Структурно подходы к редактированию генов с помощью нуклеаз цинковых пальцев (ZFNs) и нуклеаз транскрипционных активатор-подобных эффекторных белков (TALEN) имеют сходство, поскольку обе системы используют преимущества не-специфической для последовательности эндонуклеазы FokI, которая слита с сайт-специфическим ДНК-связывающим доменом.

В случае ZFNs домен связывания ДНК состоит из синтетических пептидных единиц, которые определяют домены связывания повторов цинковых пальцев, которые могут быть изменены по аминокислотной последовательности и количеству для повышения специфичности сайта-мишени ДНК для ZFN.²⁶ Эти сконструированные цинковые пальчики имеют небольшой размер (около 30 аминокислот) и взаимодействуют с ДНК через контакт со специфическими боковыми цепями белка и функциональными группами в основной канавке двойной спирали.²⁷ Увеличивая количество цинковых пальцев, можно повысить специфичность и точность редактирования с помощью ZFN. Механически для расщепления ДНК требуются два ZFN, которые связывают последовательность ДНК в противоположных ориентациях, что обусловлено необходимостью димеризации не-специфических расщепляющих доменов эндонуклеазы FokI²⁸ (рис. 2).



Figure 2 Overview of key genetic therapy and gene editing approaches designed to treat TDT and SCD

Активатор транскрипции (TALE), используемый в системе редактирования генов TALEN, был открыт в бактериях. TALE секретируются патогенными для растений бактериями в организм хозяина, где они могут связываться с определенными последовательностями ДНК хозяина, способствуя инфицированию видов растений.²⁹ В случае системы редактирования генов TALEN специфичность нацеливания на ДНК обеспечивается белком TALE, а расщепление ДНК завершается путем слияния белка TALE с FokI.^30-32 В отличие от системы CRISPR-Cas9, где одна направляющая РНК (gRNA) может быть использована для нацеливания белка Cas9 на определенное место генома, TALE имеют набор из 33-35 аминокислот, составляющих ДНК-связывающий домен, который может быть сконструирован для достижения желаемой специфичности целевого сайта.²⁹ Модификации белка TALE, включая слияние с каталитическим доменом эндонуклеазы FokI, привели к созданию архитектуры TALEN, которая наиболее часто используется для редактирования генов.³³

В системе TALEN редактирование осуществляется с помощью пар TALEN, которые могут связывать ДНК в противоположных ориентациях, так что домены FokI двух белков TALE димеризуются, что позволяет расщеплять целевую ДНК в определенной спейсерной области, подобно ZFNs (рис. 2). ³⁴ Это разрезание приводит к образованию двухцепочечного разрыва ДНК, который восстанавливается клеткой с помощью путей негомологичного соединения концов (NHEJ) или гомологично направленной репарации (HDR)³⁴.

CRISPR-Cas9 - это двухкомпонентная нуклеазная система, позволяющая осуществлять целенаправленное восстановление, вставки или делеции в определенных геномных регионах, которая изначально была идентифицирована как врожденная бактериальная иммунная система, способная расщеплять ДНК бактериофагов или плазмид.^35,36 При расщеплении ДНК, опосредованном CRISPR, зрелые CRISPR РНК (crRNAs) образуют пару с транс-активирующей crRNA (tracrRNA) для формирования двойной РНК структуры, способной направлять белок Cas9 к целевому участку ДНК. Часть последовательности crRNA, которая комплементарна последовательности целевой ДНК, называется спейсером. Для функционирования Cas9 также необходим специфический protospacer adjacent motif (PAM), который варьируется в зависимости от вида бактерий, в которых находится ген Cas9. Наиболее часто используемая нуклеаза Cas9, полученная из S. pyogenes, распознает PAM-последовательность NGG, которая находится непосредственно ниже по течению от целевой последовательности в геномной ДНК, на не-целевой нити. Считается, что распознавание PAM нуклеазой Cas9 дестабилизирует соседнюю последовательность, позволяя опрашивать ее с помощью crRNA и осуществлять спаривание РНК-ДНК при наличии совпадающей последовательности.^37,38 После связывания целевой области два домена Cas9 (нуклеазный домен HNH и RuvC-подобный домен) расщепляют комплементарную и не-комплементарную нити, вызывая двухцепочечный разрыв (рис. 2). ³⁹ Хотя исследователи обнаружили, что дуплекс tracrRNA:crRNA необходим для правильного сайт-специфического расщепления Cas9, было также отмечено, что структура этого РНК-дуплекса позволяет предположить, что одна химерная РНК может быть в состоянии охватить все функции, необходимые для расщепления ДНК с помощью Cas9, одной химерной gRNA³⁹. Использование одной gRNA для нацеливания на определенную последовательность ДНК является стандартом в системе CRISPR-Cas9 для достижения максимальной точности редактирования. Способность системы CRISPR-Cas9 расщеплять ДНК в клетках человека программируемым образом^39-41 заставила задуматься о возможности использования CRISPR-Cas9 для редактирования генов в клинике.

Специфические двуцепочечные разрывы ДНК, созданные белком Cas9 в системе редактирования CRISPR-Cas9, в первую очередь восстанавливаются в клетках млекопитающих с помощью одного из двух естественных путей репарации ДНК: NHEJ или HDR. NHEJ - это клеточный процесс, в ходе которого гомологичные или не-гомологичные разрывы ДНК, созданные Cas9, соединяются вместе. Хотя NHEJ, как правило, является точным процессом репарации, возможна и неточная репарация, особенно когда концы ДНК не гомологичны, что может привести к появлению вставок или делеций в целевых последовательностях. Опосредованное микрогомологией соединение концов (MMEJ) - еще один путь репарации клетки, который использует короткие микрогомологические последовательности (5-25 пар оснований) на каждой стороне двухцепочечного разрыва для определения места для ремонта разрыва.^42-44 В отличие от NHEJ и MMEJ, путь HDR использует гомологичный шаблон донорской ДНК для восстановления двунитевого разрыва, индуцированного Cas9.^45,46 Это сочетание программируемой системы редактирования CRISPR-Cas9 и клеточных путей восстановления ДНК может быть использовано для создания точных и долговечных вставок, делеций или событий восстановления генов для изменения функции определенного участка ДНК.^47-49

Как и в случае всех подходов к редактированию генов, точность редактирования является важным фактором для успешного и безопасного применения любой клинической терапии на основе CRISPR-Cas9. В системе CRISPR-Cas9 точность редактирования генов в первую очередь зависит от комплементарности первых 20 нуклеотидов последовательности gRNA и интересующей геномной последовательности-мишени,⁵⁰ хотя было показано, что продолжительность воздействия Cas9 и версия Cas9 также влияют на специфичность мишени. Определение gRNA, которая максимально комплементарна последовательности-мишени и исключает потенциальное возникновение событий вне-целевого редактирования, имеет решающее значение для разработки высокоэффективной и безопасной CRISPR-Cas9-терапии. Для этого исследователи могут использовать инструменты прогнозирования in silico для моделирования потенциальных событий off-target на основе последовательности данной gRNA, а также использовать анализы секвенирования следующего поколения, такие как GUIDE-seq, DISCOVER-seq и CHIP-seq, для исследования генома на предмет случаев редактирования off-target для проверки точности редактирования.⁵¹ С момента первого описания в 2012 году точность системы CRISPR-Cas9 подверглась детальному анализу. Ряд sgRNAs был охарактеризован как in vitro, так и в клеточных анализах для выявления параметров, влияющих на связывание sgRNAs с целевыми последовательностями, включая определение seed-области sgRNAs как критической для распознавания мишени.^52,53 Эти и другие исследования позволили предположить, что результат CRISPR-редактирования можно предсказать, и углубить понимание того, как структура и состав gRNA коррелируют с точностью редактирования генома с помощью CRISPR-Cas9⁵⁴ , что позволяет предлагать высокоточные методы лечения на основе CRISPR-Cas9 в клинические испытания на ранних и поздних стадиях⁵⁵.

Было показано, что образование двунитевых разрывов ДНК может приводить к транслокациям и более обширным хромосомным перестройкам, таким как хромотрипсис.^56,57 Однако важно отметить, что (1) риск возникновения транслокаций при редактировании с помощью CRISPR-Cas9 снижается благодаря точности редактирования и отсутствию событий вне-целевого редактирования, поскольку для создания транслокаций требуются разрывы в двух сайтах, а в отсутствие вне-целевых разрывов нет условий, способствующих возникновению транслокаций, и (2) хромотрипсис был показан только в системах клеточных линий, где были изменены пути опухолевых супрессоров, и никогда не наблюдался в первичных человеческих HSPCs.⁵⁷

Подобно системе CRISPR-Cas9, CRISPR-Cas12a представляет собой программируемую эндонуклеазную систему с одной РНК-направляющей. Несмотря на функциональное сходство белков Cas12a и Cas9, между ними существуют и существенные различия.^58,59 Белок Cas12a содержит один нуклеазный домен, в отличие от двойного нуклеазного домена Cas9, и Cas12a обладает внутренней активностью по обработке РНК, что позволяет обрабатывать массив crRNA и, таким образом, осуществлять мультигенное редактирование РНК-транскриптов.⁵⁹ Кроме того, если редактирование CRISPR-Cas9 приводит к образованию тупых концов ДНК, то редактирование Cas12a приводит к образованию ступенчатых концов ДНК, что позволяет применять мультиплексное редактирование генов и способствует восстановлению клеток с помощью HDR вместо NHEJ.⁵⁹ Потенциальные методы лечения, основанные на использовании редактирования генов CRISPR-Cas12a, например, основанные на Cas12a-опосредованном нацеливании на промоторы HBG1 и HBG2, уже начали проходить клинические испытания на ранних стадиях.

Необходимость полагаться на путь NHEJ для восстановления двуцепочечных разрывов, индуцируемых системами редактирования генов, такими как CRISPR-Cas9, TALEN и ZFN, привела к разработке альтернативных методов редактирования генов, которые могут генерировать точечные мутации без двуцепочечных разрывов ДНК. Редактирование оснований - это новый подход к редактированию генов, при котором нуклеотидные изменения могут быть внесены в геномные участки без использования клеточных путей репарации. Редакторы оснований состоят из деактивированной версии белка Cas9 с gRNA, которая обеспечивает локализацию фермента nucleobase deaminase в определенном геномном месте, где может быть произведена точечная замена ДНК.⁶⁰ После связывания редактора оснований с целевым локусом в ДНК, образование пар оснований между gRNA и целевой ДНК приводит к смещению небольшого участка одноцепочечной ДНК. Фермент деаминаза модифицирует основания ДНК в пределах одноцепочечной части ДНК. Эффективность редактирования оснований повышается за счет использования каталитически неактивной нуклеазы, которая генерирует щербинку (nick) в не-редактируемой ДНК, чтобы вызвать клеточную репарацию не-редактируемой нити с использованием отредактированной нити в качестве шаблона.^60-62 Были разработаны два типа редакторов оснований: редакторы цистиновых оснований могут способствовать преобразованию пар оснований C:G в пары оснований T:A, а редакторы адениновых оснований могут способствовать преобразованию пар оснований A:T в пары оснований G:C.⁶⁰ Хотя исследования показали, что редакторы оснований имеют высокую эффективность редактирования генов и могут редактировать не-делящиеся клетки, важным ограничением существующих технологий редактирования оснований является генерация случайных мутаций и вне-целевой эффект в ДНК и РНК из-за не-специфической активности ферментов nucleobase deaminase.⁶³ Поэтому может потребоваться дальнейшее совершенствование технологий редактирования оснований, включая возможные модификации ферментов деаминазы для преодоления не-специфической активности, прежде чем эта технология редактирования генов найдет широкое применение, особенно в клинической практике.

Прайм-редактирование - это еще одна стратегия редактирования генов, которая также опирается на специфичность системы CRISPR-Cas9, но включает в себя добавление в gRNA последовательности, содержащей редактирование, и обратную транскриптазу M-MLV, слитую с С-концом никазы Cas9, чтобы избежать двунитевых разрывов.⁶⁴ Преимущество прайм-редактирования перед редакторами оснований заключается в возможности создания большего числа потенциальных изменений в целевом сайте. Редакторы оснований могут генерировать замены одного основания для четырех переходов, в то время как прайм-редактирование может быть использовано для создания любой потенциальной замены основания, включая переходы. Возможность прайм-редактирования для коррекции трансверсии A/T в T/A в гене HBB, вызывающей SCD, была недавно оценена в доклиническом исследовании с использованием человеческих HSPCs, полученных от пациентов с SCD. В целом эритроциты, полученные из HSPCs, в которых для исправления мутации SCD использовалось прайм-редактирование, содержали меньше серповидного гемоглобина, уровень гемоглобина взрослого человека, полученного из HBBA, составлял от 28 до 34 % от нормы, и были устойчивы к серповидноклеточности, вызванной гипоксией.⁶⁵ Эти первые результаты подтверждают целесообразность прайминг-редактирования для исправления единственной мутации в гене HBB, которая приводит к SCD.

В 2019 году betibeglogene autotemcel (beti-cel), генотерапия для лечения TDT, получил условное разрешение EMA на применение в Европе, однако в 2021 году разрешение было отозвано разработчиком (не по причинам безопасности или эффективности). После этого Beti-cel была одобрена Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) (2022). Терапия Beti-cel основана на введении аутологичных CD34+ HSPCs, трансдуцированных дефектным по репликации, самоинактивирующимся лентивирусным вектором BB305, кодирующим рекомбинантный ген β-глобина (β^А-T87Q)25 (табл. 1). Ex vivo трансдукция стволовых и клеток предшественников пациентов этим лентивирусным вектором приводит к вставке функциональных копий гена β^А-Т87Q, варианта нормальной цепи HBB, в котором аминокислотная замена в положении 87 обладает anti-sickling свойствами; затем клеточный продукт вводится пациентам после миелоаблативного режима кондиционирования с фармакокинетически скорректированным бусульфаном²⁵.

Табл.1 Summary of clinical trials using gene addition or gene editing for TDT

AE, adverse event; Hb, hemoglobin; HbF, fetal hemoglobin ; RBC, red blood cell; SAE, serious adverse event

В клиническом исследовании фазы 3 20 из 22 пациентов (91 %) с TDT и генотипом не-β⁰/β⁰, которым вводили beti-cel и которых можно было оценить, достигли первичной конечной точки - независимости от трансфузий в течение как минимум 12 месяцев при взвешенном гемоглобине 9 g/dL или выше.²⁵ Пациенты, достигшие независимости от трансфузий, также продемонстрировали улучшение эритропоэза и снижение концентрации железа в печени. Профиль безопасности был признан соответствующим миелоаблации на основе бусульфана.

Лентивирусный вектор BB305, который используется в качестве основы для beti-cel а, также оценивается для лечения пациентов с SCD в исследовании фазы 1/2 lovotibeglogene autotemcel (табл. 2). ⁶⁶ Как и beti-cel , lovotibeglogene autotemcel основан на инфузии аутологичных CD34+ HSPCs, трансдуцированных дефектным по репликации, самоинактивирующимся лентивирусным вектором, кодирующим рекомбинантный ген β-глобина (β^А-T87Q). В первых двух частях этого исследования (часть А и часть В) 7 пациентам (часть А) и 2 пациентам (часть В) вводили lovotibeglogene autotemcel, а результаты 35 пациентов части С (основной популяции исследования) были представлены в феврале 2022 года. ⁶⁶ У пациентов части С после миелоаблативного кондиционирования бусульфаном и инфузии lovotibeglogene autotemcel (полученного трансдуцированием аутологичных CD34+ HSPCs, мобилизованных в периферической крови) наблюдалось повышение уровня гемоглобина и снижение маркеров гемолиза; Из 25 пациентов с достаточным для оценки сроком наблюдения у всех были устранены тяжелые вазоокклюзивные события, которые в исследовании определялись как события, приведшие к посещению больницы или отделения неотложной помощи в течение 24 часов, двум или более посещениям дневного стационара или отделения неотложной помощи в течение 72 часов (оба посещения требовали внутривенного лечения), или эпизоду приапизма, который длился более 2 часов и привел к посещению медицинского учреждения. При использовании более широкого определения вазоокклюзионного события (определяемого как острая боль без медицинской причины, отличной от вазоокклюзии, включая острые приступы боли, острый грудной синдром, острую печеночную секвестрацию и острый приапизм) было выявлено два пациента, у которых вазоокклюзионные события произошли в период между приживлением и последним визитом.⁶⁶

Table 2 Summary of clinical trials using gene addition or gene editing for SCD AE, adverse event; COVID-19, coronavirus disease 2019; Hb, hemoglobin; HbF, fetal hemoglobin; RNP, ribonucleoprotein; SAE, serious adverse event; VOC, vaso-occlusive crisis.

Лентивирусные векторы третьего поколения, такие как те, что используются в терапии beti-cel и lovotibeglogene autotemcel, были сконструированы таким образом, чтобы быть некомпетентными к репликации и к самоинактивации, в попытке ограничить потенциальный риск инсерционного онкогенеза.^67,68 Хотя о случаях инсерционного онкогенеза у пациентов с TDT, получавших beti-cel , не сообщалось, у двух пациентов с SCD, получавших ловотибеглоген аутотемцел (ранняя версия того же лентивирусного вектора, который используется в beti-cel), была диагностирована острая миелоидная лейкемия через 3 года и 5,5 лет после инфузии. Анализ случаев обоих пациентов не выявил инсерционного онкогенеза, хотя анализ образцов периферической крови выявил лейкемические бластные клетки, содержащие инсерцию лентивирусного вектора BB305 у одного из пациентов; вектор был интегрирован в непосредственной близости от VAMP4, гена, который никогда не был вовлечен в лейкогенез.^66,69,70 Тем не менее, эти результаты подчеркивают необходимость долгосрочного мониторинга пациентов, получавших лентивирусный вектор BB305, чтобы лучше понять паттерны инсерции, связанные с трансдукцией лентивирусного вектора BB305.

В нескольких исследованиях было показано, что для максимального приживления CD34+ клеток, трансдуцированных лентивирусом, необходимо миелоаблативное кондиционирование.^71,72 В исследованиях beti-cel и lovotibeglogene autotemcel перед инфузией клеток, трансдуцированных CD34+ HSPCs, пациент проходил миелоаблативное кондиционирование с использованием одного препарата бусульфана. В другой программе лентивирусной генотерапии, испытании фазы 1/2 TIGET-Bthal, аутологичные гемопоэтические стволовые клетки были модифицированы лентивирусным вектором GLOBE для экспрессии транскрипционно регулируемого гена человеческого β-глобина, а пациентам была назначена схема кондиционирования на основе миелоаблативной комбинации treosulfan и thiotepa⁷³ (табл. 1). Из трех взрослых и шести детей с TDT, прошедших лечение, потребность в переливании крови у взрослых была снижена, но не устранена, в то время как трое из четырех детей, подлежащих оценке, не нуждались в переливании крови. Учитывая, что в данном исследовании использовалась схема кондиционирования с пониженной токсичностью, нельзя исключить, что эндогенные клетки не были успешно уничтожены, которые затем конкурировали с трансдуцированными клетками в клеточном трансплантате, что привело к недостаточному химеризму. Аналогичные результаты были получены в менее масштабном исследовании фазы 1, проведенном в США, по терапии на основе лентиглобина у взрослых пациентов с TDT, в котором также использовался режим кондиционирования с пониженной интенсивностью бусульфана.⁷¹ В этом исследовании четыре пациента получили режим кондиционирования бусульфаном, который был в немиелоаблативном диапазоне до инфузии клеток, трансдуцированных лентивирусным глобиновым вектором TNS9.3.55 (Таблица 1). Пациенты, за которыми наблюдали в течение 6-8 лет и у которых не было неожиданных проблем с безопасностью ни во время режима кондиционирования, ни после инфузии клеточного продукта, имели низкий, но стабильный уровень маркировки генов кроветворения. У двух пациентов снизилась потребность в переливании крови, но ни один из пациентов не смог добиться независимости от переливания крови в течение периода наблюдения. Хотя эти результаты свидетельствуют о возможности достижения стойкого приживления стволовых клеток при немиелоаблативном режиме кондиционирования, для достижения максимального терапевтического эффекта от приживления CD34+ лентивирусных трансдуцированных клеток, по-видимому, необходимо миелоаблативное кондиционирование.^71,72

В настоящее время проводится еще несколько клинических исследований, в которых оценивается использование добавления генов с помощью лентивирусных векторов у пациентов с SCD (табл. 2). В 2018 году Weber et al.⁷⁴ сообщили о разработке лентивирусного вектора, содержащего ген HBB (глобин βАС3), который при трансдукции в гемопоэтические стволовые клетки предшественники пациентов с SCD приводил к снижению серповидности эритроцитов в гипоксических условиях до 50 %. На основании этих данных в 2020 году было начато исследование фазы 1/2, в которое были включены три пациента с SCD.⁷⁵ Все пациенты получали миелоаблативное лечение на основе бусульфана перед инфузией трансдуцированных клеток. Несмотря на то, что все препараты имели схожее количество векторов, у пациентов наблюдалось различное маркирование генов в мононуклеарных клетках периферической крови, что говорит о проблемах с самообновлением и приживлением гемопоэтических стволовых клеток в трансплантате. У двух из трех пациентов наблюдалась некоторая польза в виде уменьшения болевых кризов и потребности в переливании крови; однако клинические данные указывали на различную эффективность лечения, что, скорее всего, было связано со степенью достижения и сохранения генной активности в прижившихся гемопоэтических стволовых клетках.

В то время как в большинстве подходов к генотерапии на основе лентивирусных векторов для людей с TDT или SCD использовались векторы, содержащие модифицированную версию гена HBB для создания функциональных копий гена β-глобина, в генотерапии ARU-1801 используются клетки, трансдуцированные лентивирусным вектором, содержащим модифицированный ген ?-глобинаG16D (Таблица 2). Гемоглобин взрослого человека представляет собой тетрамер, состоящий из двух альфа (α-глобин) и двух β (β-глобин) субъединиц, в то время как фетальный гемоглобин, развитие которого регулируется, состоит из двух альфа и двух гамма (γ-глобин) субъединиц. Фетальный гемоглобин является преобладающей формой гемоглобина, экспрессируемой на протяжении всего периода беременности до транскрипционного переключения с синтеза γ-глобина на β-глобин вскоре после рождения, что приводит к экспрессии взрослого гемоглобина⁷⁶. Было показано, что у младенцев с TDT или SCD обычно протекают бессимптомно, пока уровень фетального гемоглобина не снижается в течение первого года жизни, а у взрослых с наследственной персистенцией фетального гемоглобина - состоянием, при котором выработка фетального гемоглобина продолжается после первого года жизни, - также практически не наблюдается проявлений TDT или SCD.^76-78 Эти данные позволяют предположить, что реактивация выработки γ-глобина и фетального гемоглобина может быть безопасным и эффективным способом защиты от симптомов TDT и SCD. По состоянию на февраль 2022 года генотерапия ARU-1801 была проведена пяти пациентам с SCD. Перед инфузией пациенты получали режим кондиционирования пониженной интенсивности с одной дозой melphalan. Результаты показали высокую приживаемость и способность достигать эффективных уровней anti-sickling гемоглобина, что, по мнению авторов, указывает на то, что инфузия ARU-1801 вместе со сниженной интенсивностью режима кондиционирования может обеспечить стойкий и клинически значимый уровень γ-глобина. Реактивация фетального гемоглобина с помощью генотерапии на основе лентивирусного вектора оценивается и в других клинических испытаниях. В 2021 году исследователи описали использование лентивирусного вектора (BCH-BB694) для опосредованного эритроид-специфического нокдауна гена BCL11A, транскрипционного фактора, который подавляет экспрессию γ-глобина и фетального гемоглобина, с использованием адаптированной к микроРНК (миРНК) короткой шпилечной РНК для индуцирования экспрессии фетального гемоглобина⁷⁹. Шесть пациентов наблюдались в течение 6 месяцев после приема BCH-BB694, и у всех пациентов наблюдалось уменьшение или исчезновение клинических проявлений SCD, а у всех пациентов, которых можно было полностью обследовать, наблюдалась надежная и стабильная индукция фетального гемоглобина. Хотя программа клинической разработки ARU-1801 была прекращена в июне 2022 года, дополнительные подходы, основанные на повышении выработки фетального гемоглобина в качестве функционального лечения TDT и SCD, продолжают продвигаться в клинических испытаниях.

Помимо методов добавления генов с помощью вирусных векторов, прогрессивное совершенствование методов редактирования генов, включая CRISPR-Cas9, TALENs и ZFNs, позволило вывести клеточные терапии на основе редактирования генов на ранние и поздние стадии клинических испытаний.

ST-400 - это клеточный продукт, состоящий из аутологичных гемопоэтических стволовых клеток, отредактированных ex vivo с помощью технологии ZFN для разрушения эритроидного усилителя гена BCL11A.^80,81 Доклинические исследования показали, что подход к редактированию генов, устраняющий репрессивную функцию белка BCL11A, приведет к повышению уровня фетального гемоглобина и последующему облегчению симптомов TDT и SCD. В ходе испытания ST-400 (THALES) в фазе 1/2 у первых трех пациентов, которым вводили TDT, наблюдалось приживление нейтрофилов и тромбоцитов, повышение фетального гемоглобина и снижение потребности в трансфузии, хотя все три пациента продолжали нуждаться в трансфузии после введения ST-40082 (табл. 2). Использование редактирования генов ZFN в эритроидной усиливающей области BCL11A для возобновления производства фетального гемоглобина также оценивается в исследовании фазы 1/2 клеточного продукта SAR445136 с редактированием генов (исследование PRECIZN-1) для пациентов с SCD⁸³ (табл. 2). В июне 2021 года были получены предварительные результаты доказательства концепции у четырех пациентов с SCD, которым вводили SAR445136 в течение достаточного времени наблюдения, показавшие, что пациенты успешно приживляли нейтрофилы и тромбоциты, обнаруживали повышение фетального гемоглобина, сохранявшееся в течение 65 недель наблюдения, и не имели рецидивов вазо-окклюзионного криза (ВКО) после инфузии. Хотя эти результаты демонстрируют потенциал клеточных продуктов, редактированных генами ZFN, для лечения пациентов с TDT и SCD, для понимания всего спектра терапевтических преимуществ необходимы данные, полученные от большего числа пациентов, за которыми наблюдали бы в течение длительного периода времени.

Exagamaglogene autotemcel (exa-cel) - это клеточная терапия, которая также предназначена для реактивации фетального гемоглобина, но использует редактирование ex vivo CRISPR-Cas9 в области эритроидного энхансера гена BCL11A в аутологичных CD34+ HSPCs.⁸⁴ Рибонуклеопротеиновый комплекс, состоящий из Cas9 и высоко-специфичной gRNA SPY101, используется для нацеливания на критический сайт связывания транскрипционного фактора GATA1 в не-кодирующей области энхансера BCL11A на хромосоме 2, специфичной для эритроидной линии. Восстановление этих двуцепочечных разрывов ДНК клеткой с помощью NHEJ приводит к образованию вставок и делеций, которые нарушают связывание GATA1, тем самым избирательно снижая транскрипцию BCL11A только в эритроидных клетках и сохраняя нормальную функцию BCL11A в других типах клеток. Постоянное и точное редактирование генов ex vivo эритроидного энхансерного участка гена BCL11A, который является негативным регулятором выработки фетального гемоглобина,^80,85 приводит к повышению уровня фетального гемоглобина. Как отмечалось ранее, в течение первого года жизни новорожденные и младенцы с TDT или SCD обычно протекают бессимптомно, в то время как уровень фетального гемоглобина остается высоким и становится симптоматичным, когда фетальный гемоглобин снижается после первого года жизни.^76,86 Более того, пациенты с TDT или SCD, которые наследуют наследственную персистенцию фетального гемоглобина (HPFH), при которой экспрессия фетального гемоглобина продолжается на протяжении всей взрослой жизни, практически не болеют и обычно здоровы.⁷⁸ В статье Frangoul et al.⁸⁴, опубликованной в 2021 году, сообщается о доклинических исследованиях, оценивающих точность редактирования с помощью CRISPR-Cas9, и о первых клинических результатах первых двух пациентов, одного с TDT и одного с тяжелой формой SCD, которым вводили exa-cel. Частота редактирования генов CRISPR-Cas9 в эритроидном энхансере BCL11A была оценена в гемопоэтических стволовых клетках CD34+ от десяти здоровых доноров и показала высокую частоту редактированных аллелей (в среднем 80%) во всех субпопуляциях клеток CD34+, которая сохранялась с течением времени. Было показано, что приживление CD34+ HSPC у иммуно скомпрометированных мышей было эквивалентным для контрольных и sgRNA CRISPR-Cas9-редактированных клеток. Вычислительные методы с использованием анализа сходства последовательностей, а также экспериментальное секвенирование нового поколения с высоким охватом с помощью GUIDE-seq показали, что CRISPR-Cas9-редактированные стволовые клетки от четырех здоровых доноров не имеют признаков вне-целевого редактирования.⁸⁴ Функционально способность к приживлению отредактированных и не отредактированных HSPC была эквивалентной, что свидетельствует о том, что CRISPR-Cas9-редактирование не влияет на функцию гемопоэтических стволовых клеток. Наконец, изолированные отредактированные стволовые клетки, которые дифференцировались в эритроидную линию, имели повышенный средний уровень фетального гемоглобина по сравнению с не-редактированными клетками⁸⁴.

С клинической точки зрения, после миелоаблативного кондиционирования бусульфаном и последующей инфузии exa-cel у пациентов с TDT и тяжелой формой SCD произошло приживление нейтрофилов и тромбоцитов, а также повышение общего гемоглобина и фетального гемоглобина с панцеллюлярным распределением и высоким уровнем аллельного редактирования в костном мозге и крови.⁸⁴ Важно, что после более чем года наблюдения пациент с TDT оставался независимым от трансфузий, а у пациента с SCD не было вазо-окклюзионных событий. Эти результаты подтвердили возможность использования exa-cel в качестве лечебного средства для пациентов с TDT и SCD.

Exa-cel перешел в фазу 3 основных клинических испытаний (CLIMB THAL-111 и CLIMB SCD-121) (табл. 1 и 2). Пока оба клинических испытания продолжаются, в 2023 году были представлены данные об эффективности и безопасности 96 пациентов, получавших препарат exa-cel. В целом, 32 из 35 пациентов с периодом наблюдения не менее 16 месяцев соответствовали первичной конечной точке исследования CLIMB THAL-111, не требуя переливания крови в течение как минимум 12 месяцев (диапазон 13,3-45,1 месяцев) после инфузии exa-cel, а 29 из 31 пациента с периодом наблюдения не менее 16 месяцев соответствовали первичной конечной точке исследования CLIMB SCD-121, не имея VOCs в течение как минимум 12 месяцев (диапазон 14,8-45,5 месяцев), причем некоторые из этих пациентов наблюдались в течение почти 4 лет. Определение VOCs в этом исследовании включало любое событие, связанное с острой болью, потребовавшее обращения в медицинское учреждение и введения обезболивающих препаратов или переливания эритроцитов, острый грудной синдром, приапизм, продолжавшийся более 2 часов и потребовавший обращения в медицинское учреждение, или секвестрацию селезенки. В соответствии с наблюдаемым исключением трансфузий и VOCs у пациентов с TDT наблюдалось повышение среднего общего гемоглобина и среднего фетального гемоглобина к 3 месяцу (более 9 g/dL) после инфузии exa-cel, а затем средний общий гемоглобин увеличился до более чем 11 g/dL, что сохранялось в течение всего периода наблюдения. У пациентов с SCD средний уровень фетального гемоглобина составлял 36,8 % к 3 месяцу, с панцеллюлярным распределением (более 95 % эритроцитов с фетальным гемоглобином), и этот уровень сохранялся на уровне около 40 % в течение всего периода наблюдения. Доля отредактированных аллелей BCL11A в CD34+ гемопоэтических стволовых клетках костного мозга и мононуклеарных клетках периферической крови у пациентов с TDT и SCD превышала 75% к 6 месяцу и сохранялась у тех, кто наблюдался более 1 года, что свидетельствует о долговременном редактировании CRISPR-Cas9 гемопоэтических стволовых клеток. Профиль безопасности был признан соответствующим миелоаблативному режиму кондиционирования с использованием бусульфана, применявшемуся до инфузии exa-cel. Один пациент с SCD умер из-за тяжелого острого респираторного синдрома, вызванного коронавирусом 2, который развился у не-вакцинированного пациента, имевшего в анамнезе курение и повторяющиеся приступы астмы. Эти результаты, полученные в ходе крупнейшего на сегодняшний день клинического испытания терапии редактирования генов для лечения TDT или SCD, позволяют предположить, что использование CRISPR-Cas9 для редактирования стволовых клеток представляет собой жизнеспособную клиническую методику лечения генетических заболеваний, включая TDT и SCD. Кроме того, клинические результаты подтверждают доклинические данные, а также естественную историю пациентов с TDT и SCD в неонатальном периоде и у тех, кто совместно наследует HPFH, что реактивация фетального гемоглобина с помощью exa-cel имеет потенциал для функционального излечения как TDT, так и SCD. На основании этих данных FDA одобрило препарат exa-cel для лечения пациентов в возрасте 12 лет и старше с SCD в декабре 2023 года и с TDT в январе 2024 года. Дополнительные данные, полученные в ходе испытаний CLIMB THAL-111 и CLIMB SCD-121, а также долгосрочные исследования безопасности и расширения, позволят глубже понять долговечность аллельного редактирования и лечебного эффекта, а также долгосрочный профиль безопасности exa-cel.

Клинические испытания терапевтических методов с использованием подходов генотерапии у пациентов с TDT и SCD в настоящее время демонстрируют потенциал не только для лечения пациентов с этими гемоглобинопатиями, но и возможность однократного функционального излечения, которое ранее было возможно только при использовании аллогенной HSCT с подобранным донором. Хотя многие из этих подходов продемонстрировали доказательную базу, как подробно описано в данном обзоре, некоторые из них, включая терапию редактирования генов на основе CRISPR-Cas9 exa-cel и подходы добавления генов beti-cel и lovotibeglogene autotemcel, которые были недавно одобрены для использования, предоставят новые возможности для лечения пациентов с TDT и SCD в ближайшие годы.