Согласно данным исследования The Global Burden of Disease (ghdx.healthdata.org), в 2019 году в мире от сердечно-сосудистых заболеваний (CVDs) умерло более 18,5 миллиона человек. Это число соответствует 32,8 % всех смертей и делает CVDs основной причиной смерти. Среди спектра CVDs большинство смертей приходится на инфаркт миокарда (MI) и инсульт. Если MI не приводит к смерти пациента, он обычно приводит к сердечной недостаточности (HF). Однако у HF есть разные этиологии: ишемическая, вальвулярная, гипертоническая или обусловленная кардиомиопатиями. Показатель 5-летней выживаемости при сердечной недостаточности схож с таковым при раке и инсульте и, таким образом, вносит свой вклад в общую смертность от CVDs. Во всем мире число людей, страдающих сердечной недостаточностью, достигло 63,3 миллиона. Существует множество классов фармакологических препаратов, которые используются для лечения сердечной недостаточности, но некоторые пациенты с сердечной недостаточностью не отвечают адекватно на фармакологическую терапию и нуждаются в вспомогательных устройствах, а затем в трансплантации сердца в качестве спасительной терапии. Однако нехватка донорских органов существенно ограничивает возможности трансплантации сердца, поэтому с начала тысячелетия в качестве альтернативы интенсивно изучаются клеточные методы лечения. В этом обзоре мы начнем с обсуждения вопроса о существовании стволовых клеток сердца, поскольку большинство органов нашего тела содержат стволовые клетки, способные к той или иной степени регенерации. К сожалению, как показано ниже, это не относится к сердцу.

Существование стволовых клеток в тканях взрослого человека связано с высокими показателями пролиферации в этих тканях. Гемопоэтическая стволовая клетка является прототипом стволовой клетки взрослого человека, дающей начало всем типам клеток крови с обновлением миллиардов клеток в день. Сердце, бесспорно, не является пролиферирующим органом, но споры о его ограниченной пролиферативной способности начались еще в прошлом веке, когда активно обсуждался физиологический и патологический рост взрослого сердца за счет гиперплазии и/или гипертрофии. Karsner и соавторы в 1925 году сообщили, что макроскопическая гипертрофия сердца происходит за счет увеличения размера клеток, а не за счет увеличения их количества, и не обнаружили в сердце взрослого человека фигур митозов. В 1947 году Linzbach предположил, что человеческое сердце растет за счет гипертрофии до критического веса, после достижения которого происходит дальнейший рост за счет гиперплазии, основываясь на данных морфометрии.¹ К концу тысячелетия в литературе все еще велись споры о пролиферативной способности взрослых кардиомиоцитов, основанные на включении меченых нуклеотидов в ДНК клеток сердца грызунов. Споры велись вокруг того, какие типы клеток в сердце принимают меченые нуклеотиды, в результате чего оценки индекса мечения для кардиомиоцитов варьировались от более чем 20 до более чем 900 раз.^2,3 Такие большие колебания имели важные последствия для регенеративного потенциала кардиомиоцитов, особенно после повреждений органа. Окончательные доказательства обновления кардиомиоцитов появились в 2009 году, когда Bergmann и соавторы с помощью интеграции углерода-14, полученного в результате испытаний ядерной бомбы во время холодной войны, в ДНК определили возраст кардиомиоцитов, составляющих человеческое сердце. Они подсчитали, что полное обновление клеток за всю жизнь человека соответствует примерно 50 % кардиомиоцитов.⁴

Еще более спорным является вопрос о существовании стволовых клеток взрослого сердца. Было описано несколько различных кандидатов⁵ , но при ежегодном обновлении кардиомиоцитов на 1% очень маловероятно, чтобы сердце содержало множество предшественников кардиомиоцитов. Четыре наиболее изученных подмножества предполагаемых стволовых клеток сердца были выделены на основании наличия маркеров клеточной поверхности (c-kit-позитивные клетки), формирования сфер из тканей эксплантата сердца (клетки, полученные из кардиосферы), способности к efflux (утечки) красителя Hoechst (определение побочной популяции -SP-клеток) и экспрессии гена островков-1. Наиболее изученной и спорной предполагаемой сердечной стволовой клеткой (CSC была c-kit-позитивная CSC. Впервые описанные группой Anversa в 2003 году c-kit+CSCs были обнаружены у мышей, крыс, собак и людей как способные генерировать кардиомиоциты, эндотелиальные и гладкомышечные клетки. Значительное число работ этой группы, характеризующих эти клетки, было отклонено. Тем не менее, клетки c-kit+ присутствуют в сердце, и научные споры велись вокруг их способности генерировать кардиомиоциты. В 2013 году Ellison и др.⁶ использовали лентивирусные векторы, экспрессирующие промотор c-kit, для экспрессии CRE и маркировки c-kit+ CSCs в репортерных мышах. После индуцирования повреждения сердца изопротеренолом авторы описали значительное количество меченых новых кардиомиоцитов, а абляция c-kit+ CSC привела к тяжелой кардиомиопатии, что указывает на то, что c-kit+ CSC необходимы и достаточны для регенерации сердца. Год спустя ван Berlo и др.⁷ создали трансгенную мышь c-kit для экспериментов по отслеживанию линий путем нокаута Cre под эндогенным промотором c-kit, либо конститутивно, либо индуцированно. После скрещивания этих мышей с мышами ROSA-26 van Berlo сообщил о мечении всех потомков c-kit+ CSC, но обнаружил очень мало меченых кардиомиоцитов, большинство из которых, по мнению авторов, были обусловлены слиянием клеток. Аналогичные результаты с использованием стратегии Cre knock-in были получены двумя независимыми группами в последующие два года.^8,9 Начались активные дебаты об ограничениях стратегии knock-in в локусе c-kit, и в 2018 году Vicinanza et al.¹⁰ утверждали, что Cre knock-in в локусе c-kit недостаточно чувствителен для отслеживания клеток c-kit^low и что стратегия knock-in приводит к гаплонедостаточности экспрессии c-kit. Эти ограничения привели бы к снижению маркировки кардиомиоцитов c-kit+ CSC. Чтобы устранить эти ограничения, He et al.¹¹ создали двух новых kit-Cre трансгенных мышей, которые эффективно маркировали все c-kit+ клетки и не нарушали экспрессию эндогенного c-kit путем вставки Cre после последнего экзона c-kit. Тем не менее, они обнаружили, что c-kit+ CSCs не способствуют образованию новых кардиомиоцитов ни в период гомеостаза, ни после травмы. На наш взгляд, совокупность полученных экспериментальных результатов ставит под сомнение существование этой предполагаемой сердечной стволовой клетки, и преобладающая парадигма заключается в том, что взрослое сердце не содержит истинных стволовых клеток.^12,13 Обновление кардиомиоцитов, продемонстрированное Bergmann⁴ и соавторами, в настоящее время объясняется дедифференцировкой и пролиферацией существующих кардиомиоцитов. Тем не менее, дальнейшие исследования молекулярной судьбы одноклеточных могут преподнести сюрпризы в будущем.

Для клеточной терапии сердечных заболеваний использовались различные животные модели. Наиболее распространенными были модели грызунов, имитирующие ишемическую болезнь сердца, вызванную постоянной или преходящей окклюзией левой передней нисходящей коронарной артерии, как показано в таблице 1. Для этой цели использовались и более крупные животные, но в гораздо меньших масштабах. Другие моделируемые сердечные заболевания включают кардиомиопатию, вызванную антрациклинами, кардиомиопатию, вызванную перегрузкой давлением, и шагасовую кардиомиопатию. Более одиннадцатисот полнотекстовых исследований с использованием клеточной терапии на этих моделях можно найти в Pubmed . Первая волна опубликованных работ была посвящена скелетным миобластам в начале 1990-х годов^14,15 благодаря аутологичности и легко расширяемым свойствам этих клеток в культуре и убежденности в том, что они могут интегрироваться в миокард как кардиомиоциты. Однако в самом начале работы Murry показал, что скелетные миобласты не образуют кардиомиоцитов и сохраняют свойства скелетных мышц, не экспрессируя белок коннексин-43, который препятствует их электромеханической интеграции в миокард хозяина.^16,17 На рубеже тысячелетий в игру вступили клетки, полученные из костного мозга, на основании литературных данных, подтверждающих предполагаемую плюрипотентную способность этих клеток.^18-22 Большинство сообщений о результатах использования этих клеток были положительными, а в качестве механизма действия предлагалась трансдифференцировка клеток, полученных из костного мозга, в типы кардиомиоцитов. После того как было доказано, что плюрипотентность клеток, полученных из костного мозга, является артефактом^23-25, предполагаемый механизм действия перешел к паракринному выделению клетками, полученными из костного мозга, факторов роста, ангиогенных и анти-апоптотических факторов. Следующая волна доклинических клеточных терапий включала мезенхимальные стволовые клетки, полученные из костного мозга или жировой ткани, и была одинаково успешной в лечении повреждений сердца, вызванных ишемией, антрациклинами или T. cruzi (паразитом, вызывающим шагасовую (chagasic) кардиомиопатию). Первоначально считалось, что MSC также дифференцируются в кардиомиоциты,²⁶ но позже положительный эффект объяснили паракринным действием.^27,28 В следующую волну вошли все типы предполагаемых сердечных стволовых клеток.^5,29-33 Среди предпочитаемых типов клеток были сердечные c-kit позитивные клетки и клетки, полученные из кардиосфер, о которых говорилось в предыдущем разделе. Большинство результатов, за заметными исключениями^34,35 , были исключительно положительными и объяснялись образованием новых кардиомиоцитов и сосудистых клеток предполагаемыми стволовыми клетками сердца. В последней волне клеточной терапии сердечных заболеваний использовались действительно плюрипотентные стволовые клетки, эмбриональные или индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, для получения кардиомиоцитов, которые вводились в сердца грызунов,^36-38 свиней³⁹ и нечеловеческих приматов.^40,41 Приживление кардиомиоцитов, введенных непосредственно в миокард, было надежным и улучшало сердечную функцию, однако при использовании ЭESC или iPSC-произведенных кардиомиоцитов в модели нечеловеческих приматов возникали преходящие аритмии. Недавно был представлен новый метод клеточной терапии для борьбы с фиброзом в сердце. Было показано, что Т-клетки, сконструированные ex vivo и in vivo для экспрессии химерного антигенного рецептора белка активации фибробластов (CAR-T-клетки), уменьшают фиброз в ангиотензин-фенилэфриновой модели гипертонического повреждения сердца.^42,43

Table 1 Cell therapy for cardiovascular diseases in pre-clinical models.

Поиск в Pubmed показал, что было проведено не менее 238 клинических исследований с использованием клеточной терапии при различных патологиях сердца. Около 138 из них были рандомизированными контролируемыми исследованиями. Мы постараемся охватить все основные клинические исследования, проведенные на сегодняшний день с использованием клеточной терапии при сердечных заболеваниях. Как и в случае с не-клиническими данными, большинство клинических испытаний было направлено на пациентов с ишемической болезнью сердца, как показано в таблице 2. Bodo Strauer in Germany, Kimikazu Hamano in Japan, and Phillipe Menasche in France^44-46 были пионерами в этой области, используя либо клетки, полученные из костного мозга, либо скелетные миобласты, которые доставлялись путем интракоронарного или интрамиокардиального введения.

Table 2 Clinical trials in cardiovascular cell therapy.

После первого сообщения о введении скелетных миобластов пациенту во время трансплантации коронарной артерии ((CABG), сделанного Menasche,⁴⁶ несколько групп начали опробовать эту терапию при ишемической болезни сердца^47-51 во время (CABG или катетеризации. Menasche и коллеги провели многоцентровое рандомизированное двойное слепое исследование с постепенным увеличением дозы и плацебо-контролем, в котором приняли участие 97 пациентов.⁵² Пациенты перенесли инфаркт миокарда с дисфункцией левого желудочка и были подвергнуты CABG. Введение низких (400 млн миобластов) и высоких (800 млн миобластов) доз клеток не улучшило региональную или глобальную функцию левого желудочка у пациентов, получавших клетки, по сравнению с группой плацебо. Результат этого исследования и большое количество аритмических событий в этом и предыдущем исследовании, проведенном той же группой⁵³ , положили конец энтузиазму в отношении скелетных миобластов как источника клеток в области клеточной терапии.

Одновременно с испытаниями скелетных миобластов проводились клинические испытания с использованием мононуклеарных клеток, выделенных из костного мозга.^44,45 Возможно, благодаря недолговечности господствовавшей идеи о плюрипотентности клеток костного мозга^18-22 и ангиогенным свойствам клеток, полученных из костного мозга,⁵⁴ клинические испытания с клетками, полученными из костного мозга, получили много приверженцев в области кардиологии и охватили два десятилетия исследований. После того как был проведен целый шквал исследований безопасности и целесообразности с использованием интракоронарного и интрамиокардиального способов введения, в которых сообщалось об улучшении сердечной функции при ишемической, дилатационной и chagasic кардиомиопатиях,^55-65 наконец-то наступил этап испытаний эффективности. Первые два многоцентровых, рандомизированных, плацебо-контролируемых и двойных слепых исследования с внутрикоронарной доставкой мононуклеарных клеток из костного мозга пациентам с острой ишемией (инфаркт миокарда с подъемом сегмента ST) пришли к противоположным выводам; исследование, проведенное в Германии, дало положительные результаты⁶⁶ , а исследование, проведенное в Швеции, - отрицательные⁶⁷. К разочарованию, большинство многоцентровых, рандомизированных, плацебо-контролируемых и двойных слепых исследований не показали дополнительных преимуществ для пациентов по сравнению со стандартной фармакологической терапией при использовании мононуклеарных клеток костного мозга.^68-74 Также были проведены исследования с внутрикоронарной доставкой мононуклеарных клеток костного мозга при острой ишемии миокарда в различные временные точки после инфаркта миокарда (TIME и LATE-TIME), и в обоих случаях не было выявлено улучшения сердечной функции по сравнению со стандартной терапией.^72,73 Трансэндокардиальная доставка тех же клеток при хронической сердечной недостаточности также не показала преимущества.⁷⁴ Аналогично, при дилатационной и chagasic кардиомиопатиях внутрикоронарное введение аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга не улучшило ремоделирование сердца или его функцию.^75,76 Наконец, исследование BAMI, предназначенное для проверки эффективности аутологичных мононуклеарных клеток костного мозга при остром инфаркте миокарда, не удалось провести из-за малого числа участников и низкой смертности.⁷⁷ Эра клеточной терапии с использованием мононуклеарных клеток костного мозга закончилась.⁷⁸

Однако другие типы клеток, полученные из костного мозга, были опробованы в клинических испытаниях, основываясь на многообещающих результатах на животных моделях. В качестве основных типов клеток использовались мезенхимные или стромальные клетки костного мозга (далее сокращенно MSC) и CD34+ клетки. Первые испытания продемонстрировали возможность и безопасность введения клеток.^79-81 Эта область быстро перешла к более крупным исследованиям, рандомизированным, двойным слепым и плацебо-контролируемым, с использованием аутологичных или аллогенных MSC из костного мозга или жировой ткани, поскольку эти клетки, как сообщается, гипоиммуногенны.^82,83 Hare и соавторы сообщили о безопасном внутривенном введении аллогенных MSC, полученных из костного мозга, пациентам с AMI.⁸⁴ Позже тот же автор сравнил аллогенные и аутологичные MSC путем трансэндокардиального введения у 30 пациентов с ишемической кардиомиопатией⁸⁵ и аутологичные MSC против мононуклеарных клеток костного мозга у 65 пациентов с хронической ишемической кардиомиопатией.⁸⁶ Во всех случаях размер выборки был недостаточен для оценки эффективности, и выводы указывали на необходимость проведения более крупных исследований. Kastrup и его коллеги из Европы выступили за проведение испытаний MSC как с аутологичными^87,88, так и с аллогенными клетками.⁸⁹ Эти исследования доказали безопасность интрамиокардиального введения MSC и показали улучшение сердечной функции за счет уменьшения конечного систолического объема левого желудочка и увеличения фракции выброса левого желудочка через 12 месяцев после введения клеток,⁸⁷ но различий в госпитализации и выживаемости через 4 года после клеточной терапии обнаружено не было.⁸⁸ Кроме того, недавнее исследование с использованием аллогенных MSC, полученных из жировой ткани, при ишемической сердечной недостаточности (пациенты со сниженной фракцией выброса) не показало улучшения сердечной функции или структуры и клинических симптомов.⁹⁰ CD34+ клетки использовались в основном при рефрактерной стенокардии. Losordo и коллеги⁸¹ ввели отобранные гранулоцитарные колониестимулирующие факторы (g-CSF) мобилизованные CD34+ клетки с помощью катетера для картирования и инъекций в миокард 24 пациентов с рефрактерной стенокардией, продемонстрировав безопасность и биологическую активность клеток. Это послужило поводом для проведения исследования II фазы, в которое были включены 167 пациентов, получивших одну или две дозы мобилизованных аутологичных клеток CD34+ или плацебо путем интрамиокардиальной инъекции. Пациенты, получившие меньшую дозу клеток (10⁵ клеток/кг), значительно повысили толерантность к физической нагрузке и снизили частоту стенокардии по сравнению с высокой дозой (5 x 10⁵ клеток/кг) и введением плацебо.⁹¹ Эти интересные результаты привели к разработке фазы III исследования⁹², которое, к сожалению, так и не было завершено из-за отказа спонсора от поддержки.⁹³

В то время как испытания с клетками, полученными из костного мозга, все еще продолжались, две группы в США начали проводить испытания безопасности с предполагаемыми стволовыми/прогениторными клетками сердца, основываясь на доклинических результатах на малых и средних модельных животных. Одна из этих групп, возглавляемая Eduardo Marban в Калифорнии, использовала клетки, полученные из кардиосферы (CDC), выращенные из биопсии сердца пациента.⁹⁴ Введение клеток через коронарное кровообращение показало, что процедура безопасна и выполнима, а у пациентов, получавших клетки, по данным МРТ, уменьшилась масса рубца. Это привело к проведению более крупного многоцентрового рандомизированного двойного слепого и плацебо-контролируемого исследования с использованием аллогенных клеток CDC⁹⁵ , которое было остановлено из-за отсутствия первичной конечной точки. Другая группа под руководством Roberto Bolli и Piero Anversa использовала предполагаемые аутологичные c-kit+ сердечные стволовые клетки (CSCs в исследовании первой фазы⁹⁶, результаты которого были отклонены журналом The Lancet. Процедура оказалась безопасной и, по данным МРТ, увеличила фракцию выброса левого желудочка после внутрикоронарного введения клеток.⁹⁷ В 2021 году было опубликовано еще одно клиническое исследование с использованием аутологичных c-kit+ CSC и MSC в комбинации или по отдельности.⁹⁸ После фиаско с c-kit+ CSC 12 клинических испытаний с использованием этих клеток были окончательно прекращены.

Последний рубеж клинической клеточной терапии при сердечных заболеваниях связан с использованием кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Menasche во Франции и Sawa и Fukud в Японии начали исследовать этот путь. Menasche ввел кардиомиоциты, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, в фибриновый пластырь шести пациентам во время КАБГ. Один пациент умер после операции от сопутствующих заболеваний, не связанных с лечением, а другой - через 22 месяца после процедуры от сердечной недостаточности. Остальные пациенты наблюдались в течение 18 месяцев, у них не развились опухоли или аритмии, но у трех пациентов развилась клинически немая аллоиммунизация.⁹⁹ Группа Sawa ввела одному пациенту с ишемической сердечной недостаточностью заплатку из аллогенных кардиомиоцитов, полученных из iPSC.¹⁰⁰ Fukuda сообщил в журнале Nature Medicine, что он ввел первому пациенту в Японии кардиомиоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (iPSC), в рамках исследования, в которое планируется включить 10 пациентов с тяжелой сердечной недостаточностью,¹⁰¹ но результаты пока не опубликованы. Хотя первые клинические испытания показали безопасность процедур, такие факторы, как подавление иммунитета, сохранение клеток, риск развития аритмий и опухолевого генеза, все еще требуют тщательного изучения в более крупных исследованиях.

В предыдущих разделах представлен не очень позитивный взгляд на клеточную терапию кардиологических заболеваний. Действительно, за исключением использования CD34+ клеток для лечения рефрактерной стенокардии, клинические испытания III фазы которой были остановлены по решению промышленности, все остальные испытания эффективности при ишемических и не-ишемических кардиомиопатиях не дошли до клиники. Что касается клеточной терапии, то будущее, безусловно, зависит от результатов клинических испытаний кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток. Но даже в случае с этими клетками преодолеть барьеры не так просто. Первое - это иммунное отторжение, и для этого сейчас создаются национальные биобанки гомозиготных (тройных или четверных) iPS-клеток. Хотя это и не может полностью предотвратить иммунное отторжение, но, безусловно, снижает необходимость в подавлении иммунитета. Существуют также группы, работающие над созданием универсальной линии iPS-клеток путем генетического удаления основных молекул HLA.^102,103 Вторым барьером для этих методов лечения является стоимость, и наличие универсальных iPS-клеток значительно снизит затраты. Следующим основным барьером является приживление и выживание введенных клеток. Было показано, что кардиомиоциты, полученные из клеток PS человека и обезьяны, введенные в сердца нечеловеческих приматов, выживают как минимум три месяца,^38,41 но прижившиеся клетки не демонстрируют фенотип зрелых кардиомиоцитов, и хотя они соединены с родным миокардом, о чем свидетельствует распространение кальциевых волн между миокардом донора и хозяина, у животных наблюдаются преходящие аритмии после трансплантации эмбриональных кардиомиоцитов человека или iPS, полученных от обезьяны. В качестве возможной причины аритмий был предложен незрелый фенотип введенных кардиомиоцитов, и были предприняты большие усилия для получения кардиомиоцитов со зрелым фенотипом.^104,105 Для получения более зрелого фенотипа были использованы такие альтернативы, как длительное культивирование, трехмерная тканевая инженерия, механическая нагрузка, электростимуляция, модуляция жесткости субстрата и обработка нейрогормональными факторами.¹⁰⁴ Кроме того, в настоящее время тестируется пересадка содержащих клетки пластырей из искусственных или натуральных скаффолдов (укладок), а также введение сфероидов кардиомиоцитов, полученных из iPS.¹⁰⁶ Но все эти альтернативы будут полезны только в том случае, если введенные клетки будут действовать, замещая кардиомиоциты, потерянные в результате травмы, то есть если механизм действия предлагаемых клеток кардиомиоцитов, утраченных в результате травмы, т.е. если механизм действия предлагаемой клеточной терапии заключается в замещении клеток.

Недавно разные группы предложили использовать внеклеточные везикулы (EVs), полученные из предшественников кардиомиоцитов, выведенных из PSC¹⁰⁷ , или из кардиомиоцитов, сконструированных в гидрогелевом пластыре¹⁰⁸ , в качестве альтернативы кардиомиоцитам, выведенным из PSC, в доклинических моделях ишемической болезни сердца. Если замена клеток является основным механизмом, с помощью которого кардиомиоциты, полученные из PSC, могут восстанавливать поврежденное сердце человека, то использование ацеллюлярной терапии, скорее всего, не принесет успеха. С другой стороны, если механизм действия введенных клеток заключается в паракринной секреции клеточных факторов, то ацеллюлярный подход может дать ожидаемые результаты. Использование ацеллюлярных методов лечения имеет множество преимуществ перед клеточными, таких как доступность, масштабы производства, стоимость и иммунная защита. Однако применение и успех ацеллюлярной терапии в конечном итоге зависят от механизма действия клеточной терапии. В этой связи Murry (личное сообщение) недавно провел гениальный эксперимент, в ходе которого он ввел кардиомиоциты, полученные из PSC, в которых был нокаутирован ген регуляторного тропонина, и поэтому введенные кардиомиоциты не смогли внести дополнительные сократительные единицы в поврежденные сердца нечеловеческих приматов. Удивительно, но эти не-сокращающиеся кардиомиоциты оказывали практически такой же эффект в улучшении сердечной функции, как и кардиомиоциты дикого типа, что позволяет предположить паракринный механизм действия введенных клеток или их внеклеточных везикул. Также были изучены комбинированные методы лечения с использованием различных типов клеток, полученных из PSC, или их внеклеточных везикул. В сердцах свиней большие пластыри фибрина, содержащие клетки сердечной мышцы, гладких мышц и эндотелиальные клетки, полученные из человеческих PSC, улучшили функцию сердца и размер рубца, оцененные с помощью МРТ.¹⁰⁹ Недавно Lou и др.¹¹⁰ сообщили, что пластыри, содержащие все четыре типа клеток, присутствующих в сердце - кардиомиоциты, эндотелиальные клетки, клетки гладких мышц и фибробласты, полученные из человеческих PSC - более эффективно восстанавливают функцию сердца и уменьшают размер рубца в инфарктном сердце мыши, чем пластыри с меньшим количеством типов клеток. Аналогичным образом, экзосомы, полученные из кардиомиоцитов, гладкомышечных и эндотелиальных клеток, полученных из человеческой PSC, оказались столь же эффективными, как и комбинированная терапия с использованием всех трех типов клеток в инфарктном сердце свиньи.¹¹¹ Таким образом, необходимы дальнейшие исследования для сравнения эффективности клеточных терапий, полученных из PSC, с использованием одного или комбинации типов клеток с их ацеллюлярными аналогами, представленными внеклеточными везикулами и экзосомами. Это говорит о том, что мы все еще далеки от того, чтобы клеточная терапия заболеваний сердца с помощью клеток, полученных из PSC, стала использоваться в клинике, хотя клинические испытания уже начались в Европе и Японии, как указано в предыдущем разделе.

Для лечения ишемических и не-ишемических заболеваний сердца разрабатываются и другие лекарственные препараты передовой терапии (ЛПТП). Они предполагают генетическую модификацию резидентных клеток с помощью генной терапии. Одним из перспективных подходов к лечению заболеваний сердца, приводящих к замещению кардиомиоцитов рубцовой тканью, является прямое перепрограммирование фибробластов в кардиомиоциты как ^{in vitro}, так и in vivo, впервые предложенное группой Srivastava's.^112,113 Для превращения сердечных или кожных фибробластов в кардиомиоциты группа использовала три транскрипционных фактора (Gata4, Mef2c и Tbx5) и показала, что ретровирусная доставка этих факторов непосредственно в поврежденное сердце мыши может уменьшить площадь рубца и улучшить сердечную функцию.¹¹³ Используя другой подход, основанный на регуляции факторов клеточного цикла, группа показала, что избыточная экспрессия циклин-зависимой киназы 1 (CDK1), CDK4, циклина B1 и циклина D1 эффективно индуцирует деление клеток в пост-митотических кардиомиоцитах мыши, крысы и человека. Более того, 15-20 % взрослых кардиомиоцитов, экспрессирующих эти четыре фактора, подвергались стабильному делению клеток, что приводило к значительному улучшению сердечной функции после острого или подострого инфаркта миокарда¹¹⁴.

Появление технологии CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas, впервые описанной Doudna и Charpentier¹¹⁵ , и редакторов оснований и праймеров, созданных группой David Liu's^116,117 , позволило переписать генетический код и тем самым лечить ряд заболеваний, либо исправляя или удаляя вредные мутации, либо внося защитные изменения в геном пациента. Потенциально все моногенные сердечно-сосудистые заболевания могут быть излечены с помощью этих методов. К ним относится широкий спектр наследственных заболеваний, включающий дилатационную и гипертрофическую кардиомиопатии, синдромы удлиненного интервала QT и Марфана, семейную легочную гипертензию и мышечные дистрофии. Улучшение доставки терапевтических агентов в сердце или сосудистую систему, а также повышение эффективности процесса редактирования позволит этим методам терапии войти в клиническую практику. Так, клинические испытания CRISPR-Cas9, разрушающего транстиретин (TTR) в печени, были проведены для лечения TTR-амилоидоза118 , смертельного заболевания, поражающего нервы и сердце из-за накопления амилоидных фибрилл из неправильно сформованного белка TTR. Однократная внутривенная инъекция терапевтического препарата снизила уровень TTR на 87 % у пациентов, получивших высокую дозу лечения,¹¹⁸ доказав возможность целенаправленного разрушения генов in vivo у человека. Другие примеры нарушения работы генов для достижения терапевтического эффекта включают генетическую абляцию ферментов, связанных с метаболизмом холестерина липопротеинов низкой плотности, таких как PCSK9¹¹⁹, с помощью редактора оснований CRISPR. Небольшой процент населения имеет низкий уровень холестерина из-за мутаций потери функции этого фермента, что, по-видимому, не вызывает никаких проблем со здоровьем,¹¹⁹ делая эту одномоментную терапию альтернативой постоянному применению статинов, siRNA или антител для предотвращения высокого уровня холестерина, особенно при семейной гиперхолестеринемии. Мышечная дистрофия Дюшена (МДД), рецессивное Х-сцепленное заболевание, поражающее сердце, также может получить пользу от методов разрушения генов, в данном случае путем пропуска экзонов, которые приводят к дисфункции белка дистрофина.¹²⁰ Но если разрушение генов возможно в сердце взрослого человека, то исправление точечных мутаций с помощью технологии CRISPR-Cas предполагает гомологически-направленную репарацию (HDR), что позволяет шаблону репарации исправить мутировавший ген. Но HDR требует, чтобы клетки находились в S или G2 фазе клеточного цикла, а поскольку кардиомиоциты являются постмитотическими клетками, HDR не работает. В таких случаях для перезаписи генома можно использовать редакторы оснований, которые не вызывают двунитевых разрывов в ДНК. Так, например, если известна точечная мутация, вызывающая МДД, можно использовать редакторы оснований для исправления единственной мутации в гене.^121,122 Другие моногенные заболевания сердца также лечатся с помощью редактирования генома. Патогенная для синдрома Марфана мутация в гене FBN1 была исправлена с помощью редактирования оснований в эмбрионах человека с высокой эффективностью и без обнаруженных off-target эффектов.¹²³ Гипертрофическая кардиомиопатия также была исправлена в эмбрионах мышей и кардиомиоцитах человека с помощью редакторов оснований без off-target редактирования, исправляя мутации в генах MYH6 и MYH7 (тяжелой цепи миозина).^124,125 Еще одно применение инструментов CRISPR - использование мертвого фермента Cas9 (не-функционального фермента), соединенного с репрессорами или активаторами транскрипции для уменьшения или увеличения экспрессии генов. В iPS-произведенных кардиомиоцитах человека, несущих мутацию в гене кальмодулина CALM2, которая приводит к удлинению интервала QT, репрессия CALM2 с помощью dCas-KRAB восстановила длительность потенциала действия и кальций-кальмодулиновую инактивацию кальциевого тока L-типа.¹²⁶

Хотя эти генетические подходы очень перспективны, их клиническое применение сопряжено со многими препятствиями, которые предстоит преодолеть в ближайшие годы. Во-первых, нам необходимо более точное нацеливание на сердце для доставки полезного груза редактирования генов, когда прямая доставка в орган не является альтернативой. Необходимы либо более кардиоспецифичные серотипы адено-ассоциированных вирусов, либо внеклеточные везикулы, украшенные поверхностными белками, которые распознаются кардиорецепторами. Во-вторых, для достижения клинического эффекта необходимо повысить эффективность процесса, особенно если мы хотим генерировать новые кардиомиоциты из фибробластов. В-третьих, необходимо тщательно оценить возможные внецелевые эффекты терапии редактирования генов, чтобы гарантировать безопасность. Хотя редактирование оснований и праймеров вызывает гораздо меньше внецелевых изменений генома, чем традиционная методология CRISPR-Cas, вне-целевое редактирование было описано и с помощью этих редакторов. Тем не менее мы предвидим большое будущее этих передовых методов лечения сердечно-сосудистых заболеваний. Хотя технические барьеры все еще существуют, самым серьезным из них может оказаться цена таких терапий. Сценарий применения передовых клеточных терапий, которые в настоящее время используются в клинике, ясно показывает, что цена - это последний барьер, который необходимо преодолеть.



Fig. 1 summarizes the main approaches being tested to repair/regenerate the heart after injury, the challenges they face and future directions to overcome these challenges.

Fig. 1Illustration of the main methods being used to repair or regenerate the injured heart – Replacement of lost cardiomyocytes using pluripotent stem cells (PSC) differentiated into cardiomyocytes is hampered by their immature phenotype, poor engraftment, and high cost. Some of these challenges could be resolved by generating a universal PSC or creating homozygous PSC cell banks. Acellular therapies have gained momentum, but the mechanism of action needs to be determined. Their advantages are off-the-shelf availability, immune evasion and manufacturing scale that reduces cost. Combination therapies use the different cell types present in the heart derived from PSC, either with or without scaffolds and extracellular vesicles. The challenges and solutions are essentially the same faced by cell replacement therapies. Gene therapies either by CRISPR-Cas or direct reprogramming offer interesting perspectives but are still in development stages and vectors targeting specifically the heart, off-target effects, and transdifferentiating efficiency are limiting factors for their use.

Исходя из вышесказанного, мы считаем, что основными направлениями будущих исследований в области клеточной терапии должно стать тщательное изучение механизма действия кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, в восстановлении сердца. Остается открытым вопрос о том, действительно ли для восстановления необходимо замещение клеток. Если это так, то нам необходимо инвестировать в снижение отторжения путем создания банков гомозиготных iPS-клеток или создания универсальной iPS-клетки для получения иммуносовместимых кардиомиоцитов. С другой стороны, если даже при использовании кардиомиоцитов, полученных из плюрипотентных клеток, восстановление происходит за счет паракринных эффектов, то ацеллюлярная терапия должна быть намного проще, дешевле и быстрее обеспечивать необходимое восстановление. В этом случае следует задаться вопросом, действительно ли необходимы клетки PS или генетические манипуляции с более доступными типами клеток, такими как мезенхимные/стромальные клетки, которые, как известно, обладают иммунной привилегированностью и легко размножаются, чтобы заставить их выделять идентифицированные спасительные факторы, являются более экономически эффективной альтернативой. Альтернативой клеточной терапии, которая только что вошла в клиническую практику, является использование ксенотрансплантации, при которой гуманизированные сердца выращиваются в свиньях. Пока этот источник получения органов для трансплантации находится под контролем безопасности, его следует рассмотреть.