В листьях и стеблях неудачливых (unlucky) растений патогены из рода Xanthomonas ведут микроскопическую войну с помощью секретного оружия: активаторов транскрипции (TALEs). Микробы-захватчики выделяют эти белки для активации генов в клетках растений, чтобы способствовать выживанию микроорганизмов.1

Впервые идентифицированные в 1989 году как отдельные белки, участвующие в вирулентности патогенов, TALEs и реакция, которую некоторые растения развили в ответ на них, заинтересовали генетиков растений.2 К середине 2000-х годов исследователи TALE знали, что белки обладают сигналом ядерной локализации, доменом активации транскрипции и доменом с многочисленными, в основном повторяющимися блоками из 33-35 аминокислот, которые сегодня называют repeat-variable diresidues (RVDs), способствующими экспрессии генов.3-6

Однако как эти регионы соотносятся с конкретными последовательностями ДНК, оставалось неясным. Ученые-растениеводы подозревали, что понимание этого механизма может помочь определить мишени во время развития болезни и улучшить меры по защите сельскохозяйственных культур. Когда исследователи раскрыли, как TALEN выбирают свои ДНК-мишени, это позволило привлечь внимание широкой научной аудитории к этим молекулярным машинам как к инструментам для редактирования генов, что в конечном итоге положило начало революции в этой области.

В 2007 году Jens Boch, в то время научный сотрудник группы Ulla Bonas’s в Мартин-Лютер-Университете Галле-Виттенберг, вместе со своим коллегой решал проблему: Два разных белка TALE активировали один и тот же ген. Тогда я и сказал: «Почему бы не посмотреть на это так, как если бы один из этих RVD распознавал одно основание»", - вспоминает он.

Дуэт выписал повторяющиеся последовательности одну за другой и заметил закономерность: В то время как большая часть 34-аминокислотной последовательности была одинаковой, 12-й и 13-й остатки отличались между повторами. Почувствовав, что им, возможно, удалось найти решение проблемы специфичности последовательностей TALE, группа экспериментально проверила свои выводы. Снова и снова они могли достоверно предсказать, какие последовательности свяжет данный TALE, просто взглянув на эти две аминокислоты в RVD.

«Я не мог спать две ночи», - вспоминает свое волнение Бох, ныне генетик растений в Ганноверском университете имени Лейбница. «Сразу стало ясно, что можно перепрограммировать белок на любое конкретное место в геноме».

Примерно в то же время генетик растений Адам Богданове, работавший тогда в Университете штата Айова, и его аспирант Мэтью Москоу пришли к такому же выводу с помощью вычислительных методов. Посетив группу Боха в начале года, Богданове написал им о своих выводах. Обе группы опубликовали свои результаты в журнале Science в октябре 2009 года. Код TALE был взломан.7,8 "Это было захватывающее время, - говорит Бох.

Вскоре после этой публикации Богданове начал сотрудничество с Дэниелом Войтасом, генетиком растений из Университета Миннесоты. Войтас был заинтересован в разработке инструментов редактирования генома растений. В 2009 году ведущей технологией для этого были домены цинковых пальцев, но их было сложно сконструировать.9

Voytas и Bogdanove соединили FokI, эндонуклеазу, используемую в доменах цинковых пальцев, с TALE, чтобы создать нуклеазы TALE (TALEN).10 «Это стало чем-то, что заинтересовало всех», - говорит Богданове, который сегодня работает в Корнельском университете. «Все, кто исторически интересовался редактированием генома, стали смотреть на TALE и начали их конструировать». Последующие группы еще больше усовершенствовали эти новые нуклеазы, удалив из белка ненужные элементы и выявив домены, упрощающие распознавание оснований.11,12

«Все сообщество, занимающееся редактированием генома, было в полном восторге, ведь заставить нуклеазы с цинковыми пальцами работать специфически было так сложно», - объясняет Бох. В отличие от этого, когда код TALE был взломан, TALEN стали более простыми".

TALEN также стали более популярными, чем домены цинковых пальцев или другой инструмент редактирования генов, мегануклеазы, по менее технической причине: Войтас и Богданове разместили свой метод и реактивы на сайте обмена ресурсами Addgene. «Этот набор, который сделал Дэн Войтас и поделился им со всем миром, был действительно очень важен для того, чтобы люди начали использовать эти вещи», - говорит Чарльз Герсбах, инженер-биомедик из Университета Дьюка. Кроме того, несколько веб-сайтов, в том числе разработанный Богдановым, помогали исследователям создавать индивидуальные TALEN для своих целей.13

В то время Gersbach недавно основал в Университете Дьюка свою группу, изучающую нуклеазы с цинковыми пальцами. Он вспоминает, что новые TALEN звучали интересно, но он скептически относился к тому, что они будут работать. Когда один из его студентов попросил поработать над TALEN, Герсбах сказал, что он рекомендовал им сосредоточиться на их текущих проектах с нуклеазами цинковых пальцев. Однако он все равно взялся за работу над TALEs и сделал это очень быстро, и результаты оказались великолепными", - сказал Герсбах.

Герсбах и его команда начали использовать TALEN в своих исследованиях по редактированию генома для лечения мышечной дистрофии Дюшенна.14 «Что было самым захватывающим в [TALEN], так это привлекло так много людей в область редактирования генов», - говорит Герсбах.

Фотография графического реферата (вверху), созданного с помощью программы BioRender, и флуоресцентное изображение (внизу), демонстрирующее работу Т-клетки SMART CAR, разработанной компанией Cellectis. Слева - в отсутствие сигнала от микроокружения опухоли, опухолеспецифический CAR не экспрессируется, и опухоль (зеленый цвет) не погибает. В присутствии специфического сигнала TME (справа) второй CAR экспрессируется, и опухоль погибает.

Исследователи Cellectis использовали генное редактирование TALEN для создания Т-клеток SMART CAR, которые реагируют на окружающую среду. Графическая аннотация (вверху) и флуоресцентное изображение (внизу) показывают, что эта CAR T-клетка экспрессирует CAR, специфичный для опухолевого антигена, только когда она находится в опухолевой среде (зеленый), чтобы уничтожить опухоль.

Интерес к TALEN вышел за рамки академических исследований. Компания Recombinetics, занимающаяся биоинженерией и редактированием генов животных, вывела первый безрогий молочный скот с помощью новой технологии.15 Затем компания Calyxt, специализирующаяся на биотехнологиях растений, использовала TALEN для получения первого коммерчески доступного растения с редактированием генома.16 «Это было началом революции редактирования генома», - говорит Бох.

В начале 2000-х годов компания Cellectis, разрабатывающая технологии редактирования генома, использовала мегануклеазы для избирательного изменения генома в клетках.17 Хотя эти инструменты иногда демонстрировали низкую эффективность в редактировании клеточной популяции, повышенная точность и безопасность молекулярных инструментов в то время приводили исследователей в восторг.18

Когда TALEN появились на научной сцене, они расширили возможности редактирования генома, причем первое поколение этих редакторов успешно редактировало до 25 процентов клеток.19 Более поздние версии достигали эффективности 76 или почти 100 процентов для некоторых целевых изменений.20,21 «Можете ли вы представить себе революцию того времени?» вспоминает Вэлтон. "До появления TALEN мы были довольны тем, что не имело терапевтического или биотехнологического значения. Когда был разработан TALEN, это стало реальностью".

В 2011 году Университет Миннесоты эксклюзивно передал патент на TALEN компании Cellectis. Одна из команд компании применила его в проектах по усовершенствованию другого нового метода лечения рака - химерных антигенных рецепторов (CAR) Т-клеток. При терапии CAR T-клетками клетки пациента выделяются и генетически модифицируются, чтобы распознавать специфический опухолевый антиген, а затем возвращаются пациенту в виде препарата, борющегося с раком.

Next-generation CAR and TCR Cancer Therapies

\

Эта терапия оказалась успешной у многих пациентов, однако исследователи признали, что, хотя использование собственных клеток человека позволяет избежать риска атаки его иммунной системы на терапевтические клетки, оно имеет свои собственные ограничения.22,23 У некоторых пациентов нет достаточного количества Т-клеток, которые можно было бы пожертвовать. Наличие популяции Т-клеток от здорового донора, которую можно было бы использовать для лечения нескольких пациентов, значительно расширило бы возможности CAR T-клеточной терапии, но для этого необходимо сделать Т-клетки невидимыми и нереактивными для их нового хозяина.

Cellectis решила эту задачу, используя TALENs для удаления гена Т-клеточного рецептора (TCR) из донорских Т-клеток, создав универсальные CAR Т-клетки (UCART).24 В 2015 году одна команда использовала TALENs для создания UCART-клеток, распознающих антиген на В-клетках, для лечения острого лимфобластного лейкоза у двух младенцев в рамках сострадательного использования.25 Впоследствии, в 2020 и 2022 годах, эти UCART-клетки продемонстрировали безопасность и эффективность в двух клинических испытаниях I фазы.26,27

Всего через несколько лет после появления TALENs в исследовательских лабораториях система CRISPR Cas9 в бактериях была продемонстрирована как РНК-управляемая эндонуклеаза и быстро была включена в число инструментов редактирования генома.28 Хотя это само по себе огромное достижение, Герсбах сказал, что благодаря TALENs «редактирование генома получило настолько больше внимания, что люди знали, что делать с CRISPR, когда он появился».

Но у CRISPR было большое преимущество перед предыдущими генными редакторами. "CRISPR гораздо проще внедрить. И это говорит парень из TALE", - сказал Богданове. Каждая RVD для пары оснований в целевой последовательности должна быть собрана друг с другом в пошаговом режиме, и исследователям пришлось сконструировать два TALEN, в то время как CRISPR Cas9 разрезал ДНК как единое целое.

"Большой размер и повторяющаяся природа могут сделать [TALEN] труднодоступными в некоторых случаях, - говорит Герсбах. Но в некоторых случаях TALEN имеют преимущество. Например, до недавнего времени системы CRISPR не могли эффективно локализоваться в митохондриях, поэтому TALEN преимущественно использовались для редактирования митохондриальной ДНК в моделях заболеваний, связанных с этой органеллой, в том числе с помощью редактирования оснований без CRISPR.29-31

«В некоторых случаях, когда люди решили эти проблемы и добились хорошей работы, технология может быть очень эффективной, и поэтому те, кто добился хорошей работы и вложил в нее деньги, продолжают использовать ее и сегодня», - сказал Герсбах.

Вэлтон говорит, что TALEN обеспечивают оптимальный баланс безопасности и точности для исследований его команды. Хотя белки могут быть громоздкими, что усложняет их производство и доставку, по словам Валтона, повышенная целенаправленность снижает вероятность того, что TALEN отсекут свою цель. Кроме того, в отличие от CRISPR, который требует наличия определенной последовательности вблизи места разреза, команда Cellectis может создавать TALEN для любых конкретных локусов.

Недавно команда использовала эту возможность для создания индуцируемых терапевтических клеток, которые активны только в опухоли.32 Используя TALEN, они заменили супрессивный ген последовательностью для опухолевого антигена CAR. «Это очень хороший пример создания CAR T-клетки, которая может чувствовать окружающую среду, нацеливаться на то, что нужно, и щадить то, что можно пощадить», - говорит Shipra Das, иммуноонколог из Cellectis, который разрабатывает CAR T-терапию с использованием технологии TALEN.

Далее команда изучает возможности применения генной терапии за пределами CAR T-клеток. «Мы только почувствовали первый толчок в этой области, и следите за будущим, потому что оно будет супер, супер, супер захватывающим», - сказал Вэлтон.

«В конце концов, эффекторы TAL стали огромным скачком вперед в инженерии специфичности связывания ДНК», - сказал Богданове. «Эффекторы TAL произвели революцию в области таргетинга ДНК, а CRISPR демократизировал ее».