Клеточная и генотерапия, как следующая веха в борьбе с болезнями, преобразует область медицины, предлагая пациентам целевые и персонализированные методы лечения, недостижимые для обычной фармацевтики.^1-3 На сегодняшний день на рынке уже представлены клетки схимерным антигенным рецептором Т (CAR T) для лечения рака крови,^4-6 генно-инженерные гемопоэтические стволовые клетки для лечения гематологических заболеваний^7,8 и генотерапия для лечения ряда редких заболеваний, включая наследственную дистрофию сетчатки и спинальную мышечную атрофию (SMA)^9-12. Исследования и разработки продолжают развиваться быстрыми темпами, и все больше новых методов лечения находятся в стадии клинической разработки. Однако, переходя к следующему этапу, необходимо решить серьезные проблемы. Для клеточных и генных терапий, обеспечивающих безопасность и эффективность, решающее значение имеет точная регулировка уровня активности терапевтических клеток или генов путем контроля дозировки, времени и локализации активных веществ.¹³ Однако в настоящее время чрезмерная активность терапевтических клеток и вне-целевые эффекты в генных терапиях все еще являются серьезными препятствиями, которые необходимо преодолеть. Неконтролируемая активность CAR T-клеток может привести к развитию синдрома выброса цитокинов (CRS) и нейротоксичности, когда вводимые CAR T-клетки становятся чрезмерно активными, вызывая серьезные или даже опасные для жизни побочные эффекты.^14,15 В то время как генотерапия, включающая введение генетических материалов в клетки пациентов, может нарушить функцию или регуляцию не-целевых генов, что приведет к серьезным последствиям. Как интригующая и быстро развивающаяся область, синтетическая биология предлагает новые решения для устранения этих проблем.^13,16,17 Новые синтетические рецепторные платформы стали мощными инструментами для точного контроля функций сконструированных клеток.^18,19 Они могут применяться для тонкой настройки терапевтической деятельности, например, для регулировки производства дозированных биологически активных веществ путем восприятия и обработки определенных пользователем сигналов или биомаркеров.¹³ Слияние синтетической биологии с терапевтическими стратегиями может существенно ускорить развитие клеточной и генной терапии до следующего поколения.

Рецепторы позволяют клеткам своевременно ощущать и реагировать на внешние (внеклеточные) и внутренние (внутриклеточные) стимулы в сложной окружающей среде. Основываясь на глубоком изучении различных природных рецепторов в течение последних десятилетий, синтетические биологи смогли деконструировать и реконструировать рецепторы, а также рационально конструировать синтетические рецепторы. Функциональный синтетический рецептор состоит как минимум из двух доменов: сенсорного домена для специфического связывания с входными сигналами и исполнительного домена для преобразования активности сенсора в выходные сигналы.²⁰ Синтетические рецепторы могут быть созданы с использованием природных и/или искусственных по происхождению компонентов,²⁰ что наделяет клетки (называемые "дизайнерскими клетками") индивидуальными функциональными возможностями путем перестройки клеточных отношений "вход-выход".^20,21 На рисунке 1 представлена хронология ключевых открытий в области исследования синтетических рецепторов.



figure 1 Landmark research achievements of the synthetic receptor over the past three decades. A timeline is shown with brief summaries of some of the key research milestones in the synthetic receptor field published in the past 30 years. CAR chimeric antigen receptor, RASSL receptor activated solely by a synthetic ligand, DREADD designer receptors exclusively activated by designer drug, TRUCK T-cells redirected towards universal cytokine killing, TEVp tobacco etch virus protease, synTF synthetic transcription factor, MESA modular extracellular sensor architecture, synNotch synthetic Notch, FDA the U.S. Food and Drug Administration, dCas9-synR dCas9 synthetic receptor, GPCR G protein-coupled receptor, iTango inducible Tango, Cal-Light calcium- and light-gated switch, FLARE fast light- and activity-regulated expression, SPARK specific protein associated tool giving transcriptional readout with rapid kinetics, SUPRA CAR split, universal and programmable CAR, RASER rewiring of aberrant signaling to effector release, LOCKR latching orthogonal cage-key protein, SPOC split-protease-cleavage orthogonal-coiled coil-based logic circuit, GEMS generalized extracellular molecule sensor, CHOMP circuits of hacked orthogonal modular protease, esNotch enhanced synNotch, TMD transmembrane domain, GEAR generalized engineered activation receptor, TCS two component system, POST phosphoregulated orthogonal signal transduction system, SNIPR synthetic intramembrane proteolysis receptor, AMBER advanced modular bispecific extracellular receptor, OCAR orthogonal chemically activated cell-surface receptor, DocTAR double-cut transcription activation receptor

Вооруженные синтетическими рецепторами, клетки-конструкторы запрограммированы реагировать на множество сигналов, обеспечивая пространственно-временную сигнализацию и последующий контроль поведения¹³ (рис. 2а). В дизайнерской клетке есть три модуля: модуль восприятия, модуль обработки и модуль реагирования.^13,22,23 Модуль восприятия включает, но не ограничивается различными рецепторами, которые могут обнаруживать различные сигналы окружающей среды, после чего происходит передача сигнала по нижележащим путям.^13,22,23 Модуль обработки состоит из перестроенных эндогенных сигнальных путей и ортогональных синтетических генетических цепей, которые могут обрабатывать сигналы от множества рецепторов.^13,22,23 Модуль ответа - это компоненты, генерирующие измеримые выходные сигналы, поэтому они используют изменения, определяемые пользователем (например, терапевтические эффекты)^13,22,23 (рис. 2а).



figure 2 Programming cell and gene therapies using synthetic receptors. a Mammalian cells can be designed and engineered to sense and respond to a variety of stimuli such as chemicals and disease biomarkers, and subsequently trigger downstream signaling pathways, which can finetune customized therapeutic effects (e.g., gene expression, protein activity and secretion, etc.).13,22 b Engineering CAR T cell therapy.68,96 T cells are genetically engineered to express specific CAR proteins on their surface. When infused back into the body, CARs interact with the targeted antigens on cancer cells, causing the activation of CAR T cells for cancer-killing. PCMV cytomegalovirus promoter, scFv single-chain fragment variant, TMD transmembrane domain, CD costimulatory domain, CD3? CD3 zeta signaling domain, pA poly(A) signal. c Synthetic receptor applications in CAR T cell therapy.25,67 T cells can be engineered with a combination of CARs and synthetic receptors like synNotch for a more precise tumor recognition to reduce off-target toxicity. Synthetic receptors like MESA could also be used in combination with CAR to sense a soluble biomarker. In addition to driving CAR expression, synthetic receptors are also able to express additional beneficial payloads alongside the CAR, such as cytokines, chemokines, enzymes, single-chain fragment variants (scFvs), mono-antibodies (mAbs), ligands or receptors. TF transcription factor, SynP synthetic promoter, Prom promoter, synR synthetic receptor, pA poly(A) signal. d Therapeutic cell engineering.18,19 By incorporating synthetic receptors, therapeutic cells are designed to act as ‘smart drugs’ that can sense disease biomarkers or user-defined inputs, and trigger a therapeutic response, such as the release of a drug or a therapeutic protein. These engineered cells present clinical potentials as they were encapsulated and implanted in mouse to treat diseases in proof-of-concept studies.213,214 STAT3, signal transducer and activator of transcription 3; P, phosphorylation; shGLP-1, synthetic human glucagon-like peptide 1. e Rewiring of aberrant signaling to effector release (RASER).27,28 In RASER, a hepatitis C virus protease (HCVp) and an effector protein (e.g., OFP-Bid) are fused to two different domains that can sense overactive ErbB signaling. When ErbB activity is detected, the two domains are co-recruited together, causing HCVp to cleave and activate OFP-Bid. This leads to the induction of apoptosis specifically in ErbB hyperactive cancer cells, sparing normal cells. The compact size of RASER construct makes it suitable for AAV-delivered gene therapy. PCMV cytomegalovirus promoter, TMD transmembrane domain, SH2 Src homology 2 domain, CS cleavage site, Bid BH3 interacting domain death agonist, OFP orange fluorescent protein, P2A 2A peptide derived from porcine teschovirus-1, PTB phosphotyrosine-binding domain; NS3, hepatitis C virus nonstructural protein 3, pA poly(A) signal. f Engineering multicellular behaviors with synthetic receptor systems.33,34 (Left) To construct a three-layer structure, two separate cell lines are constructed using synNotch systems.31,32 CD19 ligands on the A-type cells can activate anti-CD19 synNotch receptors on the B-type cells, which induces the expression of Ecadhi (E-cadherin, high expression) and GFPlig (surface-bound GFP) in the B-type cells. Subsequently, these cells will form a two-layer structure with a green core and blue outer layer. Then, GFPlig on the B-type cells can send reciprocal signals to the A-type cells via anti-GFP synNotch, leading to the activation of Ecadlo (E-cadherin, low expression) and mCherry, which will induce the stepwise formation of the three-layer structure. (Right, Upper) Synthetic diffusive morphogen systems can be engineered using synNotch.35 In these systems, soluble ligands can form an artificial morphogen gradient and activate synthetic receptors on receiver cells. The gradient patterns can be tuned by modulating the expression level of synthetic morphogens (e.g., soluble GFP). The synNotch-based synthetic morphogen systems require an extra anchor protein to be expressed on the hybrid anchor/receiver cells (as shown here) or solely on the anchor cells. (Right, Lower) Another possible synthetic diffusive morphogen system using the synthetic receptor, such as MESA. In this supposed system, soluble ligands induce the dimerization of synthetic receptors, activating downstream gene transcription. GFP green fluorescent protein, mCherry a red fluorescent protein, BFP blue fluorescent protein, CD19 cluster of differentiation 19

В последние годы модульные синтетические рецепторы постоянно совершенствуются и развиваются для применения в биомедицине. В качестве примера можно привести CAR - синтетические рецепторы, способные взаимодействовать с клетками-мишенями с высокой специфичностью. CAR T-клеточные терапии (рис. 2b) в настоящее время являются фармацевтическими препаратами, одобренными на рынке²⁴ , что убедительно продемонстрировало огромный потенциал синтетических рецепторов для применения в терапии. Другим широко используемым синтетическим рецептором является синтетический Notch (synNotch), который способен условно управлять экспрессией CAR, а также дополнительной полезной нагрузки в сконструированных Т-клетках при нацеливании на вторичный антиген^25,26 (рис. 2c). Кроме того, синтетические рецепторы были использованы для создания терапевтических клеток, которые могут воспринимать произвольные входные сигналы, такие как небольшие молекулы и биомаркеры, связанные с заболеванием, и выделять терапевтические молекулы в ответ на животных моделях^19,23 (рис. 2d). Кроме того, синтетические рецепторы компактных размеров (например, RASER (rewiring of aberrant signaling to effector release), как показано на рис. 2e) могут быть непосредственно доставлены в рамках целевой генотерапии с помощью вектора AAV для лечения ErbB-гиперактивных раковых опухолей^27,28.

Помимо биомедицинских применений, синтетические рецепторы широко используются в фундаментальных исследованиях.²⁹ Они являются мощными инструментами для контролируемого и точного изучения различных аспектов клеточной сигнализации и поведения, включая клеточную дифференциацию, миграцию и морфогенез.³⁰ Например, исследователи использовали рецепторы synNotch для программирования сконструированных клеток на самоорганизацию в многоклеточные структуры в ответ на юкстакриновый сигнал^31-34 (рис. 2f). В то же время синтетические рецепторы могут быть разработаны как часть синтетических ортогональных морфогенных систем для создания трехмерных (3D) тканей в строго контролируемой манере^34,35 (рис. 2f).

Синтетические рецепторы млекопитающих можно классифицировать по различным критериям. В этом разделе мы приводим обзор различных доступных синтетических рецепторов, классифицированных по четырем различным принципам. Сводная информация о классифицированных синтетических рецепторах представлена в таблице 1, а их сравнительные преимущества и ограничения обсуждаются далее.

Table 1 Comprehensive overview of mammalian synthetic receptor systems

В зависимости от места связывания лигандов синтетические рецепторы можно разделить на рецепторы клеточной поверхности (также известные как трансмембранные рецепторы) и внутриклеточные рецепторы³⁶.

Клеточно-поверхностные рецепторы обычно включают три типа трансмембранных рецепторов (т.е. рецепторы, связанные с ферментами, рецепторы, связанные с G-белками, и рецепторы, связанные с ионными каналами), которые охватывают плазматическую мембрану и преобразуют внеклеточные сигналы во внутриклеточные.^37,38 Для этой категории каждый синтетический рецептор содержит внеклеточный лиганд-связывающий домен, по крайней мере один трансмембранный домен и внутриклеточный эффекторный домен. Помимо наиболее известных CAR,^24,39 synNotch,^31,40,41 SNIPR (синтетический внутримембранный рецептор протеолиза),⁴² RASSL (рецептор, активируемый исключительно синтетическим лигандом),^43,44 Tango,^45,46 MESA (модульная внеклеточная сенсорная архитектура), ^47,48 ChaCha,⁴⁹ TCS (двухкомпонентная система)⁵⁰, химерный цитокиновый рецептор^51,52 и GEMS (обобщенный внеклеточный сенсор молекул)⁵³ также относятся к категории рецепторов клеточной поверхности (табл. 1). Этот тип синтетических рецепторов способен воспринимать только внешние сигналы, что делает их пригодными для обнаружения клеточных (например, CAR, synNotch и SNIPR) и системных биомаркеров заболеваний (например, MESA и GMES).

Внутриклеточные рецепторы могут располагаться в цитоплазме или ядре, либо быть прикрепленными к внутриклеточной мембране клетки. Cal-Light (кальциевый и светозависимый переключатель)⁵⁴ , CHOMP (цепи взломанных ортогональных модульных протеаз)⁵⁵, внутрителесный сенсор⁵⁶ , RASER (переподключение аберрантной сигнализации к эффекторному высвобождению)²⁷ , LOCKR (защелкивающиеся ортогональные ключевые белки),^57,58 COMET (композитные элементы транскрипции млекопитающих)⁵⁹ и POST (фосфорегуляторная ортогональная передача сигнала)⁶⁰ относятся к категории внутриклеточных рецепторов (Таблица 1). Примечательно, что синтетические рецепторы, рассматриваемые здесь, также можно назвать синтетическими белковыми переключателями.⁶¹ Поскольку внутриклеточные рецепторы могут быть активированы только внутриклеточным входом, многие из них (например, LOCKR и COMET) разработаны как переключатели, индуцируемые химическими молекулами, которые могут пересекать плазматическую мембрану.

Активированные рецепторы запускают трансдукцию сигнала по нескольким нисходящим путям. В зависимости от того, какой путь запускается, естественный или искусственный, мы разделяем синтетические рецепторы на рецепторы, основанные на естественных сигналах, и рецепторы, основанные на ортогональных сигналах.

Рецепторы, основанные на естественных сигналах, перестраивают эндогенные сигнальные пути на оригинальные или адаптированные результаты. К этой категории синтетических рецепторов относятся RASSL,^43,44 CAR,^24,39 химерный цитокиновый рецептор,^51,52 GEMS53 и GEAR62 (табл. 1). Они неизбежно активируют нативные пути, чтобы привести в действие выходные сигналы. Среди них RASSL, CAR и химерный цитокиновый рецептор перенаправляют эндогенные пути на определенные пользователем лиганды для выполнения желаемых функций и больше не реагируют на свои исходные лиганды.^18-20 Хотя GEMS и GEAR перехватывают эндогенные пути для генерации дополнительных индивидуальных результатов, они могут одновременно приводить к активации эндогенные транскрипционные сети.^18-20 С другой стороны, способность модулировать транскрипционные сети наделяет природные рецепторы на основе сигналов уникальными преимуществами перед рецепторами на основе ортогональных сигналов, позволяя выполнять естественные и очень сложные программы. Например, CARs были изобретены для имитации функции Т-клеточного рецептора (TCR) с целью достижения противоопухолевой активности⁶³ посредством модуляции эндогенных сигнальных путей, но в то же время при активации CAR могут индуцироваться дополнительные трансгены (например, экспрессия цитокинов под действием ядерного фактора активированных Т-клеток (NFAT)), чего невозможно достичь с помощью ортогональных систем.

В отличие от этого, рецепторы на основе ортогональных сигнализаторов полностью независимы от эндогенных сигнальных путей. Это объясняется использованием ортогональных синтетических транскрипционных факторов (syn-TFs) или ортогональных систем передачи сигнала, поскольку они не могут распознавать эндогенные регуляторные элементы и активировать эндогенные сигнальные каскады, соответственно.^18-20 Тем не менее, некоторые syn-TFs, такие как dCas9-based TFs и TALE-based TFs, могут программировать экспрессию эндогенных генов без необходимости использования дополнительных синтетических промоторов.^18,20 Существующие на сегодняшний день Tango,^45,46 MESA,^47,48 synNotch,^31,40,41 ChaCha,⁴⁹ Cal-Light,⁵⁴ intrabody sensor,⁵⁶ LOCKR^57,58 и COMET⁵⁹ используют syn-TFs для построения ортогональных сигнальных путей, а TCS⁵⁰ и POST⁶⁰ используют ортогональные сигнальные системы, полученные от прокариот (табл. 1).

Следует отметить, что наиболее широко используемые ортогональные TFs имеют нечеловеческое происхождение (например, дрожжи и бактерии), а значит, несут высокий риск иммуногенности при клиническом применении. Использование гуманизированных syn-TFs включающих как ДНК-связывающий домен, так и активационный домен, полученные из человеческих TFs, в значительной степени снизит иммуногенный риск. Однако эти слитые TFs все еще способны активировать эндогенную сигнализацию, что снижает их ортогональность. Примечательно, что Khalil с коллегами de novo разработали панель полностью гуманизированных синтетических регуляторов транскрипции на основе цинковых пальцев (synZiFTRs), сконструированных на основе массива доменов цинковых пальцев, которые могут специфически распознавать свои когнитивные короткие ДНК-связывающие мотивы, достигая геномной ортогональной специфичности.⁶⁴ Подобная новаторская работа ускорит прогресс гуманизации рецепторов на основе ортогональных сигналов, что имеет решающее значение для преодоления трансляционного разрыва до клиники.

Синтетические рецепторы могут связываться с целым рядом растворимых и поверхностно-связанных лигандов с высокой специфичностью и чувствительностью. В соответствии с особенностями лигандов, соответствующие синтетические рецепторы можно разделить на растворимые лиганд-связывающие рецепторы и поверхностные лиганд-связывающие рецепторы.^18,21

Большое количество лигандов находится в растворимой форме, включая большинство химических молекул, гормоны, цитокины, факторы роста, внутриклеточные растворимые белки и некоторые пептиды, расщепленные из мембранных белков (например, карцино-эмбриональный антиген (CEA)⁶⁵ и амилоид-бета (Aβ)⁶⁶). Перечисленные выше растворимые молекулы могут вызывать активацию растворимых лиганд-связывающих рецепторов, таких как Tango,^45,46 ChaCha,⁴⁹ MESA,^47,48 химерный цитокиновый рецептор,^51,52 CHOMP,⁵⁵ GEMS⁵³ LOCKR^57,58 и POST⁶⁰ (табл. 1). С помощью небольших химических молекул, способных пересекать плазматическую мембрану, было разработано несколько внутриклеточных синтетических рецепторов (например, POST, CHOMP и LOCKR).²⁰ Между тем, они также могут выступать в качестве внеклеточных лигандов, когда лиганд-связывающий домен рецептора находится вне плазматической мембраны, например, рецепторы клеточной поверхности (например, Tango, ChaCha, MESA и GEMS).²⁰ Пептидные/белковые лиганды в большинстве случаев не могут проникнуть в клетку, поэтому они действуют на рецепторы клеточной поверхности, чтобы впоследствии запустить внутриклеточные сигнальные каскады.

Поверхностно-связанные лиганды, фиксированные на плазматической мембране клеток-отправителей, могут трансактивировать рецепторы клеточной поверхности соседних клеток-получателей.^18,20 CAR и synNotch - типичные поверхностные лиганд-чувствительные рецепторы, которые теоретически не могут быть активированы растворимыми лигандами.^18,20 Различные свойства этих двух типов синтетических рецепторов обусловливают разные механизмы действия. Растворимые лиганд-связывающие рецепторы обычно активируются путем димеризации лиганда для запуска последующей сигнализации, в то время как поверхностным лиганд-связывающим рецепторам для активации последующей сигнализации требуется механическая сила, возникающая при взаимодействии лиганда с рецептором. Поэтому активация растворимых лиганд-связывающих рецепторов (например, химерных цитокиновых рецепторов и GEMS) может быть вызвана лигандами после транспортировки на большое расстояние, тогда как поверхностные лиганд-связывающие рецепторы (CAR и synNotch) могут функционировать только юкстакринным образом.³⁴

За последнее десятилетие было разработано и усовершенствовано большее число синтетических рецепторных систем. В зависимости от того, состоят ли они полностью из модифицируемых компонентов, мы делим синтетические рецепторы на частично модульные и полностью модульные.

Частично модульные рецепторы могут быть созданы путем разработки искусственного сенсорного домена с сохранением оригинального исполнительного домена, или наоборот. Первые синтетические рецепторы могут перестраивать эндогенные сигнальные пути под новые лиганды (например, CAR, химерный цитокиновый рецептор и GEMS), а вторые - активировать альтернативный путь под действием естественных лигандов (например, Tango, ChaCha и dCas-synR)^18-20 (табл. 1). Таким образом, первые синтетические рецепторы можно отнести к рецепторам, основанным на естественных сигналах, а вторые - к рецепторам, основанным на ортогональных сигналах (как обсуждалось выше).

Полностью модульные синтетические рецепторы с сенсорным и исполнительным доменами, включая synNotch,^31,40,41 SNIPRs,⁴² MESA^47,48 и LOCKR,^57,58, могут выполнять новые функции, не нарушая эндогенных путей, ортогональным образом (Таблица 1). Стоит отметить, что "строительный кирпичик" для модульной сборки полностью модульных синтетических рецепторов может быть получен как из уже существующих природных компонентов (например, synNotch, SNIPRs и MESA), так и сконструирован de novo (например, LOCKR)²⁰.

В последние годы создание эволюционных синтетических рецепторов стало возможным благодаря быстрому развитию новых технологий и высокопроизводительных методологий, таких как направленная эволюция, рациональный дизайн и дизайн in silico.⁶⁷ В то же время они делают реализацию классической схемы "дизайн-строительство-тестирование-обучение" (DBTL) в процессе разработки проще, чем когда-либо. Лучшее сочетание передовых технологий и цикла DBTL, несомненно, будет способствовать быстрому прототипированию и оптимизации новых синтетических систем для различных биомедицинских применений. Здесь мы рассказываем о развитии и эволюции четырех наиболее продвинутых однопроходных трансмембранных синтетических рецепторов - CARs (рис. 3а и табл. 1), synNotch (рис. 4а и табл. 1), MESA (рис. 5а и табл. 1) и GEMS (рис. 5б и табл. 1).



figures 3. Design and engineering of the chimeric antigen receptor (CAR). a The architecture of CARs comprises an extracellular sensor domain, a hinge, a transmembrane domain (TMD) and an intracellular signaling domain (actuator domain).330 The extracellular sensor domain, also known as antigen-binding domain, is usually a single-chain variable fragment (scFv) derived from a monoclonal antibody by fusing its light (VL) and heavy (VH)-chain variable domain with a flexible linker peptide. Other proteins like nanobodies, designed ankyrin repeat proteins (DARPins), natural ligands and small peptides can also function as the antigen-targeting moiety.^99,101 The hinge derived from T cell proteins or immunoglobins can function as a flexible linker, providing sufficient conformational freedom to overcome steric hinderance to facilitate the access to the target antigen. T cell protein-derived or de novo designed TMD not only anchors the CAR in the cell membrane but also affects the stability and function of CAR. The intracellular signaling domain generally contains a CD3? signaling domain and CD28/4-1BB costimulatory domains (CDs), which facilitates T cell persistence and activity. Several other costimulatory domains including ICOS, OX-40, CD27, MyD88/CD40 and NKG2D are already underway.^99,101 CAR architectures can be further engineered to express an ‘armor’, which aims to enhance the in vivo persistence and efficacy of CAR T cells. sbL, surface-bound ligand; ITAM, immunoreceptor tyrosine-based activation motif. b First-generation (1 G) CARs only contain a CD3? signaling domain in the intracellular domain (ICD), which outperforms the less popular FceR1? signaling domain. Second-generation (2 G) CARs harbor one CD, and third-generation (3 G) CARs contain more than one CDs in their intracellular signaling domain. Fourth-generation (4 G) CARs are based on 2 G CARs with additional expression of transgenic products (armor), such as cytokines, antibodies, enzymes, ligands or receptors.99 Fifth-generation (5 G) CARs are also based on 2 G CARs with the addition of a cytoplasmic domain derived from cytokine receptors (e.g., IL-2Rβ chain fragment)¹⁵⁴ or synapse formation proteins (e.g., PDZbm scaffolding anchor domain).261 NFAT nuclear factor of activated T cells, IL-12 interleukin 12, IL-2RЯ interleukin 2 receptor beta-chain, JAK Janus kinase, STAT signal transducer and activator of transcription. c Numerous approaches to improve the safety and efficacy of CAR T cell therapy. Tandem CARs using bispecific single-chain variable fragments (scFvs) can operate an OR gate and overcome obstacles caused by tumor heterogeneity and antigen loss.⁷⁹ Dual CAR engaging split CARs can perform AND gate to provide and enhance the specificity through targeting multiple antigens.¹⁶⁵ Switch CARs with ON/OFF switches utilizing small molecule-triggered dimerization or degradation mechanisms can timely control CAR activity and overcome systemic cytokine toxicities of CAR T cells. Switchable CARs are specific to bispecific adaptors, such as folate-FITC, biotinylated antibody, PNE-Fab and Co-LOCKR^96,97,101 and can direct a universal CAR T cell to target distinct antigens. Split, universal and programmable (SUPRA) CARs consist of a set of leucine-zipper universal CARs (zipCARs) and leucine-zipper scFv (zipFv) domains, which specifically bridge the zipCARs to various antigens. The SUPRA CAR system can fine-tune T cell activation and perform combinatorial logic operations (AND, NOT, OR, AND-NOT).^84,85 Inhibitory CARs contain inhibitory domains derived from immune checkpoint proteins (PD-1 or CTLA-4), which are able to reduce off-tumor toxicities of CAR T cells by inhibiting T cell activation upon binding an antigen expressed on non-malignant cells.³³¹ SynNotch CARs employ a co-expressed synNotch receptor to drive the expression of a CAR to achieve AND logic. The synNotch and CAR can target different antigens, resulting in improved specificity and sensitivity of CAR T cell therapy.^40,190 deg degron, INH inhibitory domain, TF transcription factor



figure 4 Design and engineering of the synthetic Notch (synNotch) receptor. a The architecture of synNotch receptors consists of an extracellular sensor domain, a transmembrane Notch core region and an intracellular actuator domain (transcription factors, TFs). In synNotch receptors, the extracellular and intracellular domains (ICDs) can be completely swapped with diverse recognition domains (scFv, nanobody, or peptide tags) and TFs (transcriptional activators or repressors). The core Notch regulatory region comprises the transmembrane domain (TMD) and multiple proteolytic cleavage sites of wild-type Notch. Ligand binding to synNotch leads to the intracellular proteolytic cleavage and release of the membrane-tethered TF to translocate into the nucleus and regulate gene expression.³¹ sbL surface-bound ligand, scFv single-chain fragment variant, JMD juxtamembrane domain. b Evolution of the development of synNotch receptors. (Right, Upper) The modular configuration of prototype synNotch. (Middle, Upper) Enhanced synNotch (esNotch) incorporates an intracellular hydrophobic sequence (QHGQLWF, name as RAM7) derived from native Notch which significantly decreases ligand-independent activation.¹⁹² (Left, Upper) Synthetic intramembrane proteolysis receptors (SNIPRs) are fully humanized transcriptional receptors through systematic modular engineering of the original synNotch.⁴² (Right, Lower) The diffusible synNotch system can detect diffusible ligands anchored by engineered anchor cells, which enables creating a synthetic morphogen signaling system.35 sL soluble ligand. (Middle, Lower) Orthogonal chemically activated cell-surface receptors (OCARs) are engineered by replacing the extracellular sensor domain of synNotch into a chemically induced dimerization (CID) domain, which can achieve small molecule-triggered activation in a cis fashion.¹⁹³ (Left, Lower) In OCAR-synNotch system, one part of cis-acting OCAR is sequestered by synNotch through the incorporation of coiled-coil dimer-forming peptides into them, which prevents small molecule-induced activation of OCAR when synNotch is in an inactive state. Once synNotch is activated by surface-bound ligands, the sequestered OCAR part is liberated and OCARs can be activated by the addition of inducers, which subsequently enhance synNotch signaling193

figure 5 Design and engineering of modular extracellular sensor architecture (MESA) and generalized extracellular molecule sensor (GEMS). a, b The architecture of MESA (a) and GEMS (b) comprises the extracellular sensor domain, the transmembrane domain (TMD) and the intracellular actuator domain. The extracellular sensor domain potentially includes single-chain variable fragments (scFvs), nanobodies (Nbs), chemically induced dimerization (CID) proteins, or ligand-binding domains from native receptors. scFv-/Nb-based extracellular sensor domains must bind to non-overlapping epitopes on a single-ligand molecule. a The MESA receptor contains two different transmembrane chains, target chain (TC) and protease chain (PC). The TC intracellular domain (ICD) contains an engineered transcription factor (TF) and a protease cleavage sequence between the TMD and the TF. The PC ICD consists of a cognate protease (e.g., tobacco etch virus protease (TEVp) shown here). Ligand binding induces the heterodimerization of the MESA receptor, causing the TEVp to cleave its cognate cleavage sequence on the TC and releasing the TF to translocate into the nucleus and modulate gene expression. Depending on the types of TFs, synthetic promoter-driven transgene can be induced (e.g., tTA) or endogenous gene expression can be regulated (e.g., dCas9-VP64 activator).^47,48 sL soluble ligand. b The GEMS receptor also contains two transmembrane chains, of which the ICDs are derived from various receptor tyrosine kinases (RTKs) and cytokine receptors. Ligand binding induces the dimerization of the GEMS receptor, activating intracellular signaling cascade. By rewiring natural signaling cascades, transgene expression can also be induced.⁵³ At the intracellular juxtamembrane region alanine residues are inserted to modulate the conformation of ICD,²⁰¹ thus reducing ligand-independent signaling.53 EpoR erythropoietin receptor, D1 EpoR D1 domain, D2 EpoR D2 domain, F93A substitution of phenylalanine at position 93 with alanine, Ala alanine. c Evolution of the development of MESA receptors. (Right, Upper) The modular configuration of prototype MESA.47,48 (Left, Upper) Systematic evaluation of TMD reveals that the choice of TMD significantly affects MESA performance. The TMD-modified MESA utilizing two different TMDs in the TC and PC can achieve reduced background signals and/or increased ligand-induced signals.194 (Right, Lower) In split-TEVp MESA system, computationally optimized split TEVp can be reconstituted via ligand-induced dimerization and therefore restore TEVp function. The split-TEVp enables MESA to achieve low background and high fold induction.195 (Left, Lower) dCas9-synRTK (dCas9- and RTK-based chimeric receptor) as an example of dCas9-synRs (synthetic dCas9-based receptors), employs split-dCas9-VP64 and split-TEVp as the intracellular actuator domain, by fusing them to different RTKs. The difference between dCas9-synRTK and split-TEVp MESA is that dCas9-synRTK can only sense native ligands since the extracellular domain and TMD of a dCas9-synRTK are derived from an intact RTK.¹⁹⁶ nTEVp N-terminal TEVp, cTEVp C-terminal TEVp, dCas9n N-terminal deactivated Cas9, dCas9c C-terminal deactivated Cas9, RTK receptor tyrosine kinase. d Engineering of chimeric cytokine receptors to mimic cytokine receptor signaling using scFv and EpoR scaffold. ScFv/c-Mpl (S-Mpl) chimera contains a scFv-based extracellular sensor domain, the extracellular EpoR D2 domain and transmembrane/cytoplasmic domains of cytokine receptors (e.g., c-Mpl).^210-212 Chimeric cytokine receptor constructs with different combination of the domains containing the extracellular scFv, EpoR scaffold and intracellular domain of cytokine receptors (e.g., gp130). Compared to Sg, SD1D2g-1A additionally contains the extracellular D1D2 domain and one alanine residue at the intracellular juxtamembrane region. But the extracellular D1/D2 domain is dispensable for signaling.²⁰⁵ e Evolution of the development of GEMS receptors. GEMS should be considered as an evolutionary version of prototype SD1D2g-1A. Through modular engineering, the GEMS platform is able to specifically target a range of soluble ligands and robust transgene expression with high signal-to-noise ratios.⁵³ Based on GEMS, generalized engineered activation regulators (GEARs) capitalize on MS2 bacteriophage coat protein (MCP)-nuclear factor fusion proteins and the dCas9/sgRNA-MS2 system to rewire induced receptor signaling to endogenous gene expression.⁶² Advanced modular bispecific extracellular receptors (AMBERs) combine the GEMS system and designed ankyrin repeat proteins (DARPins). The high-throughput binder-screening technology, DARPin, can generate various new binders and endow AMBER with desired sensitivity and specificity towards new inputs.²¹³ In addition to customizing target gene expression, GMES and its derivatives inevitably perturb the endogenous gene regulatory network. dCas9, deactivated Cas9; sgRNA, single guide RNA; MS2, MS2 hairpin

CAR - самый известный класс синтетических рецепторных систем, которые уже одобрены Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA)^6,68 (Дополнительное примечание 1) для CAR Т-клеточной терапии. Они представляют собой успех достижений синтетической биологии в создании нового поколения терапевтических препаратов, мотивируя постоянную оптимизацию CAR-дизайна и разработку новых синтетических рецепторных систем в этой области.

В настоящее время CAR широко используются в иммунных клетках, таких как Т-клетки, NK-клетки и макрофаги (обзор в работах ^5,69,70). Кроме того, врожденные Т-клетки, включая инвариантные естественные киллерные Т-клетки (iNKT), мукозально-ассоциированные инвариантные Т-клетки (MAIT) и гамма-дельта Т-клетки (γδT), были разработаны как перспективные иммунные эффекторные клетки, поскольку они демонстрируют присущие противоопухолевому микроокружению (TME) способности и минимальный риск развития болезни трансплантат против хозяина (GvHD) (обзор в работах ^71-73). CAR в основном состоит из внеклеточного домена (ECD), трансмембранного домена (TMD) и внутриклеточного домена (ICD) (рис. 3а). Модульные характеристики его структуры придают ему преимущества, позволяющие легко модифицировать и перестраивать его.

ECD можно разделить на сигнальный пептид (SP) и лиганд-связывающий домен (LBD). SP побуждает трансмембранный рецепторный белок к транслокации на плазматическую мембрану, которая обычно расщепляется от зрелого белка CAR ко-трансляционно^74,75 (Дополнительное примечание 2). LBD, также называемый антиген-распознающим доменом, обычно представляет собой вариант одноцепочечного фрагмента (scFv).^76,77 scFv - это компактная искусственная конструкция, состоящая из вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина, соединенных гибким линкером⁷⁸ (Дополнительное примечание 2). scFv широко используется при создании CAR благодаря своему компактному размеру, высокой аффинности и специфичности распознавания антигенов.⁷⁷ Изменяя scFv, CAR могут специфически распознавать различные антигены на различных раковых клетках (например, кластер дифференцировки 19 (CD19), мезотелин, CEA, антиген созревания В-клеток (BCMA), CD38) путем аутентификации один к одному,³⁹ и впоследствии активировать уничтожение рака CAR Т-клетками. Помимо простой замены scFv, CAR могут быть оснащены биспецифическими антителами, состоящими из двух разных связанных антиген-распознающих доменов (также называемых "тандемными CAR")⁷⁹ (рис. 3c и табл. 1). В результате тандемных CAR Т-клетки могут распознавать различные антигены, экспрессируемые в одной раковой клетке (например, рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (Her2) и рецептор интерлейкина 13 альфа 2 (IL13Ra2),⁸⁰ CD19 и CD20⁸¹), а значит, снижают вероятность изьегания о воздействия опухоли.^82,83

Недавно Wong и коллеги изобрели интригующую обобщенную CAR-платформу - разделенную, универсальную и программируемую (SUPRA) CAR-систему для Т-клеточной терапии⁸⁴ (рис. 3в и табл. 1). В этой системе обычная архитектура CAR разделена на два элемента: (1) растворимый zipFv путем слияния scFv с leucine zipper и (2) универсальный zipCAR, содержащий остатки трансмембранного и внутриклеточного доменов, присоединенных к внеклеточному когнатному leucine zipper.⁸⁴ Добавляя различные zipFv белки, уникальная zipCAR-экспрессирующаяся в Т-клетках может воздейстаоапть на различные опухолевые антигены.⁸⁴ Более того, SUPRA CAR могут тонко настраивать активацию Т-клеток и программировать работу булевой логики, что повышает безопасность и эффективность Т-клеточной терапии.^84,85 Кроме того, в настоящее время разрабатываются различные переключаемые системы CAR с биспецифическими адаптерами (ссылки 86-95, а также обзоры в ссылках 96,97) (рис. 3c и табл. 1). Более подробная информация о UniCAR представлена в Дополнительном примечании 3.

Как упоминалось ранее, обычные CAR могут нацеливаться только на поверхностно-связанные лиганды, но не способны воспринимать растворимые лиганды. Чтобы перенаправить ответ CAR Т-клеток на растворимые сигналы, Chang и др. сконструировали CAR, который позволяет Т-клеткам устойчиво реагировать на различные растворимые лиганды с помощью механизмов механотрансдукции, вызванных димеризацией⁹⁸ (Таблица 1).

TMD обычно представляет собой гидрофобную α-спираль, которая охватывает плазматическую мембрану и выполняет функцию закрепления белков CAR на мембране.^68,99 Помимо контроля интеграции в мембрану, TMD также регулирует ключевые взаимодействия между CAR, такие как сборка, активация и кластеризация высокого порядка.^68,99,100 По сравнению с ECD и ICD, TMD уделяется относительно меньше внимания и исследований. Почти все TMD, используемые в CAR, получены из естественных белков Т-клеток, таких как CD8, CD28, CD4 и CD3.99,101 Тем не менее, исследования показали, что TMD определенно влияют на стабильность и функцию CAR.^102,103 Совсем недавно Elazar и др. продемонстрировали, что специфическое олигомерное состояние, запрограммированное de novo разработанными TMD, может регулировать функцию CAR и активность у Т-клеток CAR, а также уменьшать высвобождение цитокинов по сравнению с обычно используемым CD28 TMD.¹⁰⁰

Соединяя внеклеточный антиген-связывающий и трансмембранный домены, шарнирная область выполняет функцию линкера, обеспечивая гибкость для доступа к стерически затрудненным эпитопам^99,101 (Дополнительное примечание 2). Исследования выявили гораздо более важную роль шарнирной области как таковой или ее соединения с TMD, чем предполагалось изначально. Эти результаты показывают, что длина и состав шарнира могут влиять на функциональные возможности CAR, включая тонкую настройку сигнальной активности CAR, повышение противоопухолевой эффективности, снижение выброса цитокинов или нейротоксичности.^102-110 Поэтому при разработке CAR Т-клеток необходимо систематически оценивать и оптимизировать шарнир и TMD для обеспечения оптимальных характеристик и надежности.^{68,77,99,111-113}

ICD передает сигналы активации после связывания антигена с ECD. ICD большинства хорошо изученных CAR содержат сигнальный мотив, происходящий от CD3, который имеет три активационных мотива на основе тирозина иммунорецепторов (ITAMs)77,114 (Дополнительное примечание 4). Начиная с первого поколения (1 G) CAR, созданных в 1990-х годах¹¹⁵ , и до настоящего времени структура CAR как таковых постоянно изменяется вплоть до пятого поколения (5 G) (рис. 3b и табл. 1), стремясь повысить специфичность и минимизировать внецелевую токсичность^114,116.

CAR первого поколения (1 G) содержат только ITAM для обеспечения активирующей сигнализации без ко-стимулирующего домена¹¹⁵ (рис. 3b и табл. 1). Хотя было доказано, что CAR первого поколения способны активировать Т-клетки и контролировать опухоль у мышей,^117-119 им не удалось достичь противоопухолевого ответа в последующих клинических исследованиях.¹²⁰ Причина может заключаться в том, что одного CD3 недостаточно для активации покоящихся Т-лимфоцитов или запуска выработки оптимального количества цитокинов.^121,122 Для решения этих проблем были созданы CAR второго поколения (2 G) путем включения ко-стимулирующего домена (Дополнительное примечание 4) на основе CAR 1 G (рис. 3b и табл. 1), что позволяет активировать второй сигнал при стимуляции опухолевым антигеном.^123-128 Это усовершенствование позволило повысить продукцию цитокинов, персистенцию CAR T-клеток и противоопухолевую эффективность.¹²⁵

CAR третьего поколения (3 G) разработаны для объединения нескольких ко-стимулирующих доменов с целью дальнейшего повышения эффективности CAR T-клеток^129-132 (рис. 3b). Хотя потенциальные преимущества, включая длительную персистенцию и повышенную противоопухолевую эффективность, были продемонстрированы как in vitro, так и in vivo,130-137 некоторые клинические результаты не доказали значительного превосходства CAR Т-клеток 3 G над CAR Т-клетками 2 G.138-140 Поскольку имеющиеся данные были получены на относительно небольших и гетерогенных образцах, пока рано делать выводы, и для полной оценки их целесообразности необходимы дальнейшие крупномасштабные исследования.

CAR четвертого поколения (4 G) были сконструированы на основе CAR 2 G таким образом, чтобы конститутивно или индуцированно выделять цитокины (например, IL-12, IL-7, IL-15, IL-18 и IL-23), усиливая иммуномодулирующие способности^141-150 (рис. 3b и табл. 1). При активации CAR-опосредованных Т-клеток цитокины могут идеально высвобождаться в опухоли-мишени локально, облегчая системные побочные эффекты и решая проблему недостаточной продукции. Поскольку CAR 4 G могут не только улучшать активацию CAR T-клеток, но и захватывать иммунные клетки хозяина для усиления уничтожения опухоли,^151,152 CAR T-клетки 4 G также называют T-клетками, перенаправленными для универсального уничтожения цитокинов (TRUCKs).^{114,116,151,152} По сравнению с обычными CAR T-клетками, TRUCKs показывают более высокую экспансию и противоопухолевую активность в доклинических исследованиях, особенно в животных моделях солидных опухолей. Однако на практике системные побочные эффекты высвобождаемых цитокинов могут возникать при попадании в циркуляцию. Например, в клиническом исследовании Rosenberg и коллеги модифицировали опухоль-инфильтрирующие лимфоциты (TILs) для экспрессии IL-12 под NFAT-индуцибельным промотором с целью лечения метастатической меланомы. Они наблюдали сильную токсичность у большинства пациентов, которая, вероятно, была вызвана секретируемым IL-12.¹⁵³ Для оценки безопасности и эффективности этих лимфоцитов необходимо получить больше данных, полученных в ходе клинических испытаний.

В отличие от TRUCK, модуль экспрессии иммуномодулирующих факторов в 5 G CAR заменен новым ко-стимулирующим доменом, который может активировать специфический сигнальный путь внутри CAR Т-клеток^114,116 (рис. 3b и табл. 1). На основе этого замечательного принципа появилось несколько подходов, одним из ярких примеров которых является добавление рецептора IL-2 β (IL-2Rβ) в CAR-клетки.¹⁵⁴ При активации антигеном дополнительный домен IL-2Rβ позволяет активировать киназу JAK и сигнальные пути STAT3/5, что может позволить CAR T-клеткам достичь превосходного противоопухолевого эффекта с минимальной токсичностью в мышиных моделях благодаря лучшей персистенции и экспансии in vivo. Однако это может потенциально повысить риск развития CRS, что требует осторожного подхода в трансляционных исследованиях¹⁵⁴.

CAR T-клеточная терапия развивалась и постепенно становилась все более зрелой в течение последних десятилетий, демонстрируя большой терапевтический потенциал при раке крови и костного мозга. Однако в иммунотерапии солидных опухолей на основе CAR остаются проблемы, связанные с гетерогенностью опухоли, неэффективным перемещением и инфильтрацией опухоли, а также иммуносупрессивной ТМО.^83,155-159 Для облегчения CAR Т-клеточной терапии солидных опухолей было разработано несколько стратегий. Например, двойные CAR, тандемные CAR и UniCAR системы могут распознавать более одного антигена, что помогает смягчить бегство опухолевого антигена. CAR T-клетки с соответствующей экспрессией хемокиновых рецепторов могут обеспечить перемещение и инфильтрацию, достигая усиленного уничтожения солидных опухолей.^160-163 Кроме того, инженерия CAR T-клеток для экспрессии гепариназы, разрушающей внеклеточный матрикс (ECM), может способствовать инфильтрации опухолевых T-клеток и противоопухолевой активности.¹⁶⁴ Кроме того, вышеупомянутые TRUCK были разработаны для преодоления недостатков TME в терапии CAR T-клетками для лечения солидных опухолей с помощью иммуномодулирующих факторов.^142,144

Однако минимизировать внецелевую и вне-опухолевую токсичность CAR-иммунных клеток по-прежнему сложно. В связи с этим уже ведется разработка CAR нового поколения^96,99,101 (рис. 3c и табл. 1). Например, комбинаторный логический контроль с помощью двойного CAR^165,166 или synNotch CAR^40,167,168 может повысить специфичность нацеливания на опухоль за счет присутствия двух или более антигенов. С другой стороны, контроль безопасности с помощью ON- и OFF-переключателей CAR может точно настроить активность CAR^169-172, а kill-переключатель CAR может управлять продолжительностью жизни CAR T-клеток.^173,174 Это многообещающие стратегии, которые позволят повысить безопасность иммунотерапии CAR T-клетками в будущем.

Кроме того, большинство исследуемых CAR Т-клеток в настоящее время создаются путем введения конструкции CAR в аутологичные Т-клетки без нарушения гена эндогенного белка Т-клеточного рецептора (TCR). При этом условии можно избежать риска GvHD, который провоцируется несовпадением антигенов лейкоцитов человека (HLA)-TCR,¹⁷⁵. Для облегчения аллогенной трансплантации CAR T-клеток делеция α-цепи Т-клеточного рецептора (TRAC) с помощью эндонуклеаз, нарушающая экспрессию на поверхности клеток αβ-клеточного рецептора (TCRαβ), может успешно предотвратить реакцию "трансплантат против хозяина".^175-180 Недавно knockin технология CRISPR/Cas-опосредованна позволила точно интегрировать CAR-кодирующий ген в локус TRAC в Т-клетки периферической крови человека,¹⁸¹ что не только облегчает производство аллогенных CAR Т-клеток,^181-183 но и повышает потенцию Т-клеток, поскольку отредактированные Т-клетки превосходят традиционно сконструированные CAR Т-клетки.^181,184 Однако более поздние исследования показали, что эндогенный TCR играет критическую роль в обеспечении долгосрочной персистенции CAR T-клеток in vivo не только в животных моделях, но и у пациентов.185,186 Эти результаты в совокупности указывают на то, что крайне важно сбалансировать сложные эффекты удаления эндогенного TCR из CAR T-клеток при иммунотерапии опухолей.

Углубленное изучение рецепторов Notch позволяет понять молекулярные механизмы рецепторов Notch.¹⁸⁷ А присущие рецепторам Notch особенности, такие как модульность и передача сигнала под действием механических сил независимо от нативных лигандов, делают рецепторы Notch идеально подходящими для модульной инженерии химерных рецепторов.¹⁸⁸ Используя это преимущество, Lim и коллеги создали инновационную систему рецепторов synNotch, используя трансмембранный основной домен нативных рецепторов Notch (рис. 4а и табл. 1), а также внеклеточный сенсорный домен и внутриклеточный домен actuator.^31,40,41

В трех интригующих работах сообщается о модульных рецепторах synNotch, функционирующих с индивидуальным чувствительным и ответным поведением в клетках млекопитающих, включая Т-клетки.^31,40,41 Morsut et al. продемонстрировали, что synNotch может функционировать ортогонально для контроля дифференцировки клеток, формирования пространственного паттерна и принятия булевых решений.³¹ Между тем, Roybal и др. сообщили, что synNotch может распознавать опухолевый антиген и затем управлять экспрессией CARs (synNotch CARs, как упоминалось выше) (рис. 3c и табл. 1), что позволяет создавать AND-gate T-клетки, активируемые только двойным распознаванием антигена.⁴⁰ Roybal и др. также сообщили, что synNotch позволяет CAR Т-клеткам обеспечивать индивидуальные терапевтические ответы, например, секретировать цитокины и антитела очень точным и локализованным образом.⁴¹ По сравнению с обычными CAR, активация которых заставляет Т-клетки вырабатывать собственный цитокиновый профиль, synNotch может контролировать экспрессию дополнительных цитокинов, определяемых пользователем.⁴¹ В настоящее время развивается более мощное сочетание рецепторов synNotch с CAR для точного и эффективного уничтожения рака, что дает synNotch большой потенциал стать еще одной синтетической рецепторной системой, применяемой в иммунотерапии рака.

Благодаря своим превосходным характеристикам платформа synNotch получила широкое распространение в клеточной инженерии,25,33,34 в частности, для создания CAR T-клеток^{40,41,189,190} и программирования самоорганизующихся многоклеточных структур.^31,32,35 Несмотря на то, что в практическом биомедицинском применении все еще существуют проблемы и ограничения, исследователи упорно пытаются найти возможные решения. Во-первых, нативным рецепторам Notch свойственно сосуществование транс- и цис-режимов взаимодействия,³¹ поэтому активация не может быть достигнута из-за цис-ингибирования, когда когнитивный лиганд находится на той же поверхности, что и рецептор (цис).^31,191 Чтобы избежать цис-ингибирования, используется стратегия "flippase-out" для достижения взаимоисключающей экспрессии synNotch и его лиганда в трансгенной дрозофиле с рекомбиназой flippase.¹⁹¹ Во-вторых, для активации synNotch требуются механические силы, вызываемые поверхностно-связанными лигандами, что делает рецепторы synNotch неспособными воспринимать растворимые лиганды.³¹ Для решения этой проблемы Toda et al. сконструировали якорные клетки, которые могут связывать растворимые лиганды (например, диффузный GFP), что позволяет рецепторам synNotch реагировать на диффузные синтетические морфогены³⁵ (рис. 4b и табл. 1). В-третьих, рецепторы synNotch демонстрируют высокий уровень лиганд-независимой активации,¹⁹² что также характерно и для других синтетических рецепторных систем.²⁰ В одной из недавних работ была представлена улучшенная версия рецептора synNotch, названная улучшенным синтетическим рецептором Notch (esNotch). Благодаря добавлению внутриклеточной гидрофобной последовательности, принадлежащей нативной Notch, было достигнуто невероятное снижение (в 14,6 раза) фоновой активности¹⁹² (рис. 4b и табл. 1). Впечатляет то, что Roybal и коллеги добились систематического и модульного улучшения архитектуры synNotch, включая модификацию внеклеточного сенсорного домена, TMD, внутриклеточного юкстамембранного домена (JMD) и исполнительного домена.⁴² Развитая система synNotch получила название синтетических внутримембранных рецепторов протеолиза (SNIPRs) (рис. 4b и табл. 1), которые обеспечили снижение фона и усиление индуцированных лигандами сигналов.⁴² При этом SNIPR могут быть полностью гуманизированы с помощью гуманизированных модулей, что сводит к минимуму риск иммунного отторжения.⁴² Использование гуманизированных syn-TFs включая synZiFTR, не только сохраняет ортогональность SNIPR, но и в значительной степени снижает иммуногенный потенциал клеточных терапий.4²

Кроме того, Fussenegger и коллеги создали ортогональную систему химически активируемых рецепторов клеточной поверхности (OCAR) на основе synNotch, заменив обычные белок-специфические LBD на домены химически индуцированной димеризации (CID) (рис. 4б). Под действием малых молекул сконструированные OCAR на одной клетке могут образовывать гетеродимеры и запускать активацию сигнала путем высвобождения synTFs.¹⁹³ Когда система OCAR ко-экспрессируется с обычным synNotch на одной клетке, одна часть OCAR будет секвестрирована рецептором synNotch через взаимодействие coiled-coil, в результате чего OCAR не сможет активироваться под действием индуктора. Когда рецептор synNotch активируется в присутствии клеток-отправителей, OCAR может восстановить свою чувствительность к индуктору и таким образом еще больше усилить synNotch-сигнализацию путем добавления индукторов. Благодаря своему механизму действия, системы OCAR обладают внутренним выключателем, который может использоваться в качестве предохранителя в случае токсичности или сбоя1⁹³ (рис. 4б и табл. 1).

Подобно рецепторам synNotch, рецепторы модульной внеклеточной сенсорной архитектуры (MESA) также используют преимущества протеолитического высвобождения synTFs, которые транслоцируются в ядро и инициируют транскрипционную активацию для проведения ортогональных сигналов без прерывания эндогенных сигнальных путей^47,48 (рис. 5а и табл. 1). Но в отличие от рецепторов synNotch, которым требуются механические силы, индуцируемые связанными с поверхностью лигандами³¹ , рецепторы MESA подают сигнал через гетеродимеризацию растворимых лигандов для последующего протеолитического расщепления^47,48.

Каждый рецептор MESA состоит из двух разных однопроходных трансмембранных белков, поскольку их внутриклеточные домены отличаются друг от друга (рис. 5а). Рецепторы MESA также состоят из трех модульных доменов для преобразования внеклеточных лиганд-связывающих входов во внутриклеточные транскрипционные воздействия через synTF-релизинг.^47,48

Инженерия внеклеточного сенсорного домена позволяет перенаправлять рецепторы MESA на новые лиганды.^47,48 Однако прототип архитектуры MESA также страдает от высокого уровня лиганд-независимой активации, возможно, из-за переходной димеризации рецептора во время транспортировки или на поверхности клетки.⁴⁸ Для решения этой проблемы Leonard и коллеги прилагают усилия по улучшению системы MESA, особенно для снижения нежелательных фоновых сигналов. Систематическая стратегия была использована для выяснения и уточнения архитектуры MESA, продемонстрировав, что оптимизация TMD может снизить фоновый сигнал и повысить целевой¹⁹⁴ (рис. 5c и табл. 1). В другом исследовании авторы использовали стратегию вычислительного дизайна, чтобы использовать систему split-TEVp для оптимизации MESA (рис. 5c и табл. 1), добившись как низкого фона, так и высокой индукции укладки .¹⁹⁵ Параллельно была представлена аналогичная синтетическая рецепторная система на основе dCas9, названная "dCas9-synR" (рис. 5c и табл. 1), которая способна соединять нативные входные сигналы с прямой активацией заданных пользователем программ выходного ответа.¹⁹⁶

Как говорилось выше, MESA и dCas9-synR считаются рецепторами клеточной поверхности на основании предыдущих исследований,^20,28,197 но недавнее исследование поставило под сомнение этот вывод.¹⁹⁸ В этом исследовании авторы показали, что обе рецепторные системы не работают с очищенными белковыми лигандами, а активируются только при использовании ко-трансфецированных лигандов или клеточно-проницаемой молекулы рапамицина в качестве индукторов. Поэтому они предположили, что эти две рецепторные системы функционируют в эндоплазматическом ретикулуме (ER) и не должны быть отнесены к рецепторам клеточной поверхности¹⁹⁸. Тщательно проверив предыдущие публикации, мы обнаружили, что в трех работах, имеющих отношение к MESA, авторы показали, что рецепторы MESA могут быть активированы очищенным белком фактора роста эндотелия сосудов (VEGF),^48,62, а белки MESA, экспрессированные на поверхности клеток, были обнаружены с помощью проточной цитометрии.^48,194 И все же противоречивый вывод, сделанный в недавнем исследовании, может объясняться различными компонентами конструкций MESA (напр, внеклеточный линкер и TMD), использованных в исследовании,¹⁹⁸ которые могут изменять уровень экспрессии MESA на поверхности клеток, как указывалось в предыдущих работах.^48,194 Хотя раннее исследование Schwarz et al., показавшее, что MESA может быть активирован очищенным VEGF, поддержало MESA как рецептор клеточной поверхности,⁴⁸ более поздняя работа Krawczyk et al. не смогла воспроизвести первоначальные данные.⁶² При использовании очищенного VEGF наблюдались незначительные изменения (в диапазоне около 1,1 ~ 1,2 раза), что убедительно свидетельствовало о том, что MESA не достигает функции рецептора клеточной поверхности.⁶² Таким образом, поскольку в литературе существует предвзятость,^{48,62,196,198} для точной характеристики систем MESA и dCas9-synR, безусловно, требуется больше попыток воспроизведения.

Продуманное понимание архитектуры EpoR и сигнальных механизмов^199-202 послужило толчком к созданию химерных цитокиновых рецепторов на основе EpoR-scaffold^203-212 (рис. 5d и табл. 1). Эти химерные цитокиновые рецепторы (например, SD1D2g-1A) содержат внеклеточный scFv, внеклеточный EpoR D1D2, а также TMD домены, и внутриклеточные домены цитокиновых рецепторов (например, гликопротеина 130 (gp130) и EpoR)²⁰⁵ (рис. 5d и табл. 1). Эти химерные цитокиновые рецепторы могут использовать надежную лиганд-зависимую регуляцию ON/OFF и имитировать функции нативной системы цитокиновых рецепторов^205,206.

На основе этого прототипа была рационально разработана и сконструирована система GEMS. Рецепторы GEMS состоят из стандартного трансмембранного каркаса, полученного из рецептора эритропоэтина (EpoR) с мутацией F93A (рис. 5b и табл. 1), отменяющей чувствительность к нативному лиганду (эритропоэтину).⁵³ Внеклеточные LBD могут быть модульно заменены, чтобы чувствовать и реагировать на широкий спектр внеклеточных растворимых лигандов. Важно отметить, что ICD используют различные сигнальные домены для перенаправления входов в различные эндогенные пути (например, JAK/STAT, PI3K/Akt, PLCG и MAPK/ERK).⁵³ В последних отчетах платформа GEMS была преобразована в превосходные обобщенные преобразованные регуляторы активации (GEARs)62 и усовершенствованные модульные биспецифические внеклеточные рецепторы (AMBERs)²¹³ (Таблица 1). Система GEAR объединяет эндогенные сигналы, индуцирующие ядерную транслокацию synTF, и экспрессию генов на основе dCas9 через ДНК-связывающий модуль (рис. 5e). Различные пути (например, NFAT, субъединица ядерного фактора каппа B (NFκB), митоген-активируемая протеинкиназа (MAPK) или SMAD), активируемые различными рецепторами, включая рецепторы GEMS, могут быть включены в разработанные GEARs.⁶² Система AMBER - это, вкратце, тип программируемых рецепторов на основе DARPin и GEMS (рис. 5e), который наследует характеристики и преимущества обеих систем. Таким образом, AMBERs можно создавать и совершенствовать для связывания с новыми растворимыми лигандами модульным и предсказуемым образом.²¹³ Для доказательства концепции GEMS и его производные были применены для инженерии дизайнерских клеток in vitro и in vivo для лечения заболеваний (рис. 2d) (ссылки 53,62,213,214 и обзор в ссылках 18,19). Несмотря на то, что доклинические исследования показывают многообещающие результаты, до внедрения системы GEMS в клинику еще предстоит решить ряд проблем. Одной из главных проблем является проблема безопасности, связанная с иммуногенностью дизайнерских клеток. Недавно Weber и его коллеги разработали материал -генетический интерфейс в качестве защитного переключателя для терапевтических клеток млекопитающих, в котором они добились контроля выживания клеток, позволив клеткам-конструкторам чувствовать, встроены ли они в гидрогель, с помощью рецептора на основе GEMS.²¹⁵

Как уже говорилось выше, синтетические рецепторы, задействующие естественные сигнальные пути, обычно неизбежно активируют эндогенные транскрипционные сети в той или иной степени. Используя синтетические промоторы, рецепторы GEMS могут вызывать экспрессию заданных пользователем трансгенных мишеней.⁵³ Преимуществом является то, что рецепторы GEMS могут генерировать высокое соотношение сигнал/шум.¹⁸ Однако сопутствующим недостатком является то, что возмущение сети регуляции генов может повлиять на пролиферацию и выживание сконструированных клеток.

Перспектива программирования сложных настраиваемых функций в клетках млекопитающих стимулировала исследования по дизайну, конструированию и итеративному совершенствованию синтетических рецепторов, к чему привело расширение знаний о внутренней структуре и молекулярных механизмах действия природных рецепторов. В настоящее время основные стратегии конструирования синтетических рецепторов включают, помимо прочего, химерные/слитые белки, направленную эволюцию, рациональный дизайн и дизайн de novo (обзор приведен в ссылке 67).

Инженерия химерных/слитных белков означает генетическую интеграцию различных функциональных пептидов вместе с учетом архитектуры природного архетипа. Этот метод широко используется для синтетической инженерии рецепторов. Вышеупомянутые CAR, synNotch, MESA, GEMS, химерные цитокиновые рецепторы, а также Tango были первоначально сконструированы с помощью этого метода⁶⁷).

Направленная эволюция - одна из самых популярных стратегий белковой инженерии, которая имитирует естественную эволюцию и использует силу мутаций и отбора.^216,217 Благодаря итеративным циклам случайного мутагенеза с последующим отбором, созданные DREADDs (дизайнерские рецепторы, активируемые исключительно дизайнерскими лекарствами)²¹⁸ и AMBERs²¹³ позволяют нацеливать новые лиганды с высокой специфичностью и/или чувствительностью (табл. 1).

По сравнению с направленной эволюцией, рациональный дизайн требует глубокого понимания структуры белков. Механистическое понимание рецепторов способствовало рациональному дизайну и конструированию CAR, рецепторов synNotch и GEMS. Передовые подходы, основанные на вычислениях, помогли рационально спроектировать CARs^219,220 и MESA¹⁹⁵, а также другие модульные сенсорно-актуаторные системы²²¹ с улучшенной специфичностью и чувствительностью. Подходы in silico позволяют ученым конструировать многочисленные варианты рецепторов и проводить тысячи симулированных экспериментов с помощью компьютера, что значительно сокращает количество кандидатов, подлежащих проверке в лабораторных экспериментах^222,223.

Дизайн ^{de novo} - это интригующая стратегия конструирования белков с заранее заданными структурами и функциями. В отличие от рационального дизайна, дизайн de novo направлен на создание новых белков с нуля.²²⁴ С углублением понимания принципов биофизики белка и развитием вычислительных устройств и алгоритмов ученые достигли дизайна синтетических рецепторов с помощью белков de novo. В настоящее время de novo разработаны различные функциональные белки, такие как белки-связывающие белки и TMDs.^225-231 И они могут быть включены в синтетическую рецепторную инженерию с помощью модульного подхода. Например, сконструированные de novo TMD были использованы в инженерии CAR и достигли превосходства по сравнению с нативным TMD CD28 (как обсуждалось выше, а также в ссылке 100).

Более того, Baker с коллегами разработали с нуля переключаемую белковую платформу, названную "ортогональными ключевыми белками с защелкой" (LOCKR)⁵⁷ (табл. 1). Хотя LOCKR не является рецептором клеточной поверхности, он представляет собой прорыв в разработке белковых переключателей de novo, указывая направление будущего синтетического рецепторного дизайна. В этой системе межмолекулярные взаимодействия "клетка-ключ" могут конкурентно подавлять внутримолекулярные взаимодействия "клетка-защелка" и, таким образом, освобождать пептид-защелку из клетки для выполнения различных функций (например, связывания, деградации и ядерного экспорта).⁵⁷ Используя технологию LOCKR в качестве основы, разработанные модульные и настраиваемые белковые переключатели достигают экспрессии генов и даже контроля обратной связи в клетках.^57,58 Появление эволюционных технологий открывает широкие возможности для вычислительного дизайна, проектирования и улучшения произвольных синтетических рецепторных систем.

Различные стратегии или подходы, включая машинное обучение, могут быть объединены для облегчения проектирования и совершенствования синтетических рецепторов. Хорошим примером могут служить последние достижения в области CAR-инженерии. Как уже было сказано выше, внутриклеточные сигнальные домены CAR играют важную роль в активации Т-клеток и уничтожении опухолей, однако изучен лишь ограниченный набор сигнальных доменов. Чтобы расширить репертуар сигнальных доменов CAR, ряд исследований был направлен на их систематическую оптимизацию. Среди них Goodman и др.²³² и Si и др.²³³ индивидуально создали небольшую библиотеку CAR, содержащую природные или рациональные рекомбинантные ко-стимуляторные домены, и отобрали новые костимуляторные домены, которые, как было доказано, обеспечивают повышенную цитотоксичность и персистенцию Т-клеток, повышая тем самым противоопухолевую эффективность. Между тем, высокопроизводительный скрининг также применялся для выявления новых комбинаций сигнальных доменов²³⁴ или новых синтетических сигнальных доменов путем перестановки или рекомбинации.^235,236 Следует отметить, что Lim и коллеги включили машинное обучение в свое исследование и воспользовались обученными нейронными сетями для прогнозирования цитотоксичности и стволовости клеток CAR с синтетическими сигнальными доменами.²³⁶

Все новые и новые подходы способствуют разработке и совершенствованию различных синтетических рецепторов (табл. 1). Для практического использования выбор и оптимизация синтетических рецепторов для конкретного применения могут быть значительно облегчены с помощью обобщенной и систематической схемы, представленной на рис. 6 (также подробно рассмотренной в ссылке 20). Определение цели - первый и важнейший шаг перед вступлением в цикл DBTL. Он включает в себя сужение вариантов синтетических рецепторов, адаптированных к инженерной клеточной или генной терапии, путем уточнения требуемых характеристик и установления критериев эффективности для ожидаемых синтетических рецепторов. В частности, для количественной оценки эффективности синтетических рецепторов в различных сценариях применения можно использовать метрики эффективности²⁰ (рис. 6а).



figure 6 Metrics- and “design-build-test-learn” (DBTL) cycle-based framework for synthetic receptor engineering. a Performance metrics can be used for quantitative assessment of the performance of synthetic receptor systems. Signaling output can be quantified by reporter fluorescence measurement, luciferase assay or various other approaches. The performance of a synthetic receptor is determined not only by its background signal and signal-to-noise ratio, but also by the therapeutic thresholds in practical applications. An optimal receptor should exhibit a low background signal (OB) which is lower than the minimum therapeutic threshold (Tmin), and meanwhile exhibit a high induced output signal (Oi) (Right, Upper). A synthetic receptor exhibiting low OB and high Oi may still fail in practical applications, which might be due to OB > Tmax (maximum therapeutic threshold) (Right, Lower) or Oi < Tmin (Right, Lower). In another case when OB > Tmin (Left, Lower), leaky expression should be cautious of. b A modified DBTL-based framework can direct researchers to choose or engineer synthetic receptor systems for their application in cell therapy or gene therapy. A “goal” step is to define design objectives for engineered cell or gene therapy and the standards to quantify the performance of synthetic receptors using performance metrics. In the DBTL cycle, apart from conventional approaches, more advanced and powerful approaches like computation-guided design, high-throughput automation techniques, machine learning and computational modeling can further accelerate the engineering and improvement of synthetic receptors for better clinical applications. The figure is adapted from refs. ^20,239

Руководствуясь определенными целями, исследователи могут следовать конвейеру DBTL для разработки и проектирования синтетических прототипов, тестирования и оптимизации характеристик в подходящей модели (например, клеточных линиях) и дальнейшей оценки характеристик в практическом контексте (например, инженерная клеточная терапия или генотерапия на животных моделях) (рис. 6b). Следует отметить, что на этапе "конструирования" выбор различных модулей-кандидатов имеет огромное значение, что может существенно повлиять на свойства синтетических рецепторов. Например, для принудительной экспрессии синтетических рецепторов на поверхности клеток необходимы SP и TMD (обсуждалось выше), которые также влияют на уровень экспрессии рецепторов на поверхности клеток. Кроме того, для более эффективного рационального конструирования синтетических рецепторов можно использовать вычислительный дизайн, управляемый данными. Этапы "сборки" и "тестирования" традиционно трудоемки и включают в себя серию конструкторских разработок и оценку показателей эффективности. Быстро развивающиеся высокопроизводительные методы автоматизации могут не только повысить производительность, но и уменьшить количество человеческих ошибок в этом процессе.^237,238 На этапе "обучение" исследователи могут расшифровать полученные данные и создать на их основе чертежи синтетических рецепторов. Обычно для определения оптимального дизайна впоследствии используются методы проб и ошибок. В настоящее время передовое вычислительное моделирование и машинное обучение начинают играть центральную роль в обработке и обучении на основе массы биологических данных, создавая новую парадигму прогностического дизайна. Преодолевая разрыв между этапами "изучение" и "проектирование", они могут значительно ускорить цикл DBTL²³⁹.

Дизайн и проектирование синтетических рецепторов достигли больших успехов, и постоянная эволюция синтетических рецепторных систем ускоряет их биомедицинское применение и клиническое внедрение. Наиболее успешным примером являются CAR, которые находятся на переднем крае: шесть CAR Т-клеточных терапий уже одобрены FDA^6,68, а сотни других проходят клинические исследования (ClinicalTrials.gov). Кроме того, другие CAR-инженерные клетки, включая CAR NK и CAR макрофаги, также широко изучаются в трансляционных исследованиях.^{5,240,241,242}

В перспективе важной задачей в этой области является раскрытие принципов дизайна для рационального конструирования синтетических рецепторов с желаемыми свойствами и функциями. Растет число сообщений, в которых используются стратегии вычислительного дизайна для конструирования и улучшения синтетических рецепторных систем, таких как CARs,^219,220 MESA¹⁹⁵ и белковые переключатели de novo.^57,58 Среди них дизайн белков de novo находится дальше впереди, поскольку различные виды неестественных функциональных белков были созданы с нуля.^225-231 Вычислительные подходы, основанные на знаниях и данных, создали интерпретируемые модели для дизайна белков de novo.^243-249 Как обсуждалось выше, белки, разработанные de novo, уже были включены в синтетическую рецепторную инженерию.^57,58,100 Мы ожидаем, что в будущем различные ценные синтетические рецепторы могут быть разработаны с помощью стратегий дизайна de novo^224,250 или с помощью генеративных языковых моделей.²⁵¹

Важно отметить, что выбор функциональных синтетических рецепторных систем и их интеграция с "клетками-шасси" может расширить границы применения синтетических рецепторов и создать новые клеточные терапевтические средства (рис. 7). Например, применение CARs в клетках Engineered-T повысило специфическую способность убивать опухоли⁶⁸ (рис. 7а). Более того, комбинация различных синтетических рецепторных систем может проявлять синергетические эффекты и еще больше повышать их эффективность. Так, исследования показали, что CAR Т-клетки synNotch значительно повышают безопасность и противоопухолевую эффективность за счет комбинаторного распознавания антигенов^{40,167,168,189,252} или сверхчувствительного определения плотности антигена¹⁹⁰. По мере развития терапии с использованием инженерных стволовых клеток синтетические рецепторы могут также применяться для инженерии клеточных продуктов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток^3,70,175 (рис. 7б, в), что потенциально может использоваться для повышения их выживаемости и способности к приживлению посредством запрограммированной связи с микроокружением хозяина^2,3,253,254 (рис. 7б). Однако, поскольку существуют некоторые предостережения и критическое отношение к терапии стволовыми клетками, необходимы будущие испытания для дальнейшего изучения безопасности и эффективности терапии стволовыми клетками как таковой.^2,255 Между тем, опасения по поводу безопасности как генетических материалов (например, иммуногенность трансгенов), так и вносимых генетических модификаций также требуют тщательного рассмотрения в доклинических и клинических исследованиях.³



figure 7 The expanding potential therapeutic applications of synthetic receptors. a A variety of immune cells, such as T cells, innate T cells, NK cells, macrophages, dendritic cells and myeloid cells, can be directly isolated from patients and genetically engineered with CARs to enhance their antitumor capacity.68,332 Alternatively, these immune cells can be differentiated from CAR-engineered pluripotent stem cells (PSCs) as ‘off-the-shelf’ products. After being infused back into patients, these engineered immune cells interact with antigens on the tumor cells, leading to the activation of CAR immune cells to achieve cancer-killing.70,333 b, c Synthetic receptors could be integrated into PSCs to enhance original or program novel functionalities of the differentiated derivates for developing next-generation cellular therapeutics. b PSCs can differentiate into various cell types, like hepatocytes, neurons, muscle cells, etc., which are suitable for transplantation. One could imagine after being transplanted, cells engineered with synthetic receptors could sense and respond to host microenvironmental cues to promote the survival, proliferation and enhance tissue repair or regeneration.30 c Differentiated derivates from synthetic receptor-engineered PSCs might also be encapsulated and implanted in patients to avoid immunogenicity. These implantable therapeutic cells can sense various serum biomarkers (e.g., glucose, uric acid or thyroid hormone) and then trigger the activation of the corresponding therapeutic functions.16 d Synthetic receptor systems can be further designed and engineered with compact size and lower immunogenicity easier for in vivo gene therapy.42,64 These suitable synthetic receptor constructs can be delivered by non-viral vectors (e.g., lipid nanoparticle (LNP))^334,335 or viral vectors (e.g., AAV)²⁷

Более того, синтетические рецепторы могут также программировать генотерапию in vivo с повышенной безопасностью и эффективностью (рис. 7d). Одним из перспективных подходов к генотерапии in vivo является использование адено-ассоциированных вирусов (AAV) для доставки терапевтических генетических материалов в организм человека.^256,257 Хотя AAV все чаще используются в клинических испытаниях в качестве новых методов генной терапии,²⁵⁸ их ограниченная емкость упаковки (~4,7 кб) препятствует загрузке большинства синтетических рецепторов, описанных выше. Для удовлетворения клинических потребностей необходимо разработать или усовершенствовать синтетические рецепторы компактного размера, и эти вопросы уже изучаются.^42,64 Кроме того, гуманизация синтетических рецепторов с минимальной иммуногенностью также имеет жизненно важное значение для развития генотерапии, а также терапии инженерными клетками.^42,64 В заключение следует отметить, что модульные синтетические рецепторы с желаемыми функциями были разработаны и применены в терапевтических целях. Между тем, прогресс продолжает облегчать и ускорять разработку и эволюцию синтетических рецепторных систем, заставляя эту область переходить от прежнего режима проб и ошибок к режиму, основанному на знаниях и данных. Вкратце, мы ожидаем, что быстрый прогресс в биологии синтетических рецепторов откроет новые исключительные возможности для программирования генотерапии и терапии с помощью сконструированных клеток, которые были недостижимы для устоявшихся подходов.