипы ДНК²⁵⁸ , LHNP обладают двумя значительными преимуществами. Во-первых, LHNP могут обеспечивать доставку CRISPR/Cas9 в форме белка, что приводит к значительному повышению эффективности и специфичности.²⁵⁹ Во-вторых, LHNP могут пересекать BBB и доставлять систему CRISPR/Cas9 в мозг, что делает их пригодными для доставки генотерапии при опухолях мозга.^{126, 260, 261} Благодаря этим преимуществам была проведена работа по использованию LHNP для доставки CRISPR/Cas9 при лечении глиомы. Эти наноносители успешно снижают экспрессию polo-подобной киназы 1 (PLK1) для подавления прогрессии рака.²⁶² В связи с опухолепромотирующей ролью PLK1 в раке были предприняты значительные усилия для ингибирования этого фактора. Активация PLK1 отвечает за прогрессирование рака и устойчивость к лекарствам, в то время как его снижение оказывает антипролиферативное действие.^{263, 264} Для лечения рака простаты были разработаны липосомы, функционализированные аптамерами и содержащие CRISPR/Cas9 для манипулирования PLK1. На рисунке 8A показано поглощение флуоресцентно меченного CRISPR/Cas9 в цитоплазме клеток. Химеры липосом с аптамером A10 продемонстрировали наиболее мощный эффект сайленсинга генов благодаря эффективной доставке CRISPR/Cas9 в клетки LNCaph. На рисунке 8В показано, что в клетках LNCaph наблюдается апоптоз, вызванный снижением уровня PLK-1. Модификация липосом аптамерами приводит к избирательному воздействию на клетки рака простаты, сверхэкспрессирующие простат-специфический мембранный антиген (PSMA)²⁶⁵.

FIGURE 8 Липосомы для доставки CRISPR/Cas9 и лечения рака. (A) Воздействие липосом на опухолевые клетки. (B) Анализ апоптоза. Воспроизведено с лицензией CC-BY,265 Copyright (2017), Oncotarget.

Еще одна проблема в терапии рака связана с тем, что раковые клетки могут стимулировать молекулярные пути, которые отвечают за снижение противоопухолевого иммунитета. Активация сигналинга запрограммированной смерти-1 (PD-1) приводит к центральной и периферической Т-клеточной толерантности. В связи с ролью сигналинга PD-1 в снижении пролиферации Т-клеток и токсичности против раковых клеток были разработаны ингибиторы для эффективной иммунотерапии рака.^266-268 Система CRISPR/Cas9 была применена для регулирования PD-1 и, в конечном итоге, для усиления противоопухолевого иммунитета, подавления роста опухоли и активации рецепторов, полезных для иммунотерапии рака.^{269, 270} Недавно в терапии рака была применена комбинация липосом, нагруженных CRISPR/Cas9, и дендритных/опухолевых сливающихся клеток (FCs). Липосомы, нагруженные CRISPR/Cas9, привели к снижению регуляции PD-1 в Т-клетках, за чем последовала их активация FCs. Эта комбинация значительно усиливала пролиферацию Т-клеток, секрецию провоспалительных цитокинов, таких как интерферон-a (IFN-a), и уничтожение клеток HepG2.²⁷¹ Данное исследование продемонстрировало роль CRISPR/Cas9-нагруженных липосом в усилении противоопухолевого иммунитета через снижение регуляции PD-1. Для подтверждения истинного потенциала CRISPR/Cas9-нагруженных липосом в подавлении рака и стимулировании противоопухолевого иммунитета необходимы дополнительные эксперименты (табл. 6).

TABLE 6. CRISPR/Cas-loaded liposomal nanocarriers in cancer therapy.

4 LIPOSOME RELEASE KINETICS

Проведение исследований кинетики высвобождения in vitro необходимо для лучшего понимания профиля высвобождения полезной нагрузки РНК из генных носителей на основе липосом с течением времени. Эти исследования позволяют получить критическое представление о кинетике высвобождения РНК, включая скорость и степень высвобождения. Такая информация необходима для оптимизации дизайна и эффективности систем доставки РНК, опосредованной липосомами.²⁷³ С этой целью исследования кинетики высвобождения in vitro имеют решающее значение для разработки эффективных платформ доставки генов.²⁷⁴ Существует множество факторов, влияющих на поведение высвобождения генов в нанолипосомах.²⁷⁵ На кинетику высвобождения генов в липосомных носителях существенно влияет липидный состав носителя. Физико-химические свойства различных липидов, присутствующих в носителе, могут существенно изменять проницаемость и стабильность липосомной мембраны, тем самым влияя на скорость и механизм высвобождения генов. Следовательно, необходимо тщательно выбирать липиды с соответствующими физико-химическими свойствами для оптимизации кинетики высвобождения генов в липосомных носителях.¹⁸ На инкапсуляцию генов в липосомах может влиять используемый метод, который впоследствии может повлиять на кинетику высвобождения. Такие методы, как гидратация липидной пленки, соникация или экструзия, могут привести к изменению эффективности загрузки груза и поведения высвобождения. Важно отметить, что выбор метода инкапсуляции должен осуществляться с тщательным учетом желаемого профиля высвобождения, а также стабильности и целостности инкапсулированного материала.⁵⁴ Модификации поверхности, такие как ПЭГилирование или конъюгация лигандов, как было показано, влияют на кинетику высвобождения генов и взаимодействие липосом с биологической средой. Стелс-покрытия могут увеличить время циркуляции и изменить профиль высвобождения, а таргетные лиганды могут повысить специфичность и направить высвобождение в определенные места. pH-чувствительные липиды, включенные в липосомальные мембраны, позволяют запускать высвобождение в ответ на изменение pH, например, в эндосомах или лизосомах. Механизмы рН-зависимого высвобождения играют решающую роль в усилении цитоплазматической доставки генов. Способность модулировать взаимодействие липосом с биологической средой позволяет исследователям и клиницистам адаптировать системы доставки лекарств для удовлетворения конкретных терапевтических потребностей.²⁷⁶

Yang и др.²⁷⁷ разработали долго циркулирующие и катионные липосомы в качестве системы доставки siRNA для улучшения ее поглощения клетками и ингибирования экспрессии VEGF в раковых клетках. Эффективность катионных липосом была оценена с помощью исследований сортировки клеток с флуоресцентной активацией и конфокального лазерного сканирования, которые продемонстрировали повышенное поглощение меченной флуоресценцией siRNA в раковых клетках. Полученные результаты свидетельствуют о том, что катионные липосомы могут служить перспективной платформой для адресной доставки siRNA при лечении рака.²⁷⁷

Yang и др.¹³⁹ создали новую систему таргетинга siRNA, которая объединяет качества биологического и физического таргетинга siRNA для использования в магнитной гипертермии-триггерном высвобождении. Система включает в себя клеточно-проницаемые пептиды (CPPs) и магнитные материалы. Они загрузили конъюгат siRNA-CPP в термо- и магнитные липосомы с двойной чувствительностью и протестировали активность высвобождения, эффективность глушения генов, целевое поглощение клетками, целевую доставку in vivo и противоопухолевую активность siRNA-CPPs in vitro. Используя магнитную жидкость Fe3O4, они успешно достигли TML-высвобождения термически инициированных siRNA-CPPs в клетке. Это исследование демонстрирует, что такие двойные чувствительные везикулы имеют большой потенциал для эффективной доставки siRNA для онкотерапии¹³⁹.

Nahire и др.¹¹¹ разработали систему, в которой используется рН-тергетируемое высвобождение хогенности и содержимого из липосом. Система использует преимущества образования пузырьков газа CO₂ при инкубации липосом в кислых буферах pH, что приводит к эхогенности липосом. Структурные изменения в липосомах, вызванные выходом пузырьков газа, способствуют высвобождению инкапсулированного содержимого, причем потенциальная скорость высвобождения может достигать 56 %. Исследователи также продемонстрировали, что кинетика высвобождения системы может быть улучшена при одновременном применении ультразвука диагностической частоты (1 МГц, 5 минут), что приводит к высвобождению на 80 %. Эти результаты могут способствовать развитию систем доставки лекарств, позволяя целенаправленно высвобождать инкапсулированное содержимое в ответ на определенные стимулы¹¹¹

Кинетика высвобождения генов из липосомных носителей имеет решающее значение для определения эффективности и специфичности доставки генов в терапевтических целях. Глубокое понимание факторов, влияющих на поведение высвобождения, и использование соответствующих экспериментальных методик может способствовать разработке оптимизированных липосомных составов, обеспечивающих точную и эффективную доставку генов. Таким образом, выяснение кинетики высвобождения генов из липосом имеет огромные перспективы для развития стратегий генотерапии и решения проблем, связанных с доставкой нуклеиновых кислот в биомедицинских исследованиях и клинической практике.

5 ЛИПОСОМЫ И ОПРЕДЕЛЯЮЩИЕ ФАКТОРЫ

Несмотря на то что в предыдущих разделах продемонстрирована эффективность липосом в генотерапии рака, в дальнейшей работе, направленной на разработку эффективных липосомных наноносителей для генотерапии рака, следует учитывать некоторые ключевые факторы. Липидный состав липосом влияет на их способность доставлять гены. Например, сообщалось, что при введении катионных липосом, загруженных siRNA, липиды с аминовой головной группой, линкерным плечом и длиной алкильных групп влияют на биораспределение siRNA.²⁷⁸ Кроме того, для индукции процесса слияния важна коническая форма ароматических молекул и их наличие. Примечательно, что состав липидов и образование комплекса с генетическими инструментами влияют на размер и дзета-потенциал липосом, что приводит к изменениям в биораспределении.²⁷⁹ Липосомы с размером частиц 5-50 нм выводятся с мочой или накапливаются в печени. Однако при дальнейшем увеличении размера уменьшается проникновение в раковые клетки, что ограничивает их клеточное поглощение и эффективность трансфекции.²⁸⁰ Следовательно, необходимо учитывать влияние комплекса ДНК на размер липосом. Помимо размера, еще одним фактором, влияющим на функциональность липосом, является поверхностный заряд или дзета-потенциал. После связывания с генетическими инструментами, такими как siRNA, дзета-потенциал липосом снижается из-за их отрицательного заряда. Кроме того, катионные липосомы доставляют генетические инструменты, которые вызывают активацию иммунной системы и агрегацию (из-за низкого электростатического отталкивания).²⁸¹ Наконец, белковая корона - еще один фактор, влияющий на поведение липосом. При введении in vivo на поверхности наночастиц абсорбируется несколько белков, составляющих биологический профиль конкретного наноносителя.²⁸² Организм видит и взаимодействует с белковой короной, а не с синтетической поверхностью наноносителя. Поэтому белковая корона влияет на судьбу наночастицы in vivo.^{283, 284} Сообщалось, что липосомы уменьшаются в размерах после контакта с плазмой крови. Липидный состав определяет взаимодействие липосом с белками плазмы. Липосомы, содержащие 1,2-диолеоил-3-триметиламмонийпропан (DOTAP), взаимодействуют с витронектином, а липосомы, содержащие DOPE, специфически взаимодействуют с аполипопротеинами.²⁸⁵ Такие взаимодействия значительно влияют на судьбу наночастиц. Например, липосомы демонстрируют высокое клеточное поглощение гепатоцитами при взаимодействии с аполипопротеинами B и E.²⁸⁶ В целом, размер, дзета-потенциал, белковая корона и липидный состав определяют биораспределение и судьбу липосом. Эти параметры должны быть тщательно определены перед использованием липосомальных наноносителей для доставки генетических инструментов.

Использование гистопатологии в исследованиях, посвященных липосомам или модифицированным липосомам, может дать значительное представление о потенциальных побочных эффектах и тканевых реакциях, связанных с их применением. Гистопатологический анализ позволяет изучить клеточные и тканевые изменения, такие как воспаление, некроз, фиброз и другие патологические изменения, которые могут возникнуть после введения липосом. Этот подход очень важен для исследователей, поскольку он предоставляет важную информацию о безопасности и эффективности липосом и модифицированных липосом, повышая тем самым их трансляционный потенциал. Гистопатологические исследования - важнейший аспект изучения долгосрочных последствий воздействия липосом. Эти данные дают представление о потенциальной токсичности и ремоделировании тканей. Соотнося гистопатологические данные с другими конечными точками, такими как биохимические анализы и функциональные оценки, исследователи могут получить полное представление о профиле безопасности и терапевтической эффективности липосом. Такой подход позволяет более тщательно оценить липосомы.

Zhu et al.287 использовали катионные липосомы на основе пептидов для проведения гистопатологических исследований на мышах с целью выявления возможных повреждений или воспалений тканей. Мышей осматривали три раза в день, и исследователи не обнаружили никаких заметных гистопатологических изменений в срезах тканей почек и селезенки после введения CDO14 и DOTAP.

Zhang и др.²⁸⁸ использовали липосомную технологию для воздействия на макрофаги М2 в своем подходе к генной терапии, направленном на разработку липосом, нагруженных siRNA (siIKKβ-ML), которые ингибируют киназу kappa В β (IKKβ). При изучении результатов эксперимента, целью которого было эффективное перепрограммирование фенотипа М1 и предотвращение проангиогенных функций, было отмечено, что по сравнению с контрольной группой не было выявлено значительных отклонений в структуре сетчатки ни при интравитреальном введении siIKKβ-ML, ни при введении свободной siIKKβ, что было определено с помощью оптической когерентной томографии и гистопатологического исследования.

Quin et al.²⁸⁹ разработали липосомы, модифицированные перфтороктилбромидом (PFOB@Lipo) для облегчения загрузки кислорода и его адресной доставки к опухолевым очагам. С помощью этого подхода они намерены облегчить гипоксические условия, характерные для опухолей. Затем, чтобы подавить прогрессирование опухоли, PAR-Lipo был использован для высокоэффективной доставки гена-супрессора pTP53. Для оценки апоптоза клеток исследователи использовали анализ TUNEL и окрашивание гематоксилином и эозином. Результаты показали, что сочетание апоптотических клеток достигло максимального уровня. Модифицированный PAR-Lipo/pTP53, созданный этим методом, неизменно демонстрировал эффективность в уничтожении опухолевых клеток. Для сравнения групп были проведены гистопатологические анализы тканей, и не было отмечено никаких значительных отклонений по сравнению с контрольной и другими группами, что свидетельствует о хорошей биосовместимости терапевтической процедуры. В итоге было установлено, что O2@PL способен переносить кислород для устранения гипоксии в опухоли, что усиливает его противоопухолевую способность в генной терапии.

Arora и др.²⁹⁰ использовали модифицированный липосомный подход к лечению болезни Альцгеймера, создав плазмидную ДНК, кодирующую ApoE2 (pApoE2). Липосомы нацелены на специальный транспортер глюкозы-1 (glut-1), ориентированный на мозг. Липосомы подверглись поверхностной функционализации путем включения лиганда маннозы и CPP, нацеленного на glut-1. Цель этой модификации заключалась в повышении способности липосом нацеливаться на мозг и улучшении их клеточной интернализации. Биосовместимость и безопасность липосом оценивали с помощью гистопатологического анализа тканей и сравнивали с солевым контролем. Анализ показал отсутствие признаков нарушения морфологии, воспалительной клеточной инфильтрации или некроза в тканях любого из исследованных органов. Кроме того, в тканях мозга обработанных мышей не было обнаружено ядер неправильной формы или каких-либо других отклонений. В тканях печени не было обнаружено признаков вздутия или воспаления, в тканях сердца - разрушения мышечных волокон или потери миофибрилл, а в легких - признаков легочного фиброза. Согласно результатам исследования, липосомы с двойным функционалом демонстрируют безопасность при использовании в живых организмах. В образцах тканей, собранных у животных, получавших препараты, не наблюдалось никаких нежелательных эффектов, включая гибель клеток или воспаление. Это указывает на то, что данные липосомы обладают значительным потенциалом в качестве средства доставки генов для лечения болезни Альцгеймера.

Включение гистопатологической оценки в доклинические и клинические исследования липосом или модифицированных липосом является важнейшим шагом для всесторонней оценки их безопасности и понимания возможных побочных эффектов. Благодаря выяснению реакций на тканевом уровне и механизмов действия гистопатология играет важную роль в рациональном проектировании и оптимизации липосомальных систем доставки лекарств для терапевтического применения. Давая представление о структурных и функциональных изменениях, связанных с введением липосом, гистопатологические анализы способствуют более полному пониманию безопасности и эффективности этих систем. Поэтому исследователи и клиницисты должны включать гистопатологическую оценку в качестве неотъемлемого компонента своих исследований для оптимизации терапевтического потенциала липосомных систем доставки лекарств.

Светочувствительные липосомы

6 ДОКЛИНИЧЕСКИЕ И КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ: ПРОГРЕСС И ПРЕПЯТСТВИЯ

На сегодняшний день проведены эксперименты, подтверждающие роль липосом в генотерапии рака. Эксперименты ^{in vitro} показали, что липосомальные наноносители, содержащие siRNA, могут снижать уровень экспрессии целевых генов и, следовательно, уменьшать прогрессирование рака. Эксперименты in vivo показали защиту siRNA с помощью липосом, которые обеспечивают адресную доставку в опухолевый очаг и высокое клеточное поглощение. Эти свойства жизненно важны для подавления роста и метастазирования рака in vivo. Благодаря прогрессу в области биоинформатики были выявлены молекулярные пути, ответственные за развитие рака, на которые нацелены липосомы с генами. Кроме того, при распознавании рецепторов на поверхности клеток можно использовать соответствующие антитела или лиганды для повышения селективности липосом по отношению к раковым клеткам. Модификация поверхности липосом была использована в доклинических исследованиях. Для оптимизации интернализации липосом в опухолевую ткань были разработаны усовершенствованные липосомы, чувствительные к рН, свету и окислительно-восстановительным процессам. Наконец, была разработана совместная доставка противоопухолевых соединений и генетических инструментов с помощью липосом, что подтверждает роль липосом в генотерапии рака. Однако клиническое применение липосом требует дальнейшей оптимизации их синтеза.

Крупномасштабное производство липосом представляет собой одну из потенциальных проблем. Необходимо найти новый и экономически эффективный способ синтезировать липосомы в масштабах, необходимых для клинического применения. Другой проблемой является биосовместимость липосом, нагруженных генами. Сообщалось, что при увеличении дозы липосом происходит одновременное усиление их побочных эффектов. Катионные липосомы, нагруженные siRNA, демонстрируют частичную токсичность при низких дозах. Однако увеличение их концентрации приводит к воспалению легких и повреждению печени. Это опосредовано высвобождением провоспалительных цитокинов, таких как TNF-α и IL-6, и снижением уровня противовоспалительных цитокинов, таких как IL-10.²⁸⁷ Поскольку высокие дозы липосом должны применяться для лечения раковых больных, остается открытым вопрос о том, как можно преодолеть такую зависимую от концентрации токсичность. Эти вопросы должны быть решены до коммерциализации и клинического применения. Клинические исследования, представленные в таблице 7, представляют собой попытки изучить потенциал систем доставки генов на основе липосом для генотерапии рака. В этих исследованиях оценивается безопасность и эффективность липосомальных векторов в доставке терапевтических генов в опухолевые клетки, что способствует разработке новых стратегий лечения онкологических больных.

TABLE 7. Clinical trials of lipoplex-based delivery systems for cancer treatment.

7 CONCLUSIONS AND REMARKS

Генотерапия рака на основе нанолипосом представляет собой многообещающий подход к решению проблем, связанных с ограничениями традиционных методов лечения рака. Многогранная природа нанолипосом позволяет точно контролировать доставку лекарств, обеспечивая целенаправленную и эффективную доставку терапевтических агентов в опухолевые очаги при минимизации системной токсичности. Однако, несмотря на значительный прогресс, достигнутый в этой области, предстоит решить несколько важнейших задач, чтобы облегчить клиническое применение терапии на основе нанолипосом. Одной из таких задач является оптимизация дизайна нанолипосом для повышения стабильности, специфичности и вместимости полезной нагрузки. Достижения в области липидного состава, модификации поверхности и таргетных лигандов способны повысить терапевтическую эффективность нанолипосом и преодолеть существующие ограничения.

Кроме того, для обеспечения клинической применимости терапии на основе нанолипосом необходимо тщательно оценить профиль безопасности. Иммуногенность, долгосрочная токсичность и потенциальное неблагоприятное воздействие на здоровые ткани - важнейшие аспекты, которые должны быть рассмотрены в ходе всесторонних доклинических исследований и клинических испытаний. Кроме того, разработка инновационных стратегий по снижению иммуногенности и повышению биосовместимости нанолипосом будет иметь большое значение для их широкого внедрения в клиническую практику.

Помимо решения проблем безопасности, будущие исследования должны быть направлены на использование синергетического эффекта от совместной доставки нескольких терапевтических агентов с помощью нанолипосом. Комбинированные методы лечения, включающие генные конструкции, химиотерапевтические препараты и иммуномодулирующие агенты, способны значительно улучшить терапевтические результаты и преодолеть резистентность к лечению у онкологических больных. Кроме того, интеграция передовых технологий редактирования генов, таких как CRISPR/Cas9, открывает захватывающие возможности для точного нацеливания и модуляции генов, связанных с раком, прокладывая путь к персонализированному и индивидуальному лечению.

В целом, генная терапия рака на основе нанолипосом открывает огромные перспективы для революционного изменения парадигмы лечения рака. Решая существующие проблемы и внедряя новые технологии, нанолипосомы способны изменить ландшафт лечения рака и улучшить результаты лечения пациентов. Постоянное сотрудничество между исследователями, клиницистами и заинтересованными сторонами промышленности необходимо для стимулирования инноваций, продвижения клинических разработок и, в конечном счете, вывода терапии на основе нанолипосом на передовые позиции в лечении рака. Благодаря совместным усилиям нанолипосомы могут стать мощным инструментом в борьбе с раком и подарить надежду пациентам и их семьям во всем мире.

Nanoliposomes as nonviral vectors in cancer gene therapySafiye Nur Yildiz, Maliheh Entezari, Mahshid Deldar Abad Paskeh, et al. MedComm, Volume 5, Issue 7 e583

Nanoliposomes as nonviral vectors in cancer gene therapy
Safiye Nur Yildiz, Maliheh Entezari, Mahshid Deldar Abad Paskeh, et al.
MedComm, Volume 5, Issue 7 e583