Для применения ex vivo процесс обычно включает три этапа: выделение целевых клеток из организма пациента, генетическая инженерия этих клеток in vitro и последующая аутологичная трансплантация для повторного введения модифицированных клеток в организм пациента. Модифицированные клетки-мишени будут продолжать экспрессировать интересующий ген, тем самым достигая цели лечения. Благодаря минимальному вреду для пациента и знаниям, полученным при трансплантации костного мозга, в качестве основных клеток-мишеней стали использовать клетки крови, включая гемопоэтические стволовые клетки и зрелые клетки крови [22, 23]. Использование Т-лимфоцитов в качестве клеток-мишеней стало преобладающим при изучении зрелых клеток крови. В 1990 году в клинических испытаниях была применена ретровирусная трансдукция гена ADA в Т-клетках в качестве терапевтического подхода для детей с ADA-SCID, которая восстанавливала их иммунные реакции. В течение двух лет генотерапия демонстрировала устойчивую экспрессию гена ADA [24]. В последнее десятилетие химерными антигенами рецепторы (CAR)-Т-клеточная терапия стала весьма перспективным иммунотерапевтическим подходом в борьбе с раком. Сконструированные иммунные клетки экспрессируют антигенные рецепторы, способные распознавать и уничтожать опухолевые клетки. Генетически модифицированные иммунные клетки перенаправляются на опухолевые клетки с помощью рецепторов химерных антигенов (CAR), которые перепрограммируют Т-клетки пациента на эффективное уничтожение злокачественных неопластических образований [25]. Хотя CAR относят к разновидности клеточной терапии, она имеет общие черты с генотерапией.

Американское Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) одобрило две генные терапии, Casgevy (exagamglogene autotemcel) и Lyfgenia (lovotibeglogene autoemcel), для лечения серповидноклеточной болезни (SCD) 8 декабря 2023 года [26, 27]. Это событие является первым разрешением на применение клеточной генотерапии для пациентов в возрасте 12 лет и старше с серповидно-клеточной болезнью в Соединенных Штатах. Примечательно, что Casgevy - это первое терапевтическое вмешательство с использованием технологии редактирования генов CRISPR-Cas9, получившее одобрение FDA (рис. 1). SCD вызывается мутациями в гене β-глобиновой цепи гемоглобина и поражает более трех миллионов человек во всем мире [28]. BCL11A - транскрипционный фактор, отвечающий за подавление экспрессии фетального гемоглобина (HbF). После мобилизации костного мозга у пациента были собраны CD34+ гемопоэтические стволовые клетки и клетки предшественники. Эритроидный энхансерный регион BCL11A был точно нацелен с помощью молекулы одиночной направляющей РНК (sgRNA) для точного редактирования генов гемопоэтических стволовых клеток пациента. После серии миелоаблативных процедур отредактированные клетки-мишени были возвращены, что привело к увеличению производства HbF у пациента [9]. Согласно имеющимся на данный момент данным клинических исследований (NCT03745287 и NCT04208529), доля HbF в общем гемоглобине (Hb) после применения препарата Casgevy составила 43,9% на шестом месяце, и этот уровень сохранялся на протяжении всего периода наблюдения (не менее 24 месяцев). Подход к генотерапии, используемый компанией Lyfgenia, который также относится к способу ex vivo, отличается стратегией лечения (рис. 1). В нем используется лентивирусный вектор BB305 для трансдукции модифицированных генов β-глобина в гемопоэтические стволовые клетки, что приводит к выработке HbAT87Q, устойчивого к заболеванию гемоглобина, который может противодействовать полимеризации серповидного гемоглобина [29]. По состоянию на 13 февраля 2023 года данные исследований фазы 1/2 HGB-206 группы С (NCT02140554) и фазы 3 HGB-210 (NCT04293185) показали, что полное разрешение тяжелых вазо-окклюзивных событий (ТВОС) и ВОС наблюдалось у значительной части оцениваемых пациентов, причем показатели достигли 94% (32/34) и 88% (30/34), соответственно, в течение пятилетнего периода наблюдения (медиана продолжительности: 35. 5 месяцев; диапазон: 0,3-61 месяц), охвативший в общей сложности 47 пациентов.



figure 1 To illustrate the ex vivo gene therapy approach, we employ sickle cell anemia as a paradigm for gene therapy. Casgevy: Initially, CD34 + hematopoietic stem and progenitor cells were isolated from the patient. Precise gene editing was performed on the patient's hematopoietic stem cells by specifically targeting the erythroid enhancer region of BCL11A using a single-guide RNA molecule (sgRNA). Subsequently, the edited cells were reintroduced into the patient's body with the aim of combating sickle cell anemia through increased expression of HbF. Lyfgenia: The BB305 lentiviral vector was employed to transduce modified Я-globin genes into hematopoietic stem cells, resulting in the production of HbAT87Q—a hemoglobin variant that is resistant to disease and capable of inhibiting sickle hemoglobin polymerization. The remaining steps remain consistent with those described by Casgevy. Created with BioRender.com

Помимо легкодоступных клеток крови, сочетание индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) и технологии редактирования генов предлагает альтернативный подход к генотерапии ex vivo. Появление iPSCs и их производных, которое произошло 16 лет назад, обеспечило ценный источник человеческих клеток для различных применений, включая открытие лекарств, оценку токсичности, моделирование заболеваний и персонализированную клеточную терапию [30]. Синергетическое использование iPSCs в сочетании с технологией редактирования генов заложило прочную основу для индивидуальной клеточной терапии [31]. Выделив мононуклеарные клетки периферической крови (PBMCs) пациентов и подвергнув их генному перепрограммированию, можно вызвать их превращение в плюрипотентные стволовые клетки. Впоследствии эти плюрипотентные стволовые клетки могут быть генетически модифицированы для исправления дефектных генов пациента. С помощью контролируемых условий дифференцировки плюрипотентные стволовые клетки могут быть направлены в определенные клеточные линии и впоследствии вновь введены в организм пациента, тем самым достигая терапевтических целей [32].

Подход in vivo, в отличие от метода доставки генов ex vivo, имеет большее сходство с обычным введением фармацевтических агентов. К ним относятся периферическая внутривенная инфузия (системное введение) или локальная инфузия (например, в воротную вену, почечную вену, интратекальная инъекция), целевое введение в ткани (локальное введение в определенные области мозга, субретинальные инъекции) и периферическая внутримышечная инъекция [33-35]. Исследовательская задача генотерапии in vivo заключается в повышении точности, эффективности и долгосрочной результативности генотерапии. В настоящее время большинство одобренных препаратов для генотерапии преимущественно используют введение in vivo.

Важнейшим этапом генотерапии является доставка терапевтических генов в клетки и ткани-мишени. Носители, используемые для доставки генов, включают платформы вирусных векторов, а также платформы не-вирусных векторов (табл. 1).

Таблица 1 Преимущества и недостатки вирусных и невирусных векторов

Структурные компоненты вирусных векторов для генотерапии состоят из трех основных элементов. Во-первых, белковый капсид или оболочка определяет специфическое распознавание и сродство к клеткам тканей-мишеней. Во-вторых, интересующий ген, экспрессируясь в клетке, достигает желаемого терапевтического эффекта. Наконец, регуляторная кассета, включающая энхансеры, промоторы и другие регуляторные элементы, отвечает за точную регуляцию стабильной или транзиторной экспрессии интересующего гена. В настоящее время наиболее распространенными и широко используемыми платформами вирусных векторов являются аденовирусы, лентивирусы, аденоассоциированные вирусы (AAV) и вирус простого герпеса (HSV).

Аденовирусы - это не-развивающиеся, линейные, двухцепочечные ДНК-вирусы. Аденовирусы, используемые в современной генотерапии, происходят от аденовирусов человека серотипов 2 и 5. Благодаря генной инженерии и модификации генома аденовируса дикого типа, специфические структуры заменяются трансгенами, что приводит к созданию серии векторов генотерапии на основе аденовирусов. Аденовирус, как вектор генотерапии, обладает значительными преимуществами благодаря своей прочной упаковке, достигающей в ряде модификаций 36 Кб. Кроме того, векторы на основе аденовирусов демонстрируют высокую эффективность трансдукции как в покоящихся, так и в делящихся клетках, проявляя широкий тропизм к различным типам тканей. Важно, что они остаются не интегративными в геноме хозяина. Однако широко распространенный вирусный иммунитет среди населения и сильная иммуногенность аденовируса накладывают ограничения на его применение в генотерапии. В настоящее время он преимущественно используется для разработки инновационных вакцин и лечения рака [36, 37].

AAV - это одноцепочечный ДНК-вирус, содержащий четыре известные открытые рамки считывания. В настоящее время он признан непатогенным и не связан ни с какими заболеваниями [38]. Объем его упаковки составляет примерно 4,7 кб. Из-за ограниченной емкости упаковки была разработана двухвекторная система для эффективной упаковки генома [39]. AAV демонстрируют разнообразный тканевой и клеточный тропизм, что обусловлено существующими серотипами AAV и модификациями вирусного капсида. Кроме того, включение тканеспецифичных промоторов значительно усилило его тропизм [40]. По сравнению с другими вирусными векторами, AAV отличается минимальной иммуногенностью. Многочисленные клинические испытания на основе этой платформы быстро распространились.

Лентивирус относится к одноцепочечным РНК-ретровирусам, характеризуется долгосрочным интегрированным вектором и емкостью упаковки около 9 кб. Он служит эффективной платформой для ген-модифицированной клеточной терапии, позволяя экспрессировать несколько генов с помощью одного вектора. Генная модификация in vitro в значительной степени зависит от использования лентивирусов [41].

Естественно, HSV распространяется в основном при прямом контакте, преимущественно в периоральной области. Обычно он проявляется как относительно доброкачественное заболевание; однако в редких случаях он может поражать центральную нервную систему и роговицу, вызывая такие серьезные последствия, как энцефалит и нарушение зрения. Преобразованный HSV-1 стал перспективным средством генотерапии благодаря своим нейротропным свойствам, что делает его потенциально ценным в борьбе с неврологическими расстройствами [42]. Кроме того, преимуществом этого вируса является его способность к надежной упаковке. В мае 2023 года препарат «Vyjuvek» был одобрен в США. В нем используется вектор HSV-1 для доставки гена COL7A1, кодирующего коллаген VII типа, который используется для лечения дистрофического эпидермолиза. Более того, он представляет собой прорыв как первый одобренный FDA препарат для генотерапии, предназначенный для многократного применения и используемый местно в виде геля [43].

В настоящее время примерно в 70% клинических исследований используются вирусные векторы. Однако использование вирусных векторов сопровождается определенными ограничениями, такими как трансгенные инсерционные мутации, иммуногенность и сложные процедуры подготовки, что накладывает ограничения на их применение [44-46]. В связи с этим изучение не-вирусных векторов продемонстрировало значительный потенциал и необходимость. По сравнению с вирусными векторами, не-вирусные векторы обладают более высокой загрузочной способностью нуклеиновых кислот и безопасностью, а также обеспечивают большую гибкость в отношении химического состава и более широкий выбор сырья. Не-вирусные векторы включают в себя широкий спектр систем доставки, в том числе липидные наночастицы (LNPs), экзосомы, катионные полимеры, такие как (PAE), одноцепочечные циклические полимеры (SCKPs), полиэтиленимин (PEI), поли(амидоамин) (PAMAM), полидиметиламиноэтилметакрилат (PDMAEMA), хитозан (CS) и циклодекстрин (CD), неорганические наночастицы и интеллектуальные гидрогели. Примечательно, что LNPs и катионные полимеры получили значительное распространение в различных областях применения [47, 48]. Недавно команда Zhang Feng's открыла программируемый метод доставки белка, использующий бактериальные сократительные инъекционные системы (eCISs). Эти eCIS представляют собой естественные системы доставки белка, похожие на «инъектор», который есть у бактерий. Хвостовые волокна eCISs были модифицированы таким образом, чтобы они могли нацеливаться на конкретные клетки и переносить различные белки, такие как Cas9 и белки-редакторы оснований. Кроме того, модификации других компонентов этой системы потенциально могут позволить доставлять РНК или ДНК [49]. Эта система обещает стать безопасным и эффективным инструментом для генотерапии в будущем.

В течение последних двух десятилетий все большее внимание уделяется выявлению причинных генов высокопроникающих менделевских (моногенных) заболеваний человека. Эти заболевания, характеризующиеся низкой частотой встречаемости, принято классифицировать как сиротские болезни. В отличие от моногенных, полигенные заболевания связаны с мутациями нескольких генов или с однонуклеотидными полиморфизмами. Влияние этих вариантов относительно меньше, и в основе механизма развития сложных заболеваний лежит накопление тонких эффектов на ключевые гены и регуляторные пути, которые способствуют риску заболевания. Появление широкогеномных ассоциативных исследований (GWAS) вселило оптимизм в выявление единичных полиморфных вариантов, оказывающих заметное функциональное влияние на сложные признаки. Показатели полигенного риска служат индикаторами предрасположенности человека к заболеваниям [50, 51]. Полигенные заболевания охватывают группу распространенных возрастных состояний, таких как сердечно-сосудистые заболевания, диабет и рак. Кроме того, такие сложные полигенные заболевания, как астма, болезнь Крона, шизофрения, системная красная волчанка, с ранним или средним возрастом становятся объектами исследовательского интереса [52]. В отличие от моногенных расстройств, стратегии лечения полигенных заболеваний направлены не только на устранение симптомов, но и на значимые ранние профилактические меры для смягчения дальнейшего ущерба, вызванного прогрессированием заболевания. Отдельные клинические испытания генотерапии при немоногенных заболеваниях обобщены в таблице 2.

Table 2 Selective clinical trials for gene therapy in non-monogenetic diseases

Коронарная болезнь сердца (CAD) в первую очередь связана с прогрессирующим сужением коронарных артерий, вызванным атеросклерозом, что впоследствии приводит к ишемической болезни сердца. За последние два десятилетия было предпринято несколько попыток применить генотерапию для лечения CAD Терапевтические подходы, используемые в клинических испытаниях для лечения CAD в основном направлены на стимулирование терапевтического ангиогенеза (рис. 2). Для этого используется вектор для доставки кДНК специфических клеточных факторов, стимулирующих ангиогенез, в пораженный участок миокарда путем прямой интрамиокардиальной или внутриартериальной инъекции. Обычно используются такие факторы, как фактор роста эндотелия сосудов (VEGF), семейство факторов роста фибробластов (FGF), фактор роста гепатоцитов (HGF), фактор роста стромальных клеток 1 (SDF-1), причем VEGF является наиболее изученным. По сравнению с прямым использованием белковых препаратов, путь генерирования белка, опосредованный генотерапией, имеет потенциал для повышения уровня терапевтического белка более устойчивым и стабильным образом. Первое клиническое испытание для CAD было проведено в 1998 году Douglas W. Losordo и другими [121]. В этом исследовании ученые проводили прямую инъекцию голой плазмиды (phVEGF165), кодирующей VEGF, в ишемический миокард. После лечения у пациентов наблюдалось значительное снижение частоты стенокардии, что было подтверждено однофотонной эмиссионной компьютерной томографией, продемонстрировавшей уменьшение ишемии миокарда. Впоследствии был проведен ряд клинических исследований с использованием Ad или голых плазмидных векторов (PI), включая KAT301 (Ad, VEGF-D^δNδC), ASPIRE (Ad, FGF-4), Haoyu Meng et al. (Ad, HGF), AFFIRM (Ad, FGF-4) (NCT02928094), исследование VEGF-Neupogen (PI, VEGF-A165-hGCSF), VIF-CAD (PI, VEGF-A165/bFGF) и NORTHERN (PI, VEGF-A165) [53, 65, 70, 122-124]. По данным завершенных или продолжающихся клинических исследований, хотя некоторые из них дали положительные результаты, продемонстрировав безопасность и эффективность генотерапии на основе терапевтического ангиогенеза в лечении CAD в целом результаты лечения остаются неудовлетворительными. Ограниченная эффективность трансдукции вектора в ткани миокарда и преходящая продолжительность экспрессии трансгена могут быть ключевыми факторами, препятствующими терапевтической эффективности. Кроме того, методологические соображения, такие как усиление эффекта плацебо в экспериментах и отсутствие чувствительных показателей оценки эффективности, также создают проблемы для развития генотерапии при CAD [125]. В настоящее время не существует препаратов, получивших одобрение на рынке.



figure 2 Gene therapy strategies for cardiovascular diseases. VEGF: Vascular endothelial growth factor; FGF: Fibroblast growth factor family; HGF: Hepatocyte growth factor; SDF-1: Stromal cell-derived factor 1; Ang: Angiotensin; SERCA2a: Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2 + ATPase. Created with BioRender.com

В последнее время исследования продемонстрировали ключевую роль эпигенетики в развитии сердечно-сосудистых заболеваний. Эпигенетические механизмы, включая метилирование ДНК, модификации гистонов и некодирующие РНК, сложным образом регулируют гены, связанные с патологией заболевания. Кроме того, для борьбы с сердечно-сосудистыми заболеваниями были разработаны терапевтические мероприятия, направленные на эпигенетические пути регуляции. Хотя в настоящее время эти препараты находятся на стадии доклинических или клинических испытаний, такой подход к лечению открывает дополнительные потенциальные возможности для лечения заболеваний [126].

Заболевания периферических артерий (PAD) обусловлены закупоркой крупных артерий нижних конечностей в результате атеросклероза, что приводит к ишемии конечностей и ряду клинических проявлений, включая боль, хромоту и язвы. Как и при лечении CAD терапевтический ангиогенез становится ключевой стратегией лечения PAD FGF исследовался в этом контексте в таких исследованиях, как Comerota et al. [127], TALISMAN [128] и TAMARIS [129], в которых в качестве векторов использовались плазмиды. Morishita et al. [130], HGF-STAT [131] и Powell et al. [132] также использовали плазмидные векторы; однако их отличие заключается в специфическом нацеливании на HGF. В экспериментах RAVE [133], Deev et al. [134] и других в качестве вектора, несущего кДНК VEGF, использовался аденовирус. Примечательно, что два лечебных препарата получили одобрение для лечения PAD Collategene [135], препарат для генотерапии, несущий ген HGF на плазмиде, был одобрен Министерством здравоохранения, труда и благосостояния Японии в 2019 году. Этот терапевтический подход направлен на лечение окклюзионного атеросклероза и облитерирующего тромбоангиита, которые не отвечают на стандартную лекарственную терапию. Кроме того, препарат Neovasculgen[136], основанный на плазмиде-VEGF165, получил разрешение на применение в России еще в 2011 году.

По мере углубления понимания патогенеза сердечной недостаточности было выявлено несколько важнейших мишеней, участвующих в возникновении и прогрессировании заболевания. Эти мишени демонстрируют характерную устойчивость к традиционным фармакологическим вмешательствам, однако перспективным подходом стала генотерапия. Различные трансгенные стратегии в основном направлены на три ключевые области: ангиогенез, регуляцию внутриклеточной кальциевой сигнализации и β-адренергическую сигнализацию. Sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase (SERCA2a) служит основным кальциевым насосом в кардиомиоцитах, способствуя рециркуляции ионов кальция в саркоплазматическом ретикулуме. Его ключевая роль в поддержании стабильной внутриклеточной концентрации ионов кальция является незаменимой. Регуляция SERCA2a продемонстрировала многообещающий потенциал в улучшении сердечной функции, что делает ее привлекательным целевым геном для терапии сердечной недостаточности [137]. В исследование CUPID 2 была включена когорта из 250 пациентов с сердечной недостаточностью, которым была проведена однократная инфузия AAV1-SERCA2 в коронарную артерию. К сожалению, введение AAV1-SERCA2 в этом клиническом исследовании не привело к заметному улучшению общей клинической картины у пациентов с сердечной недостаточностью [138]. Стромальный клеточный фактор-1 (SDF-1) - хемотаксический белок, который связывается с рецептором CXCR-4, способствуя тем самым ангиогенезу и облегчая регенерацию тканей. В исследовании STOP-HF пациентам с сердечной недостаточностью путем эндокардиальной инъекции вводилась плазмида голой ДНК, кодирующая человеческий SDF-1 (pSDF-1). Хотя эффективность pSDF-1 в исследовании STOP-HF не была установлена, его данные подтвердили безопасность этого терапевтического подхода [92]. Аденилилциклаза (AC) катализирует превращение аденозинтрифосфата в циклический аденозинмонофосфат (цАМФ). Изоформа AC6, обнаруженная в клетках сердечной мышцы, играет важнейшую роль. Дисфункция β-адренергической сигнальной системы является важным патологическим механизмом, способствующим развитию сердечной недостаточности. Таргетинг сверхэкспрессии AC для повышения уровня цАМФ может стать перспективным терапевтическим подходом к лечению сердечной недостаточности. Данное клиническое исследование фазы 2 направлено на изучение эффективности Ad5, кодирующего аденилилциклазу 6 (Ad5.hAC6). На 4-й неделе в группе лечения наблюдалось значительное улучшение фракции выброса (EF) (+ 6,0 [1,7] единиц EF; n = 21; Pменее 0,004), однако к 6-й неделе результаты продемонстрировали отсутствие устойчивого эффекта [139]. Эти неудовлетворительные результаты свидетельствуют о том, что генотерапия сердечной недостаточности зашла в тупик.

Вакцины на основе ДНК или РНК первоначально появились в области инфекционных заболеваний. В 2023 году ученые Katalin Kariko and Drew Weissman были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине за новаторские открытия в области модификации нуклеотидов, которые открыли путь к созданию высокоэффективных мРНК-вакцин против COVID-19. Модификация нуклеотидных оснований позволяет предотвратить распознавание организмом синтезированной мРНК как чужеродной, что значительно ускоряет клиническое применение мРНК-вакцин. Во время пандемии COVID-19 две репрезентативные вакцины на основе мРНК - BNT162b2 (Comirnaty) и mRNA-1273 (Spikevax) [140]. ДНК-вакцины создаются на основе рекомбинантных плазмид, кодирующих вирусные антигены. После трансдукции в клетки хозяина эти плазмиды способствуют производству белков или пептидов посредством процессов транскрипции и трансляции. Концепция разработки вакцины против гипертонии предполагает замену кодирующей последовательности вирусного антигена на последовательность собственного антигена. Прежде всего, ангиотензин I (Ang I) становится основной мишенью для самонаправленного вмешательства. В рандомизированном двойном слепом плацебо-контролируемом клиническом исследовании вакцина против ангиотензина I PMD3117 была введена пациентам с гипертонией, однако результаты не продемонстрировали значительного снижения артериального давления [141]. Учитывая потенциальную вовлеченность ренина и пути обратной связи Ang II в ее неудачу, исследователи перенаправили свое внимание на Ang II. Вакцина против Ang II продемонстрировала многообещающие результаты в доклинических исследованиях [142]. Испытание AGMG0201, фаза I/IIa, направлено на оценку безопасности, переносимости и иммунологического ответа модифицированной ДНК-вакцины ангиотензина II (AGMG0201). Примечательно, что у пациентов в группе AGMG0201 были выявлены уровни антител против ангиотензина II, особенно среди тех, кто получал более высокие дозы [110]. Однако дальнейшая клиническая эффективность должна быть подтверждена в ходе дополнительных тщательных клинических испытаний. Zilebesiran, препарат РНК-интерференции, направленный на синтез печеночного ангиотензиногена, продемонстрировал значительное снижение 24-часового среднего амбулаторного систолического артериального давления (SBP) в течение 3 месяцев у взрослых с мягкой и умеренной гипертензией в ходе исследования фазы 2 при приеме в различных дозах и с интервалом в 3 или 6 месяцев (NCT04936035).

Гиперлипидемия является общепризнанным фактором риска развития CAD, а липопротеины низкой плотности (LDL) тесно связаны с развитием коронарного атеросклероза. Поэтому снижение уровня LDL стало основной целью липидснижающей терапии. В последние годы прогресс в генетическом анализе позволил выявить новые мишени, включая пропротеинконвертазу субтилизин/кексин 9-го типа (PCSK9), ангиопоэтинподобный белок (ANGPTL3), аполипопротеин C-III (ApoC-III) и липопротеин(a) (Lp(a)) (рис. 3). Целью липидпонижающей терапии является достижение оптимальной эффективности и длительной продолжительности действия. Разработка препаратов для липидпонижающей терапии идет по пути от традиционных пероральных препаратов (принимаемых ежедневно) до препаратов моноклональных антител (принимаемых ежемесячно или раз в полмесяца), олигонуклеотидных препаратов (принимаемых еженедельно или ежемесячно), препаратов siRNA (принимаемых раз в полгода) и далее, причем изучаются и более длительные сроки действия [143]. Антисмысловые олигонуклеотиды (ASO) - это химически модифицированные фрагменты одноцепочечных молекул ДНК или РНК, используемые для лечения заболеваний человека посредством таких механизмов, как ингибирование трансляции, деградация мРНК и регуляция сплайсинга. Путь РНК-интерференции, опосредованный малыми двухцепочечными молекулами РНК (dsRNA), способствует деградации мРНК и снижению экспрессии генов, вызывая эффект сайленсинга генов [144]. PCSK9, выступая в качестве партнера рецептора LDL, способствует перемещению рецептора LDL в лизосому, тем самым усиливая его деградацию. В тех случаях, когда функция PCSK9 нарушена, он препятствует процессу деградации рецептора LDL и способствует его утилизации, что в конечном итоге приводит к снижению уровня LDL. Inclisiran - это препарат на основе siRNA, нацеленный на PCSK9. Исследование ORION-3 - это четырехлетнее открытое исследование, проводившееся в пяти странах, которое продемонстрировало среднее снижение уровня LDL на 44,2% (95% CI: 47,1 ~ 41,4) и уровня PCSK9 на 62% ~ 77,8% соответственно в течение четырехлетнего периода наблюдения. Частота возможных серьезных побочных реакций, связанных с лечением, составила 1%. Эти данные являются убедительным доказательством устойчивой эффективности и благоприятного профиля переносимости двухгодичных инъекций инклизирана для снижения уровня LDL в течение длительного времени [101]. Ранее в исследованиях ORION-9 [99], ORION-10 [98] и ORION-11 [145] была доказана липид-снижающая эффективность и переносимость инклизирана в течение 18 месяцев. Olpasiran также является препаратом на основе siRNA, который эффективно препятствует печеночной сборке Lp(a) путем снижения его экспрессии в гепатоцитах, что приводит к снижению уровня Lp(a). Испытание 2-й фазы OCEAN[a]-DOSE показало, что подкожное введение Олпасирана в дозе 75 мг или выше каждые 12 недель приводит к значительному снижению уровня Lp(a), превышающему 95 %, после 36 недель наблюдения. Примечательно, что все пациенты (100 %), получавшие олпасиран в дозе 75 мг или 225 мг каждые 12 недель, достигли нормального уровня Lp(a) [103]. Pelacarsen (AKCEA-APO(a)-LRx, IONIS- APO(a)-LRx, TQJ230) - олигонуклеотидный препарат, который ингибирует синтез apo(a), что приводит к дозозависимому снижению уровня Lp(a) до 80 % [146]. В настоящее время проводятся клинические испытания III фазы (NCT04023552). Кроме того, Vupanorsen и Volanesorsen продемонстрировали многообещающие результаты в качестве ASO-препаратов, нацеленных на ANGPTL3 и ApoC-III соответственно [105, 107, 108]. Кроме того, in vivo редактирование генов PCSK9 у приматов показало потенциал для долгосрочного снижения уровня липидов путем снижения уровня LDL в течение как минимум 8 месяцев [147].



figure 3 The targets for gene therapy in the treatment of hyperlipidemia. PCSK9, acting as a partner of the LDL receptor, facilitates the trafficking of the LDL receptor to the lysosome, thereby enhancing its degradation. Inclisiran is a siRNA-based drug targeting PCSK9, it hampers the degradation process of the LDL receptor and promotes its recycling instead, ultimately leading to reduced levels of LDL. Olpasiran is a siRNA-based agent that effectively impedes the hepatic assembly of Lp(a) by downregulating its expression in hepatocytes, Pelacarsen is an oligonucleotide drug that inhibits the synthesis of apo(a), resulting in a dose-dependent reduction in Lp(a) levels. Vupanorsen and Volanesorsen are ASO drugs targeting ANGPTL3 and ApoC-III respectively. Lp(a): Lipoprotein(a); VLDL: Very low-density lipoprotein; IDL: Intermediate-density lipoprotein; LDL: Low-density lipoprotein; PCSK9: Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9; APOC3: Apolipoprotein C-III; ANGPTL3: Angiopoietin-like protein; ASO: Antisense oligonucleotides; LPL: Lipoprotein lipase. Created with BioRender.com

Болезнь Альцгеймера (AD) - это многогранное нейродегенеративное заболевание, которым страдают более 50 миллионов человек во всем мире, преимущественно пожилые люди [148]. AD характеризуется аномальным накоплением амилоида-бета (Аβ) в коре головного мозга и гиппокампе, а также аберрантным формированием нейрофибриллярных клубков, что приводит к прогрессирующей потере памяти и когнитивным нарушениям. В настоящее время патологические механизмы, лежащие в основе AD, остаются не до конца выясненными. Гипотезы о его патогенезе включают в себя повышенный уровень белков tau, снижение антиоксидантной способности, нарушение холинергической активности, нейрональное воспаление и др. Кроме того, благодаря достижениям в области GWAS и эпидемиологических исследований были выявлены многочисленные гены, потенциально связанные с AD, включая APOE, TREM2, FERMT2, APP и т. д.; эти гены вовлечены в разнообразный набор белков, прямо или косвенно связанных с AD [148]. Человеческий аполипопротеин Е (APOE) считается наиболее значимым генетическим фактором, ассоциированным с поздним развитием AD, причем APOE имеет три аллеля e2, e3 и e4. Среди этих аллелей e4 кодирует апоЕ4, который определяет пожизненный риск развития AD к 85 годам примерно на 30 % у гетерозигот по apoЕ4 и примерно на 65 % у гомозигот по apoЕ4. Однако считается, что APOE, кодируемый e2, оказывает защитное действие. В физиологических условиях APOE в первую очередь способствует транспорту и обмену липидов и холестерина, а также играет важнейшую роль в поддержании и восстановлении нейронов. ApoЕ4 способствует выработке Аβ, препятствуя его деградации, вызывает аномальное гиперфосфорилирование белка tau, влияет на функцию и активацию нейровоспалительных клеток, что в конечном итоге способствует патогенезу AD [149]. Проводимое исследование фазы 1/2 с открытой меткой (NCT03634007) направлено на интратекальное введение вектора переноса генов серотипа AAVrh.10, экспрессирующего кДНК, кодирующую человеческий аполипопротеин Е2 (APOE2), для оценки терапевтической эффективности данного вмешательства у лиц с AD, гомозиготных по APOE4. Доклиническая оценка безопасности была проведена на нечеловеческих приматах [150]. Фактор роста нервов (NGF), эндогенный нейротрофический фактор с нейропротекторными свойствами, представляет собой еще одну мишень для генотерапии AD. В одном из исследований (NCT00876863) AAV2-NGF вводили путем стереотаксической интрацеребральной инъекции в базальные ганглии. Однако, к сожалению, не было отмечено существенной разницы между группами лечения и плацебо по когнитивной подшкале Шкалы оценки болезни Альцгеймера [151]. Учитывая связь между поздним началом AD и старением, данное исследование (NCT04133454) направлено на использование генотерапии Либеллы (LGT), в частности, с использованием векторов AAV, несущих активную теломеразу (hTERT), для ослабления старения нейронов. Однако текущий ход этого исследования остается нераскрытым. В 2022 году было начато новое клиническое исследование (NCT05040217), направленное на нейротрофический фактор мозга (BDNF), в котором в качестве вектора используется AAV2. BDNF осуществляет регуляторный контроль над функцией нейронов в важнейшей цепи памяти мозга; однако пока не было опубликовано никаких отчетов о результатах исследования.

В настоящее время применение CRISPR-Cas9 при AD находится в основном на стадии создания животных моделей, что предполагает создание более фенотипически релевантных моделей для изучения патогенеза заболевания и поиска потенциальных методов лечения [152].

Болезнь Паркинсона (PD) - гетерогенное заболевание, на которое влияют многочисленные факторы. На сегодняшний день идентифицировано более 100 генов или генных локусов, связанных с предрасположенностью к PD (например, SNCA, LRRK2, GBA). В большинстве случаев заболевание возникает в результате комбинированного воздействия многочисленных распространенных или редких генетических мутаций. PD характеризуется дисфункцией нейронов базальных ганглиев, при которой дегенерация дофаминовых нейронов в substantia nigra нарушает сигнальный путь между substantia nigra и стриатумом. Гены восприимчивости к PD имеют сложные ассоциации с синаптическими, лизосомными, митохондриальными дисфункциями и иммунными реакциями [153]. На основе выявленных потенциальных генов восприимчивости в клинических испытаниях были применены генные терапии, направленные на эти точки. Стратегии лечения в основном включают защиту нейронов, стимулирование выработки дофамина и усиление сигнального пути γ-аминомасляной кислоты GABA.

Нейротрофин (NTN) и нейротрофический фактор линии глиальных клеток (GDNF) являются нейротрофическими факторами, обеспечивающими защиту нейронов. Повышение уровня NTN и GDNF, способствующее регенерации нейронов, представляет собой терапевтическую мишень для лечения PD. В рандомизированном исследовании фазы 2, проведенном Marks WJ Jr и коллегами, пациентам с PD были сделаны двусторонние инъекции AAV2-NTN в эпутамен. Результаты не выявили статистически значимой разницы в первичных конечных точках между группой лечения и контрольной группой, получавшей фиктивную операцию [115]. В другом клиническом испытании исследователи продемонстрировали осуществимость и безопасность двусторонней стереотаксической инъекции в substantia nigra и putamen AAV2-neurturin (CERE-120) (IV класс доказательности) [154]. Клинические испытания, направленные на GDNF, включают NCT01621581 и NCT04167540, в обоих в качестве вектора используется AAV2.

Декарбоксилаза ароматических L-аминокислот (AADC) - важнейший фермент, необходимый для биосинтеза дофамина. Тирозингидроксилаза (TH) способствует превращению L-тирозина в молекулу-предшественницу дофамина. В исследовании VY-AADC01 использовалась двусторонняя доставка препарата в путамен, которая осуществлялась с помощью магнитно-резонансной томографии (с использованием gadoteridol и AAV2, несущего кДНК AADC). В трех когортах доз наблюдалось соответствующее увеличение активности фермента на 13% (общая доза = 7,5 х 10¹¹vg), 56% (общая доза = 1,5 х 10¹²vg) и 79% (общая доза = 4,7 х 10¹²vg), при этом активность фермента оценивалась с помощью PET [155]. В другом исследовании использовался лентивирусный вектор, несущий ген, кодирующий ADCC, TH и циклогидролазу 1 (ProSavin). В течение 12-месячного периода наблюдения не было отмечено значительных побочных эффектов. Заметное улучшение средних показателей двигательной активности по шкале UPDRS part III было отмечено на 6-м месяце (средний балл 38 [SD 9] против 26, n = 15, p = 0-0001). Кроме того, устойчивое улучшение двигательных показателей по шкале UPDRS части III было отмечено и на 12-м месяце (38 против 27; n = 15; p = 0-0001) [156]. В настоящее время проводятся клинические испытания, а именно NCT03562494 (AAV2-DDC, VY-AADC02) и NCT03733496 (AAV2-DDC, VY-AADC01).

Декарбоксилаза глутаминовой кислоты (GAD) служит лимитирующим ферментом в производстве GABA важнейшего тормозного нейротрансмиттера в центральной нервной системе. Дисфункция сигнального пути GABA была связана с PD. Цель рандомизированного клинического исследования 2-й фазы, в которое были включены 66 пациентов с PD, - оценить безопасность и терапевтическую эффективность введения AAV2-GAD в субталамическое ядро. В течение 6 месяцев они первоначально проверили профиль безопасности и потенциальные преимущества лечения, связанные с AAV2-GAD [157].

Глюкозилцерамидаза, фермент, локализованный в лизосомах и кодируемый геном GAB1, играет важнейшую роль в катализе гидролиза глюкозилцерамида на глюкозу и церамид. Генетические дефекты в гене GABI связаны с PD [157, 158]. В доклинических моделях усиление экспрессии GABA может иметь терапевтическое значение для PD [159]. В текущем клиническом исследовании (NCT04127578) используется AAV9, несущий ген GBA1, для оценки его безопасности и эффективности в отношении PD, связанного с дефицитом GBA1. Кроме того, в настоящее время проводится клиническое исследование на основе генотерапии ASO BIIB094 (NCT03976349) для лечения PD, связанного с геном LRRK2 [160].

Боковой амиотрофический склероз ( ALS) - смертельное нейродегенеративное заболевание центральной нервной системы, которое можно разделить на спорадическую и семейную формы, причем спорадические случаи составляют примерно 85% всех случаев. В дополнение к ранее признанному моногенному типу наследования, полигенное наследование с участием нескольких генов также вносит значительный вклад в возникновение и прогрессирование ALS. Было выявлено несколько генов, связанных с ALS, включая пенетрантные гены, такие как C9orf72, TARDBP, SOD1, FUS, и гены, которые передают предрасположенность к заболеванию, но не вызывают его напрямую, такие как ANG, ATXN2 и DCTN1 [161]. Примечательно, что мутации в гене SOD1 составляют около 15 % семейных случаев ALS [162]. В клинических испытаниях использовались препараты ASO, направленные на SOD1, в то время как генотерапия, направленная на другие причинные гены семейного ALS, в настоящее время находится в стадии исследования [163, 164]. Атаксин-2 (ATXN2) - многофункциональный РНК-связывающий белок, в первую очередь служащий регуляторным фактором при сборке стрессовых гранул. Установлено, что экспансия тринуклеотидных повторов в ATXN2 может приводить к развитию спиноцеребеллярной атаксии 2-го типа (SCA2). Промежуточные экспансии, не достигающие порога SCA2, в настоящее время признаны фактором риска развития ALS [165]. Кроме того, ATXN2 модулирует активность TDP-43, а мутировавший вариант TDP-43 агрегирует в нерастворимые отложения в нейронах головного и спинного мозга. Примечательно, что TDP-43 локализуется в atxn2-зависимых стрессовых гранулах, представляя собой общий патологический признак [166, 167]. Следовательно, генотерапия, направленная на ATXN2, перспективна не только для решения проблемы ALS, связанной с ATXN2, но и для лечения других распространенных форм ALS, особенно спорадических не-семейных случаев. Проводимое клиническое исследование (NCT04494256), известное как ALSpire Study, направлено на изучение безопасности, переносимости и эффективности BIIB105 у взрослых пациентов с ALS. BIIB105 - это препарат на основе ASO, предназначенный для воздействия на ATXN2.

Молекулярные механизмы, лежащие в основе рака, очень сложны и отличаются значительной степенью гетерогенности у разных людей. В настоящее время традиционные методы лечения включают хирургическое вмешательство, лучевую терапию и комбинированную химиотерапию, в то время как генотерапия предвещает новую эру в области лечения рака. Современные стратегии лечения рака включают суицидную генотерапию, генотерапию онколитическими вирусами, активацию генов-супрессоров опухоли, ингибирование активации онкогенов, подходы, направленные против ангиогенеза, иммунотерапию, лечение, направленное на микроокружение опухоли, а также терапевтические противораковые вакцины [168-171] (рис. 4).



figure 4 Strategies for tumor gene therapy. GM-CSF: Granulocyte–macrophage colony-stimulating factor; CAR-T: Chimeric antigen receptor T-cell; NK: Natural killer cell. Created with BioRender.com

В суицидальной генотерапии носитель кодирует специфический фермент, способный активировать препарат-предшественник, который затем доставляется в опухолевые клетки. Пациент получает химиотерапевтический препарат в виде его предшественника, что побуждает процессы транскрипции и трансляции внутри клетки к выработке фермента, необходимого для активации. Таким образом, этот механизм эффективно уничтожает злокачественные клетки [172]. На сегодняшний день система тимидин-киназа/ганцикловир вируса простого герпеса (HSV-TK/GCV) является наиболее широко используемой системой суицидальной генотерапии [173].

Гены-супрессоры опухолей, включая Rb1 (первый противораковый ген, идентифицированный в ретинобластоме), P53, MLH1, APC, MLH1, BRCA и т. д., связаны с развитием различных видов рака из-за механизмов их инактивации, включающих посттранскрипционные модификации [174]. Первый одобренный препарат для генотерапии, Gendicine [175], представляет собой инъекцию рекомбинантного человеческого P53 аденовируса типа 5. Он вводит терапевтический ген P53 в клетки-мишени и экспрессирует в них ген-супрессор опухоли P53, тем самым усиливая механизм подавления рака в организме для эффективного уничтожения опухолей. Этот метод лечения одобрен для лечения опухолей головы и шеи.

Онколитические вирусы, как природные, так и модифицированные, обладают способностью избирательно заражать и уничтожать опухолевые клетки, не повреждая при этом нормальные клетки. Среди них широко изучены аденовирусы и HSV. Механизмы, с помощью которых онколитические вирусы уничтожают опухолевые клетки, включают прямой лизис инфицированных клеток, индукцию повреждающих молекулярных паттернов и патоген-ассоциированных молекулярных паттернов для запуска иммунных реакций в организме [176]. Кроме того, разработанные онколитические вирусы могут быть снабжены такими трансгенами, как гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) [177], интерлейкин-12 (IL-12) и коэкспрессия декорина [178], ко-экспрессия CD40L и 4-1BBL [179], цитозиндезаминаза [180] и фактор некроза опухоли-альфа (TNF альфа) [181] для повышения их эффективности в уничтожении опухолей. Одобренный в 2005 году препарат Oncorine является первым онколитическим вирусным препаратом, представляющим собой рекомбинантный аденовирус типа 5 для инъекций, разработанный для лечения рака носоглотки [182]. Imlygic, первый онколитический вирусный препарат, одобренный Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США, представляет собой ослабленный вирус простого герпеса 1-го типа (HSV1), генетически модифицированный для избирательной репликации в опухолевых клетках и экспрессии иммуностимулирующего белка M-CSF для терапии меланомы [183].

Терапевтические противораковые вакцины, нацеленные на неоантигены, представляют собой перспективный путь для персонализированного лечения рака. Большинство онкологических больных являются носителями различных мутированных антигенов, которые могут возникать в результате однонуклеотидных мутаций, инсерций, слияний генов или изменений сплайсинга. Эти мутации приводят к появлению неоантигенных эпитопов, которые распознаются Т-клетками и вызывают мощный противоопухолевый иммунный ответ, приводящий к уничтожению опухолевых клеток. Эти антигены могут существовать как единичные образования или как комбинации нескольких антигенных участков, и они могут быть общими для различных типов опухолей [184]. В настоящее время, несмотря на то, что терапевтические противораковые вакцины предлагаются уже давно, большинство из них по-прежнему находятся на стадии доклинических или клинических испытаний, что свидетельствует о том, что до их клинического применения предстоит пройти значительный путь. Например, Ugur Sahin с коллегами разработали РНК-вакцину на основе липидных наночастиц, кодирующую четыре часто встречающихся опухолеассоциированных антигена (NY-ESO-1, MAGE-A3, тирозиназу, TPTE) для лечения меланомы. В ходе испытания I фазы исследователи представили предварительные данные, подтверждающие целесообразность применения этой вакцины [185].

После того как в августе 2017 года была одобрена первая клеточная иммунотерапия на основе CAR - Kymriah, в лечении рака наступила новая эра [186]. Впоследствии в области генной модификации в сочетании с клеточной иммунотерапией наблюдался стремительный прогресс. Традиционные CAR, как правило, состоят из четырех отдельных структурных областей: 1. Домен связывания с мишенью, например одноцепочечный вариабельный фрагмент (scFv), отвечающий за специфичность распознавания; 2. Шарнирная область, обеспечивающая гибкость и правильную ориентацию конструкции CAR; 3. Трансмембранный домен, позволяющий закрепить CAR на клеточной мембране; и 4. Внутриклеточные сигнальные домены, включающие костимуляторные молекулы и сигнальные мотивы CD3. В настоящее время появилось пятое поколение CAR, в котором основное внимание уделяется усилению внутриклеточных сигнальных областей для повышения активации и цитотоксичности иммунных клеток [187]. Кроме того, в настоящее время разрабатываются различные итерации CAR, включая Bivalent CAR, LINK CAR, Stealth CAR, SNIP CAR и другие [187]. Первоначальная модификация иммунных клеток была сосредоточена на Т-клетках, однако в последнее время в сферу клеточной иммунотерапии включаются и другие типы иммунных клеток, такие как NK-клетки и макрофаги [188]. В лечении гематологических злокачественных опухолей произошел значительный прогресс, которого добилась CAR-T-терапия. Одобренные в настоящее время CAR-T-продукты в основном нацелены на CD19 и BCMA. Согласно анализу данных о долгосрочном терапевтическом эффекте, препараты, направленные на CD19, демонстрируют частоту объективной ремиссии от 44 до 91 % у пациентов с рецидивирующей или рефрактерной В-клеточной лимфомой или хроническим лимфоцитарным лейкозом, а частоту полной ремиссии - от 28 до 68 % (время наблюдения = 24 месяца, временной диапазон: 24-123 месяца). В случае пациентов с острым лимфобластным лейкозом В частота первичной ремиссии составляет от 62 до 86 % (время наблюдения = 1 год, временной диапазон: 1-4,8 года). Имеются ограниченные данные о терапии, направленной на BCMA, у пациентов с рецидивом или рефрактерной множественной миеломой; однако сообщается, что частота общего ответа составляет от 73 до 100 %, а частота полной ремиссии или строгой полной ремиссии - от 33 до 83 % (время наблюдения = 1 год, временной диапазон: 13-48 месяцев) [189]. В настоящее время CAR-T-терапия солидных опухолей еще не получила одобрения на рынке и все еще находится на стадии клинических испытаний. Разрабатываемые мишени, основанные на высокой экспрессии антигенов в различных типах опухолевых клеток, включают HER2, IL-13Ra2, GD2, ROR1, EGFR, CEA, Claudin-18, MUC1 и другие. Идентификация специфических опухолевых антигенов представляет собой серьезную проблему для CAR-терапии в контексте солидных опухолей [190]. Кроме того, эффективная доставка и инфильтрация CAR в опухолевое микроокружение остаются серьезными препятствиями, которые необходимо преодолеть. Кроме того, предотвращение побега опухолевых клеток и смягчение иммуносупрессивных эффектов, оказываемых опухолевым микроокружением, представляют собой дополнительные проблемы [191].

Технологии CRISPR предлагают потенциальные ex vivo терапии для лечения рака человека путем создания клеточных иммунотерапий. Например, Т-клетки могут быть модифицированы с помощью CRISPR-Cas9 gRNA-опосредованного нокаута для специфической мишени PD1 или сопутствующей мишени Т-клеточного рецептора, инактивации иммуносупрессивных факторов и/или интеграции элементов CAR в константный локус α-цепи Т-клеточного рецептора для инженерии CAR Т-клеток. Эти стратегии уже прошли клинические испытания. Однако in vivo CRISPR-терапия все еще находится на доклинических стадиях из-за таких проблем, как эффективная и селективная доставка и редактирование [192].

Диабет традиционно классифицируется на два типа: диабет 1-го типа (T1D) и диабет 2-го типа (T2D). Т1D характеризуется аутоиммунным разрушением инсулинпродуцирующих бета-клеток в островках поджелудочной железы, в то время как Т2D характеризуется клеточной резистентностью к инсулину, что приводит к относительной инсулиновой недостаточности. В последние годы было признано, что и Т1D, и Т2D имеют общий механизм, лежащий в основе заболевания и связанный с функциональным нарушением бета-клеток, однако эти механизмы различаются между двумя типами. В первом случае в разрушение бета-клеток на ранних стадиях вовлекаются иммуноопосредованные пути, а во втором - метаболические пути, при этом последующая гибель клеток происходит на более поздних стадиях [193]. За последнее десятилетие с помощью GWAS было выявлено более 75 генетических сигналов, ассоциированных с Т1D, включая вариации аллелей HLA [194]. Кроме того, было выявлено более 400 генов, связанных с Т2D, таких как AP3S2, GRB14 и TCF7L2 [195-198]. В настоящее время генотерапия диабета находится на стадии зарождения.

Пластичность островковых клеток поджелудочной железы была продемонстрирована результатами исследований. Исследования, проведенные Taka-aki Matsuoka и коллегами, показали, что Pdx1 может индуцировать дифференцировку нейрогенин-3-позитивных эндокринных клеток предшественников в инсулин-положительные клетки, а также трансдифференцировать глюкагон-положительные популяции клеток в β-клетки. Кроме того, Mafa может повышать функциональность Pdx1 в этом процессе, открывая многообещающие перспективы для лечения диабета [199]. Впоследствии Xiangwei Xiao и соавторы использовали AAV для доставки Pdx1/MafA, успешно перепрограммируя α-клетки в β-клетки у мышей и эффективно нормализуя уровень сахара в крови у мышей на модели диабета [200, 201]. Основываясь на этих достижениях, компания Genprex в настоящее время изучает терапевтический потенциал GPX-002 (AAV-Pdx1/MafA) для лечения Т1D. По состоянию на 14 ноября 2023 года, согласно сообщению на официальном сайте, это исследование находится на доклинической стадии [202].

Терапия стволовыми клетками продемонстрировала успехи в области лечения диабета, примером чего является препарат VX-880. Однако эффективность терапии стволовыми клетками может быть затруднена из-за отторжения трансплантата у реципиентов. VCTX210 объединяет терапию стволовыми клетками с технологией редактирования генов CRISPR-Cas9 для модификации стволовых клеток, в результате чего нарушаются или внедряются гены, связанные с иммунным отторжением (B2M, PD-L1, HLA-E) для достижения иммунного уклонения. В настоящее время VCTX210 проходит фазу 1 клинических испытаний, и его введение первому пациенту уже завершено [203]. Другой исследуемый препарат GARV-AAV2-A20, находящийся в стадии изучения, нацелен на разные гены [204]. Ген TNFAIP3 кодирует убиквитин-редуцирующий фермент A20, который модулирует активацию иммунных клеток путем повышения порога сигналов NF-κB. Избыточная экспрессия A20 эффективно снижает уровень медиаторов воспаления, тем самым защищая островковые трансплантаты от воспалительных атак [205]. В настоящее время эти препараты все еще находятся на стадии зарождения, однако в течение следующего десятилетия они обладают огромным потенциалом для революции в лечении диабета.

По генетическим признакам ожирение можно разделить на полигенное, моногенное и синдром ожирения, причем полигенное ожирение является наиболее распространенной формой. На развитие полигенного ожирения влияет сочетание полигенных факторов и факторов окружающей среды. Редкое моногенное ожирение в основном связано с дефектами генов, относящихся к лептин-меланокортиновому пути, таких как ген LEP, кодирующий лептин, ген LEPR, кодирующий лептиновые рецепторы, и SH2B1. SH2B1 кодирует важный адаптерный белок SH2B 1, который играет решающую роль в опосредовании лептин-индуцированной сигнальной трансдукции [206]. Генотерапия для лечения ожирения все еще находится на ранней стадии.

У млекопитающих существует два различных типа жировой ткани: белая жировая ткань (WAT) и бурая жировая ткань (BAT). В то время как WAT в первую очередь накапливает избыток топлива, BAT экспрессирует уникальный белок 1 (UCP1) и обладает свойством рассеивать энергию. Поэтому активация BAT может увеличить расход энергии и стать потенциальной целевой стратегией для лечения ожирения. Chih-Hao Wang и его коллеги использовали систему CRISPR-SAM для активации экспрессии UCP1 в белых жировых клетках, способствуя трансформации WAT в BAT, что привело к значительному терапевтическому эффекту в мышиной модели. Система CRISPR-SAM продемонстрировала свою способность активировать экспрессию эндогенных генов [207]. Ruhang Tang и др. использовали адено-ассоциированный вирус серотипа 9 (AAV9) в качестве вектора для доставки гена FST и наблюдали его профилактическую эффективность против ожирения, вызванного высокожировой диетой [208]. Кроме того, в недавнем крупномасштабном исследовании по секвенированию экзома генома с участием 645 626 человек было выявлено, что GPR75 значительно ассоциирован с более низким индексом массы тела. Последующие исследования с использованием мышей с нокаутом гена GPR75 продемонстрировали устойчивость к ожирению [209]. Таким образом, направленное снижение экспрессии GPR75 может стать потенциальной терапевтической стратегией для борьбы с ожирением.

Ревматоидный артрит (RA) - аутоиммунное заболевание, характеризующееся симметричным, полиартикулярным воспалением мелких суставов. Патогенез RA остается неясным, и он может поражать множество систем органов [210]. Основными механизмами являются аутоиммунные реакции и воспаление, охватывающие различные сигнальные пути, такие как JAK-STAT, MAPK, PI3K-AKT, Wnt, Notch и NF-κB сигнальные пути. Кроме того, эпигенетические модификации также играют решающую роль в возникновении и прогрессировании RA. Понимание этих молекулярных механизмов открывает множество мишеней для разработки лекарств, включая создание различных ингибиторов малых молекул, таких как Ruxolitinib, ингибитор JAK1/2, VX-702, ингибитор p38 MAPK, и SHR0302, исключительно избирательный ингибитор JAK1 [211]. В отличие от этих низкомолекулярных препаратов, генотерапия RA в настоящее время находится на начальной доклинической стадии. Haobo Han и др. разработали фторированный полиамидоаминовый дендримерный носитель, который может быть направлен на воспаленные суставы путем внутривенной инъекции для доставки miR-23b, не-кодирующего олигонуклеотида, регулирующего экспрессию генов на посттранскрипционном уровне. Модулируя путь NF-κB в пролиферирующем синовии, miR-23b способствует противовоспалительному и антипролиферативному ответу [212]. Кроме того, Fang Wang и др. использовали AAV-носитель для совместной доставки TNFR-Fc/CTLA4-FasL (AAV-TFCF), что представляет собой еще одну перспективную стратегию генотерапии [213]. Однонуклеотидные полиморфизмы (SNPs) не-рецепторов тирозинфосфатазы протеина 2 и 22 типов (PTPN2/22), в частности PTPN2:rs478582 и PTPN22:rs2476601, могут быть связаны с гипериммунным ответом и обострением воспаления у больных RA. Эти SNP могут служить потенциальными терапевтическими мишенями для лечения RA [214]. Кроме того, гены MYC и FOXO1, SNP rs6927172, TNFAIP3, ген OLIG3 и miR-155 были определены как перспективные гены-кандидаты для CRISPR-Cas9 терапии [215].

Остеоартрит (ОА) - хроническое и прогрессирующее заболевание, характеризующееся дегенерацией суставного хряща, клинически проявляющееся болью и скованностью в суставах. Несмотря на распространенность этого заболевания среди более чем 500 миллионов человек, эффективные методы лечения ОА в настоящее время отсутствуют [216, 217]. В настоящее время активно изучаются возможности генотерапии ОА. Follistatin (FST) функционирует как мощный ингибитор мышечного роста и активин-связывающий белок [218]. В своем исследовании Tang и др. использовали AAV9-опосредованную доставку гена FST для уменьшения воспалительных факторов в синовиальной жидкости сустава, что позволяет предположить, что этот путь может иметь терапевтический потенциал для лечения ОА, вызванного травмой [208].

Клиническое испытание NCT05835895 - это исследование фазы 1b, направленное на изучение безопасности, переносимости и эффективности генотерапии GNSC-001. GNSC-001 - это препарат генотерапии на основе AAV, который несет в себе ген, кодирующий антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1Ra). При внутрисуставном введении он трансдуцирует клетки на выработку IL-1Ra, оказывая противовоспалительное и защитное действие на суставы для лечения ОА. В настоящее время это исследование находится на стадии набора с 12 июня 2023 года, а его завершение ожидается в 2028 году. В этом исследовании [219] Zhao Lan и др. продемонстрировали, что CRISPR-опосредованная делеция генов фактора роста нервов (NGF), матриксной металлопротеиназы 13 (MMP13) и IL-1 beta в мышиной модели посттравматического ОА сохраняет обезболивание суставов и их структуру. Использование редактирования генов на основе CRISPR/Cas9 представляет собой перспективный терапевтический подход к лечению ОА.

Системная красная волчанка (SLE) характеризуется опосредованным аутоиммунным ответом воспалением и повреждением органов, поражающим преимущественно молодых женщин. Учитывая ключевую роль В-клеток в распознавании самоантигенов в процессе патогенеза заболевания, терапия ген-инженерно измененными иммунными клетками недавно стала перспективным подходом к лечению SLE [220]. В исследование, проведенное Andreas Mackensen и др., была включена когорта из 5 пациентов с SLE, не реагировавших на ряд иммуносупрессивных препаратов. Для трансдукции полученных от пациентов Т-клеток с анти-CD19 CAR использовались лентивирусные векторы. После предварительного истощения лимфоцитов модифицированные Т-клетки возвращали пациентам в дозе 1 х 10⁶ CAR Т-клеток на килограмм массы тела. В течение среднего периода наблюдения (8 месяцев) была достигнута устойчивая ремиссия без медикаментозного лечения [120]. Эти результаты подчеркивают потенциальную возможность применения генно-инженерной клеточной иммунотерапии при аутоиммунных заболеваниях наряду с ее хорошо известной терапевтической эффективностью при лечении рака. В настоящее время в рамках многочисленных клинических испытаний изучаются потенциальные методы лечения пациентов с рецидивирующей рефрактерной SLE. Эти испытания включают CAR-NK-терапию, направленную на CD19 (NCT06010472), CAR-T-терапию, направленную как на CD19, так и на BCMA (NCT05858684, NCT05474885), а также CAR-T-терапию, направленную конкретно на CD19 (NCT06056921).

За последнее десятилетие в области генотерапии, особенно при моногенных заболеваниях и гематологических злокачественных опухолях, были достигнуты значительные успехи: одобрено множество терапевтических препаратов. Одновременно появились многообещающие перспективы для немоногенных или сложных заболеваний. Используя комплексные полногеномные ассоциативные исследования, менделевский рандомизированный анализ, одноклеточное секвенирование генома, исследования генетических ассоциаций, методы машинного обучения на основе искусственного интеллекта и другие методики, мы постепенно раскрываем патогенетические механизмы сложных заболеваний [221-224]. Такой подход позволяет эффективно выявлять патогенные гены, участвующие в мультигенных нарушениях, и предлагает новые терапевтические мишени для лечения сложных заболеваний. Одновременно прогресс в области генно-инженерных технологий позволяет нам вмешиваться в болезни на уровне ДНК или РНК, дополняя мишени, которые недоступны для обычных лекарств. Кроме того, разработка препаратов для генотерапии зависит от носителей, обладающих высокой эффективностью, надежной специфичностью, низкой иммуногенностью, мощной загрузочной способностью и длительным действием. Разработка таких носителей, как вирусных, так и не-вирусных, является обязательной. Например, в генотерапии in vivo широко используются носители AAV, которые могут быть оптимизированы и модифицированы для приобретения исключительных терапевтических свойств с помощью таких подходов, как природные изоляты, направленная эволюция и дизайн с помощью искусственного интеллекта [225, 226]. Для моногенных заболеваний конечной целью является достижение долгосрочного или даже пожизненного излечения, поскольку симптомы этих заболеваний обычно проявляются с рождения. Напротив, полигенные и сложные заболевания, как правило, проявляются на более поздних этапах жизни. Следовательно, наше внимание должно быть сосредоточено не только на лечении клинических проявлений, но и на раннем выявлении восприимчивых популяций с целью генной профилактики и терапии.

Генотерапия открывает большие перспективы в качестве метода лечения, особенно в области моногенных заболеваний и опухолей. Однако с развитием нашего понимания патогенеза заболеваний генная терапия теперь применяется для лечения полигенных заболеваний. Более того, учитывая, что большинство полигенных расстройств проявляются в более позднем возрасте (симптомы не проявляются при рождении), становится необходимым выявлять предрасположенных к ним людей для генетической профилактики до появления симптомов. Эра генотерапии наступила.