Сердечно-сосудистые заболевания (CVD) поражают 28,6 миллиона американцев в возрасте старше 20 лет1 , ежегодно расходуя огромные средства на здравоохранение США и оказывая глубокое воздействие на пациентов и их семьи. Существующие методы лечения и вмешательства дорогостоящие, обычно требуют пожизненного приема, смягчают, но редко излечивают болезнь. Выявление генетических причин многих CVD позволяет использовать альтернативный подход: генотерапию для точного воздействия на молекулярную движущую силу патогенеза заболевания.

Моногенные заболевания возникают в результате редких патогенных вариантов (PVs), которые изменяют структуру, функцию или нормальный уровень экспрессии кодируемого геном белка. Моногенные нарушения обычно вызывают выраженные клинические проявления и повышенную заболеваемость и смертность. Доминантные моногенные CVD возникают в результате PVs в одной из двух копий генов, например, дилатационная, гипертрофическая и аритмогенная кардиомиопатия, каналопатии и аортопатии.^2-5 Рецессивные моногенные CVD возникают в результате PVs в обеих копиях генов, например, гомозиготная семейная гиперхолестеринемия. PVs, вызывающие моногенные нарушения, выявляются у 1,7% пациентов, проходящих катетеризацию сердца; они вносят существенный вклад в общее бремя CVD.⁶ Клиническое генетическое тестирование, позволяющее оценить наличие причинных моногенных вариантов и обеспечить раннюю точную диагностику и вмешательство.⁷

Полигенные расстройства возникают в результате множественных генетических вариантов, которые встречаются в здоровых популяциях и по отдельности оказывают незначительное влияние, но в совокупности повышают восприимчивость к заболеваниям. Большинство полигенных вариантов изменяют небелковые кодирующие, регуляторные последовательности, влияющие на экспрессию генов, и связаны с распространенными CVD, включая гипертонию, диабет, гиперхолестеринемию и атеросклероз.^8-11 Геномные анализы выявили специфические полигенные варианты, что позволило разработать полигенные шкалы риска для некоторых CVD. Однако данные, подтверждающие использование полигенных шкал риска в качестве руководства по клиническому лечению, остаются ограниченными.^12,13

Исследования моногенных CVD позволили выяснить пути, механизмы и терапевтические мишени. Например, доминантный моногенный вариант с усилением функции в гене, кодирующем пропротеинконвертазу субтилизин/кексин 9-го типа (PCSK9), был впервые выявлен в семье с ранним началом быстро прогрессирующего атеросклероза.¹⁴ Эксперименты показали, что PCSK9 разрушает рецептор липопротеинов низкой плотности (LNPs), который переносит частицы липопротеинов, переносящих холестерин, в клетки. Таким образом, варианты усиления функции PCSK9 уменьшают количество рецепторов LDL и впоследствии повышают уровень циркулирующего LDL, что аналогично эффектам, вызываемым вариантами ослабления функции гена, кодирующего рецептор LDL, который является причиной семейной гиперхолестеринемии. И наоборот, другие варианты PCSK9 человека, вызывающие потерю функции PCSK9, снижают уровень LDL и пожизненный риск развития CVD без пагубных последствий.^15,16 В совокупности эти генетические данные послужили толчком к разработке ингибиторов PCSK9, таких как моноклональные антитела alirocumab¹⁷ и evolocumab¹⁸ и малая интерферирующая РНК inclisiran¹⁹ , которые нацелены на белок и транскрипт PCSK9, соответственно. Эти новые методы лечения снижают уровень холестерина LDL и уменьшают количество событий, связанных с CVD. Несмотря на эффективность, лечение этими ингибиторами PCSK9 недолговечно из-за их периода полураспада, что требует регулярного дозирования. Однако, основываясь на положительном влиянии человеческих вариантов с утратой функции, в настоящее время ведутся работы по изучению однократного лечения, направленного на постоянное отключение гена PCSK9 у пациентов с высоким риском атеросклеротического заболевания.20 Генная терапия использует фундаментальные знания о генах, ответственных за патогенез CVD, и направлена на изменение, замену или модуляцию активности причинных генов для изменения течения заболевания путем его предотвращения или излечения.

Генотерапия различается по механизмам и функциональным последствиям причинных генетических вариантов (рис. 1). PVs, при которых инактивируется 1 аллель, что приводит к недостаточному для нормальной функции производству белка, вызывают гаплонедостаточность. При таких расстройствах генотерапия направлена на повышение уровня белка путем доставки экзогенных последовательностей, кодирующих белок, усиления экспрессии эндогенных последовательностей ДНК, исправления или модификации мутировавших последовательностей ДНК для получения нормального или близкого к норме белка. PVs, которые производят достаточное количество белка, но имеют пагубные функции, вызывают доминантно-негативные эффекты. Генотерапия доминантно-негативных эффектов направлена на коррекцию PVs, инактивацию мутировавшего аллеля ДНК или глушение аномальных транскриптов с помощью малой интерферирующей РНК или антисмысловых олигонуклеотидов. Генотерапия, изменяющая последовательности ДНК, имеет постоянный эффект, в то время как долговечность стратегий на основе РНК и доставки экзогенных белковых кодирующих последовательностей непостоянна. Однако генотерапия должна изменять достаточную долю клеток-мишеней, чтобы оказать благотворное воздействие на ткани и снизить вероятность деления клеток, не подвергшихся лечению, для поддержания или возобновления болезни.

Figure 1. Mechanisms and strategies of gene therapy. Pathogenic variants (PVs) in cardiovascular disease often lead to either haploinsufficiency, in which the amount of essential protein is insufficient, or dominant negative effects of genes critical in cellular function, in which protein with abnormal function is produced. Strategies to correct PVs differ according to the mechanisms of disease pathogenesis. Haploinsufficiency can be overcome through supplementation with exogenous proteins or direct editing of the causal variants in the genome. Targeted editing of the pathogenic variants or degradation of the mutant alleles to prevent production of harmful proteins can be used to treat disease caused by dominant negative effects. ASO indicates antisense oligonucleotide; LOF, loss-of-function; and siRNA, small interfering RNA. Solid and dashed boxes indicate permanent and temporary effects by gene therapy, respectively.

Инструменты для модификации последовательностей ДНК продолжают быстро развиваться. В современных терапевтических стратегиях используются система нуклеаз с кластеризованными регулярно перемежающимися короткими палиндромными повторами (CRISPR)/Cas9, редакторы оснований и прайм-редакторы (рис. 2). Хотя компоненты этих инструментов для редактирования генома различаются, каждый из них включает направляющую молекулу (РНК), которая нацелена на определенные последовательности, подлежащие изменению, и молекулы, которые разрезают ДНК и заменяют, вставляют или удаляют ?1 нуклеотидов. Инструменты для редактирования генома, содержащие нуклеазную систему CRISPR/Cas9, генерируют двунитевые разрывы ДНК. Они восстанавливаются путем негомологичного соединения концов, в ходе которого могут удаляться или вставляться случайные последовательности ДНК, что часто приводит к появлению стоп-кодона, преждевременно прекращающего транскрипцию гена.²¹ Поэтому при соответствующей специфичности мишени подход CRISPR/Cas9 может инактивировать аномальную копию гена. Поскольку на специфичность мишени влияет множество параметров, инактивация обеих копий гена может привести к неприемлемым последствиям. Базовые редакторы - это альтернативный терапевтический комплекс, который преобразует один нуклеотид в другой, в частности цитозин в тимин или аденин в гуанин. Прайм-редакторы содержат слитые белки, состоящие из никазы Cas9 и модифицированной обратной транскриптазы, которые могут вводить, удалять или заменять несколько нуклеотидов, тем самым предлагая более широкий спектр терапевтических возможностей.²² Редакторы оснований и прайм-редакторы не вызывают разрывов двойных цепочек и приводят к более предсказуемым и точным изменениям, чем подходы CRISPR/Cas9. Поэтому эти редакторы генов можно использовать для введения стоп-кодона, чтобы разрушить аномальную копию, содержащую доминантно-негативный вариант, точно восстановить нормальную последовательность ДНК или потенциально ввести активирующие последовательности для увеличения экспрессии гена.



Figure 2. Genome editing tools. Three main types of genome editors are currently available. Guide RNA (gRNA) encodes target DNA sequences and directs clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas9 nuclease to specific location within the genome with the pathogenic variant (PV). Nuclease cuts both strands of DNA, which is repaired by an intrinsic process available in cells within the body. Small insertions and deletions are often introduced during the repair process, which create a nonfunctioning DNA allele and ultimately premature truncation of proteins. Base editor, also recruited to a desired location within the genome through gRNA, nicks only 1 strand of DNA and substitutes the mutated nucleotide to another nucleotide such as cytosine to thymine and adenine to guanine. Prime editor is the newest genome editing tool and enables more versatile editing of nucleotides. Desired genome edit sequences can be included in prime editing gRNA (pegRNA), which can facilitate replacement, deletion, and insertion of multiple nucleotides. Target DNA sequences are marked with yellow; edited sequence changes are depicted in blue.

Эффективная доставка генотерапии in vivo, направленная на пораженные клетки внутри органов, остается сложной задачей для генных терапий. В настоящее время используются два типа средств доставки - вирусные и не-вирусные векторы, имеющие свои отличительные особенности (рис. 3). Вирусные векторы состоят из дефектных и не-патогенных вирусных оболочек с механизмами упаковки и капсидами, которые предотвращают иммуноопосредованную деградацию при системной доставке. Адено-ассоциированный вирус (AAV) является широко используемым вектором, поскольку он имеет несколько серотипов с тканеспецифическим тропизмом²³ и преимущественной доставкой в определенную ткань, а также потому, что он редко интегрируется в геном клетки. AAV могут длительное время сохраняться в органах с не-делящимися кардиомиоцитами или медленно делящимися клетками печени без негативных последствий. Эти преимущества нивелируются ограниченным размером груза векторов AAV и существующими или недавно возникшими нейтрализующими антителами против AAV.



Figure 3. Delivery methods for gene therapy. Gene therapy vector serve as an envelope to deliver genetic materials for gene therapy (eg, exogenous gene for supplementation or genome editing tools). Viral or nonviral vehicles carrying gene therapy tools bind to receptors on the surface of cells within the diseased organ (eg, heart) and enter the cells through endocytosis. After endosomal escape in which the gene therapy vectors are released and localized to the nucleus, the DNA-encoded gene therapy tool is transcribed to produce supplementary proteins or genome editors. AAV indicates adeno-associated virus.

Не-вирусные системы доставки, такие как липидные наночастицы (LNPs), были разработаны для преодоления ограничений, связанных с вирусными векторами. LNPs обычно состоят из ионизируемых липидов, амфипатических фосфолипидов, холестерина и полиэтиленгликолевых липидов. Эти липидные частицы инкапсулируют нуклеиновые кислоты, кодирующие геномные редакторы или дополнительный ген, и облегчают их доставку в клетки.²⁴ Преимуществами LNP являются простота изготовления и снижение иммунного ответа. Они также продемонстрировали успех в качестве средств доставки генетических материалов для терапевтического применения, таких как малая интерферирующая РНК против транстиретина для лечения сердечного амилоидоза²⁵ и мРНК-вакцины COVID-19.^26,27 Однако LNPs и соответствующие векторы обладают низкой тканевой специфичностью и накапливаются преимущественно в печени из-за присущего печени тропизма, что ограничивает эффективную доставку в кардиомиоциты.

Заметный прогресс в разработке и клиническом применении генотерапии CVD включает малые интерферирующие РНК для лечения гиперлипидемии¹⁹ и снижения уровня повреждающих белков при амилоидозе сердца.²⁵ Альтернативные терапевтические подходы, направленные на постоянную инактивацию аллеля мутантного гена с помощью системы нуклеаз CRISPR/Cas9 при сохранении другого аллеля с нормальной последовательностью ДНК, изучаются как на животных моделях²⁸, так и на пациентах²⁹ с CVD. Генная терапия CVD, вызванной гаплонедостаточностью, также находится в стадии активного изучения. Например, Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США недавно одобрило AAV-доставку последовательностей, кодирующих белок микродистрофин, для решения проблемы гаплонедостаточности дистрофина, являющейся причиной мышечной дистрофии Дюшенна. Полные результаты рандомизированного двойного слепого плацебо-контролируемого клинического исследования фазы 3, оценивающего безопасность и эффективность микродистрофина, пока не опубликованы.³⁰ Параллельно ведутся доклинические и клинические исследования, направленные на разработку терапевтических методов коррекции основных PVs с помощью редакторов генома. Исследования демонстрируют потенциал постоянной коррекции PVs путем доставки редакторов оснований AAV9 в животных моделях гипертрофической кардиомиопатии и дилатационной кардиомиопатии.³¹ Примечательно, что эти доклинические исследования предотвращают возникновение заболевания, но до сих пор ни одно исследование не обратило вспять сформировавшееся заболевание. Доставка с помощью LNPs редакторов оснований, инактивирующих ген PCSK9, эффективно снижает уровень LDL с длительным эффектом у не-человекообразных приматов³² и пациентов с гетерозиготной семейной гиперхолестеринемией или неконтролируемой гиперхолестеринемией³³. Открытое клиническое исследование фазы 1b было недавно остановлено из-за трансаминита и тромбоцитопении,³⁴ и в настоящее время проводится новое клиническое исследование фазы 1b с альтернативной системой доставки LNPs.²⁰ Проводятся многочисленные клинические исследования ранней фазы для изучения безопасности и эффективности замены генов и редактирования генома посредством вирусной и не-вирусной доставки в качестве нового варианта лечения различных типов CVD (таблица).

Table. Recent and Ongoing Clinical Trials in Gene Therapy of CVD

Успешная генотерапия CVD открывает широкие возможности для пациентов. Применение одного препарата, который на неопределенный срок предотвращает возникновение или прогрессирование заболевания, может избавить от необходимости пожизненного приема лекарств и связанных с этим побочных эффектов; предотвратить серьезные последствия заболевания, такие как аритмии и сердечная недостаточность; и снизить общее бремя болезни для пациентов, системы здравоохранения и общества. Достижение этих преимуществ потребует решения этических вопросов, вопросов регулирования, долгосрочного мониторинга и чрезвычайно высокой стоимости при участии множества заинтересованных сторон, включая пациентов, общественность, фармацевтические компании, сообщества и политиков. Хотя эти вопросы выходят за рамки данной научной рекомендации, мы выделяем основные научные проблемы.

Генотерапия основывается на точном знании PVs человека. Хотя клиническое генетическое тестирование в настоящее время доступно, многочисленные барьеры, включая отсутствие доступа, недоверие к системам здравоохранения, особенно в исторически недоразвитых (underrepresented) сообществах, отсутствие страхового покрытия и недостаточная осведомленность пациентов и врачей, ограничивают его распространение в США и многих других развитых странах. Для обеспечения надлежащего использования генотерапий клиницистам, пациентам и обществу необходимо повышать осведомленность о генетических концепциях и интерпретации генотипов.

Достижение целевой специфичности генотерапии для ткани, типа клеток и последовательности ДНК имеет первостепенное значение для терапевтического успеха. Включение клеточно-специфичных промоторов позволяет ограничить экспрессию CRISPR/Cas9, редакторов оснований и прайм-редакторов избранными клетками, однако непреднамеренные изменения ДНК, как близкие, так и далекие от целевой последовательности ДНК, все равно происходят с разной частотой. Доклинические исследования показали, что прайм-редакторы обладают наивысшей специфичностью по отношению к мишени и наименьшим количеством вне-целевых событий³⁵ , однако их эффективная доставка остается ниже уровня клинической эффективности. Необходимы исследования по изучению непреднамеренных близких и отдаленных мутаций,^36,37 а прогнозирование и оценка их потенциала, особенно поздних неблагоприятных эффектов, таких как злокачественные новообразования, остаются сложными. В отличие от других систем органов,^38,39 возможность непреднамеренной активации злокачественной трансформации при генотерапии сердца ограничена низким онкогенным потенциалом кардиомиоцитов.

Тканевой тропизм наиболее высок у AAVs, но эти векторы захватывают множество органов, снижая эффективность трансдукции в клетках-мишенях.⁴⁰ Внутривенно введенные LNP накапливаются в печени, обеспечивая эффективный вектор для печеночных факторов,⁴¹ но сохраняется потенциал печеночной токсичности. В настоящее время изучаются стратегии, направленные на дезактивацию печени⁴² , включение лигандов, специфичных для типа клеток, конъюгирование молекул для рецептор-опосредованного поглощения⁴³ , а также совершенствование сконструированных вирусоподобных частиц⁴⁴ , способных переносить грузы большого размера.

Векторы и не-человеческие последовательности генотерапий могут вызывать иммунные реакции. Предсуществующие нейтрализующие антитела к AAV встречаются у 25 % людей, что ограничивает эффективность первоначального лечения и препятствует повторному применению.⁴⁵ Эти вопросы особенно актуальны для методов лечения для неизлечимых болезней и ранних стратегий лечения, которые могут ограничить будущие возможности.

Минимизация острых побочных реакций при максимальной терапевтической эффективности является первостепенной задачей в генотерапии CVD. Более чем в 30% клинических исследований, в которых в основном использовались векторы AAV, сообщалось о серьезных побочных явлениях, включая гепатотоксичность, тромботическую микроангиопатию (системная доставка), нейротоксичность (доставка через центральную нервную систему), острый респираторный дистресс-синдром и смерть.^46,47 Неблагоприятные эффекты проявляются в наибольшей степени у пациентов, получающих высокие дозы AAV.⁴⁶ Не-вирусные векторы также несут потенциальные побочные эффекты. Внутривенные LNPs могут вызывать гепатотоксичность и реакции гиперчувствительности, связанные с инфузией.⁴⁸

И наконец, хотя доклинические исследования и клинические испытания на ранней стадии демонстрируют потенциал генотерапии для лечения CVD, надежные доказательства долгосрочной эффективности и безопасности в больших популяциях пациентов все еще отсутствуют. Крайне необходимо определить популяции пациентов с наибольшим риском неблагоприятных исходов в сочетании с доказательствами эффективности генотерапии для стабилизации или обратного развития заболевания; это будет иметь большое значение для определения оптимальных сроков применения генотерапии у отдельных пациентов. Биомаркеры, функциональные оценки и параметры, сообщаемые пациентами, включая показатели качества жизни, необходимы для оценки эффективности, сравнения с существующими лекарствами и вмешательствами, а также для определения места генотерапии среди других методов лечения CVD.

Генетическое понимание и терапевтические инновации способствуют резкому изменению ландшафта лечения CVD. Фундаментальные генетические открытия, творческие стратегии молекулярной инженерии и новые успехи свидетельствуют о потенциале генетических вмешательств, которые смягчают бремя болезни и улучшают состояние пациентов. Генотерапия имеет огромные перспективы в качестве подхода, меняющего парадигму в лечении CVD, предлагая перспективы профилактики заболеваний, длительного лечения и облегчения пожизненной фармакотерапии. Воплощение этих обещаний в клиническую реальность требует решения серьезных проблем. Точное нацеливание терапевтических генов на конкретные сердечно-сосудистые ткани, минимизация иммунной реакции на векторы доставки, смягчение вне-целевых эффектов инструментов редактирования генома, определение популяции пациентов с наибольшим терапевтическим потенциалом, а также установление долгосрочных профилей эффективности и безопасности - вот основные препятствия, которые необходимо преодолеть. Благодаря совместным усилиям в различных областях генотерапия обладает огромным потенциалом для революции в персонализированной медицине с учетом индивидуальных генетических и клинических особенностей.