Человеческое ухо анатомически можно разделить на наружное, среднее и внутреннее (рис. 1А). Звуковые волны из окружающей среды проходят через наружный слуховой проход к барабанной перепонке среднего уха, что впоследствии вызывает механическую вибрацию цепи слуховых косточек, преобразуя звуковые сигналы в электрические импульсы во внутреннем ухе. Затем электрические сигналы проходят по нейронам, достигают слуховой коры и вызывают слух[17, 18].



Figure 1 The structure of cochlea. A) Process of sound conduction in the ear. B) Anatomy of the cochlea. C) An enlarged diagram depicting the structure of the organ of Corti.

Улитка имеет сложное строение, похожее на раковину улитки, и играет незаменимую роль в слухе и слуховой передаче. Костный улитковый канал состоит из двух полостей - верхней и нижней. Верхняя полость разделена вестибулярной мембраной на два отделения, известные как вестибулярный и улитковый протоки, в то время как нижняя полость, scala tympani, остается отдельной. Среди этих компонентов кортиев орган располагается над базилярной мембраной и служит центральным рецептором звука при слуховой передаче.[19] Кортиев орган в основном состоит из опорных клеток, текториальной мембраны, волосковых клеток и спиральных ганглиев (Рисунок 1B,C).

Сенсоневральная тугоухость (SNHL) вызывается нарушениями в работе внутреннего уха или слухового нерва, такими как повреждение волосковых клеток, слуховых нейронов и поддерживающих клеток. Мутации в генетическом материале являются основным фактором, вызывающим нейросенсорную тугоухость. В настоящее время выявлено 148 генов, связанных с наследственной глухотой (https://hereditaryhearingloss.org/, обновлено 4 февраля 2024 года). Эти гены экспрессируются во многих типах клеток (табл. 1).

Таблица 1. Гены, ассоциированные с потерей слуха, и места их экспрессии[20].

В настоящее время основными методами лечения наследственной тугоухости являются использование слуховых аппаратов и кохлеарных имплантов. Слуховые аппараты служат для усиления слуховых стимулов у людей с легкими и умеренными нарушениями слуха, в то время как кохлеарные имплантаты подходят для пациентов с более глубокой степенью слухового дефицита.[21] Однако и слуховые аппараты, и кохлеарные имплантаты неэффективны для пациентов с повреждением нейронов спирального ганглия.[22] Кроме того, после имплантации кохлеарные имплантаты могут привести к потере остаточного слуха.[23] Также кохлеарные имплантаты и слуховые аппараты не способны улучшить патологические состояния во внутреннем ухе. Кроме того, из-за высокой вариабельности генетических вариантов, связанных с потерей слуха, может потребоваться широкий спектр терапевтических стратегий. В ответ на эти вызовы генотерапия, такая как замена генов и редактирование генов для ремонта или восстановления экспрессии определенных генов, вселила новый оптимизм в лечение наследственной глухоты[24-27].

Генотерапия предполагает доставку экзогенного генетического материала (ДНК или РНК) в клетки-мишени и использование этих последовательностей нуклеиновых кислот и соответствующих им продуктов экспрессии для регулирования, восстановления, замены или удаления патогенных генов в этих клетках. Эти подходы направлены на смягчение или восстановление дисфункции, вызванной дефектами генов, и обладают значительным потенциалом для лечения генетической глухоты, о чем свидетельствуют недавние успешные сообщения о стратегиях генотерапии, опосредованной AAV, для восстановления слуховой функции у пациентов с мутациями OTOF[14-16].

Обычно используемые вирусные векторы в генотерапии глухоты включают аденовирус (AdV), AAV, лентивирус (LV), ретровирус (RV) и т.д., при этом AAV является преобладающим вектором. Подробные характеристики этих часто используемых вирусных векторов представлены в таблице 2.

Table 2. Types and features of commonly used viral vectors.

AAV - это не-развивающийся ДНК-вирус с одноцепочечным геномом, который был первоначально обнаружен и выделен в 1965 году из препаратов аденовируса, полученных от приматов.[28] В связи с незаменимой ролью аденовируса и других герпесвирусов как вирусов-помощников, он был обозначен как аденовирус-ассоциированный вирус и отнесен к роду зависимых вирусов.[29]

Широкое клиническое применение AAV объясняется его пониженной иммуногенностью и токсичностью капсида, что делает его предпочтительным выбором в медицинской практике. Проведено 63 текущих или завершенных клинических исследования с использованием вмешательств на основе AAV (https://clinicaltrials.gov/, с фильтрами. Тем временем в Китае было заявлено и одобрено более 30 препаратов для генотерапии с использованием AAV (https://www.cde.org.cn/, обновлено в декабре 2023 года). В настоящее время проводится 17 клинических испытаний с использованием векторов AAV (https://www.chictr.org.cn). Среди них Qi et al., Lv et al. и Wang et al. использовали генотерапию для восстановления слуховой функции у людей с врожденным DFNB9, вызванным мутациями OTOF (NCT05901480 и ChiCTR2200063181)[14-16].

AAV состоит из двух отдельных компонентов, а именно внешнего капсида и внутреннего генома. AAV представляет собой одноцепочечную молекулу ДНК длиной 4,7 кб, которая включает в себя ген rep и ген cap, фланкированные инвертированным терминальным повтором (ITR). Внешняя структура представляет собой икосаэдрический капсид, состоящий из трех капсидных белков (VP1, VP2, VP3), размеры которых варьируют от 20 до 25 нм.[38] В настоящее время существует не менее 12 серотипов AAV дикого типа и более 100 вариантов, и в рамках этих векторов постоянно создаются новые мутанты AAV для повышения эффективности доставки генов. [39] Из-за различий в сродстве вектора к гликопротеиновым рецепторам клеточной поверхности, вторичным рецепторам или, возможно, ко-рецептору AAVR, каждый серотип демонстрирует различный тканевый тропизм.[40-42] В последние годы AAV стал предпочтительным вектором для схем генотерапии благодаря своему исключительному профилю безопасности, широкому тканевому и клеточному тропизму и высокой инфекционной эффективности.[43]

Рекомбинантный AAV (rAAV) - это рекомбинантный вариант, полученный из дикого типа и не-патогенного AAV.[44] Родные кодирующие последовательности, такие как ген rep и ген cap, а также не-кодирующие последовательности ДНК (промотор) между его ITR-областями, заменяются кассетой с трансгеном. Целевые гены вставляются в кассету с трансгеном для достижения специфических генетических модификаций. Такая модификация делает репликацию в геноме rAAV невозможной из-за отсутствия генов rep и cap, позволяя только доставлять интересующий ген в клетки-мишени.[45] Векторы rAAV обладают многочисленными преимуществами, включая стабильные физико-химические свойства, низкую патогенность, минимальный риск интеграции и устойчивую экспрессию экзогенных генов. Поэтому они стали одним из наиболее широко изученных и применяемых векторов in vivo для целей генотерапии.

В настоящее время генотерапия в улитке в основном направлена на волосковые и опорные клетки. Генотерапия включает в себя восстановление генов in situ и регенерацию волосковых клеток, полученных из опорных клеток. Разновидности капсида AAV отличаются широким разнообразием и способностью эффективно воздействовать на внутреннее ухо и трансдуцировать его. В то время как большинство серотипов AAV могут эффективно инфицировать внутренние волосковые клетки, они демонстрируют меньшую эффективность при инфицировании наружных волосковых клеток и опорных клеток.[46-48] Кроме того, на скорость трансдукции векторов AAV во внутреннем ухе влияет возраст животного.[49] В таблице 3 представлены широко используемые капсиды AAV и их соответствующие скорости трансдукции для различных типов клеток во внутреннем ухе мыши.

Table 3. Transduction rates of commonly used AAV capsids to different cells of the inner ear.

Серотипы AAV, которые доступны в настоящее время, недостаточны для воздействия на все типы клеток, которые экспрессируют гены, связанные с глухотой. Например, мутации GJB2 являются наиболее распространенной генетической причиной несиндромальной тугоухости у людей и экспрессируются в не-сенсорных клетках улитки, таких как опорные клетки, interdental клетки, клетки внутренней борозды, клетки сосудистого русла и спиральной связки.[50, 51] К сожалению, существует ограниченное количество векторов AAV, которые эффективно и последовательно нацелены на эти опорные клетки. Поэтому очень важно найти векторы AAV с повышенным тропизмом к клеткам, экспрессирующим болезнетворные гены, и с повышенной инфекционной эффективностью.

Стратегии генотерапии наследственной глухоты в основном включают в себя инструменты замены генов и редактирования генов (рис. 2). Замена гена предполагает введение функциональной последовательности целевого гена для компенсации потери функции мутантного гена. Этот подход подходит для лечения заболеваний с незначительными невидимыми мутациями и доминантных генетических заболеваний с легкой гаплонедостаточностью, что делает его наиболее распространенной стратегией в клиническом лечении наследственной глухоты. Самое раннее исследование по генотерапии уха было начато в 2012 году и продемонстрировало частичное восстановление слуховой функции у мышей с дефицитом Vglut3 с помощью AAV1-опосредованной генотерапии. [4] С тех пор в области генотерапии AAV-опосредованной генетической глухоты были достигнуты значительные успехи, что подтвердило ее целесообразность на различных моделях мышей с глухотой, таких как Otof^Δ/Δ, Tmc1^Y182C/Y182C, Tmc2^Δ/Δ, Strc^Δ/Δ и Kcnq4^W276S/+ (Таблица 4).

Подробности приведены в подписи после изображения

Figure 2 Gene therapy strategies for hereditary deafness. A) The gene replacement strategy. B) The gene editing strategy. DSB:double-strand breaks, HR: homology-directed repair, NHEJ: nonhomologous end joining, PAM: protospacer adjacent motif. Table 4. Summary of gene replacement for improving the hearing function in mouse models.[25]

Table 4. Summary of gene replacement for improving the hearing function in mouse models.[25]

Примечательно, что недавние клинические испытания продемонстрировали успешное лечение DFNB9, вызванного мутациями в гене OTOF, с помощью AAV-OTOF. Qi и др. показали, что генотерапия AAV-OTOF впервые была применена к пациентам в возрасте 5 и 8 лет, соответственно, что привело к значительному улучшению слухового ответа ствола мозга (ABR) и чистого тонального аудиологического восприятия[14] (Advanced Science, 8 1, 2024). Впоследствии Lv и др. и Wang и др. продемонстрировали, что генотерапия AAV1-OTOF значительно снизила средний порог ABR у пациентов с дефицитом OTOF на 40-57 дБ на частотах от 0,5 до 4 кГц, тем самым эффективно улучшив слуховую функцию[15, 16] (Lancet, 24th 1, 2024; Nature Medicine, 5 6, 2024).

Терапия редактированием генов включает в себя два подхода, а именно нокаут генов и восстановление генов [25], которые предполагают использование различных инструментов редактирования генов для достижения целевой сайт-специфической вставки, удаления или замены генных последовательностей. Это позволяет нарушить, восстановить или активировать экспрессию целевого гена. Генный нокаут особенно применим при доминантной наследственной глухоте, вызванной патогенными мутировавшими аллелями или теми, которые препятствуют нормальной функции аллелей. Например, в 2014 году Gao и др. успешно осуществили in vivo CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование генов в клетках внутреннего уха с помощью рибонуклеопротеинового комплекса SpCas9-gRNA. Впоследствии, в 2018 году, они успешно восстановили функцию слуха у глухих мышей Tmc1^Bth/+ с помощью технологии SpCas9-gRNA.[87] Восстановление генов включает в себя различные методы, такие как восстановление с помощью гомологичной рекомбинации, опосредованное редактором оснований, ведущим редактором и нуклеазой Cas9. Путь репарации, зависящий от гомологичной рекомбинации, использует ДНК дикого типа в качестве шаблона для точного исправления участка мутации целевого гена до его формы дикого типа. Примечательно, что как редакторы оснований, так и редакторы праймеров позволяют восстанавливать гены, не вызывая двунитевых разрывов в ДНК. Результаты исследований по редактированию генов в мышиной модели наследственной глухоты обобщены в таблице 5 ниже.

Table 5. Summary of gene editing to successfully improve hearing function in mouse models.[25]

Помимо редактирования ДНК, в 2023 году Xue и др. использовали инструмент для редактирования одного основания РНК CRISPR/Cas13 (emxABE), доставленный одим носителем AAV, для точного восстановления мутантных мРНК у гуманизированных мышей с точечным мутантом Otof c.2485C>T (OtofQ829X/Q829X),[8] эффективно восстанавливая слух почти до нормального уровня у мышей модели DFNB9. В настоящее время это исследование проходит клинические испытания (NCT06025032). Эти результаты свидетельствуют о том, что методы доставки и редактирования генов обладают значительным потенциалом для существенного восстановления слуха в различных моделях мышей.

Локальное хирургическое введение препаратов для генотерапии во внутреннее ухо вызвало значительный интерес исследователей благодаря своему потенциалу для лечения заболеваний внутреннего уха, которые неэффективно лечатся системными препаратами, в первую очередь, из-за ограничений кровеносного барьера лабиринта. [96, 97] По сравнению с традиционными способами доставки препаратов, локальное хирургическое введение позволяет целенаправленно доставлять корректируемый генетический материал для продолжительного лечения, избавляет от необходимости введения нескольких доз в труднодоступных местах и обеспечивает более стабильную среду для одной дозы в улитке. Обычные методы введения препарата мышам включают кохлеостомию, инъекцию RWM и инъекцию в полукружной канал (каналостомию).

Кохлеостомия позволяет напрямую доставить вирусный вектор в среднее ухо через височную кость, что приводит к высокой скорости трансфекции.[98] Несмотря на минимальную травматичность инъекции, все же существует риск утечки эндолимфы в месте инъекции. Поэтому такой подход сопряжен с высоким риском потери слуха из-за возможного повреждения внутренних структур улитки. Kawamoto и др.[99] сравнили эффективность трансдукции и послеоперационные результаты между кохлеостомией и каналостомией у взрослых мышей и обнаружили, что оба метода были эффективны для трансдукции, но функция улитки была нарушена после кохлеостомии. Chien et al.[98] также продемонстрировали, что хирургическое вмешательство через RWM привело к меньшей травме по сравнению с кохлеостомией при сохранении сопоставимой эффективности трансдукции. Это говорит о том, что кохлеостомия, как инвазивная процедура, потенциально может нарушить баланс внутреннего уха и вызвать дополнительные механические повреждения у мышей. Поэтому идеальный метод доставки должен обеспечивать высокую эффективность трансдукции и минимальные сопутствующие повреждения. Примечательно, что введение RWM уменьшает повреждение волосковых клеток по сравнению с введением через кохлеостому. Этот способ позволяет доставлять лекарство непосредственно в барабанную полость и обеспечивает лучшее сохранение слуховой чувствительности по сравнению с кохлеостомией. Инъекция через мембрану заднего ушного окна является минимально инвазивной и обеспечивает отличную слуховую защиту с ускоренным восстановлением.[100] Она обычно применяется у новорожденных мышей и не-человекообразных приматов (NHP), позволяя доставлять носители в перилимфу кохлеарной scala tympani. Akil и др. пришли к выводу, что трансфекция через RWM лучше и равномернее по сравнению с кохлеостомией, позволяя проводить обширную трансфекцию различных типов клеток, включая волосковые клетки и нейроны спирального ганглия.[100] Более того, было продемонстрировано, что пороги ABR не изменяются. Таким образом, введение посредством RWM можно считать весьма перспективной альтернативой для клинической трансфекции малых молекул. Однако эффективность и результативность доставки лекарств через RWM в первую очередь зависит от проницаемости препарата через RWM и времени его пребывания на мембране[101]. Поэтому учет проницаемости лекарств или реагентов на RWM имеет решающее значение при разработке экспериментов. Хотя хирургическое вмешательство через RWM можно считать минимально инвазивным у новорожденных мышей, у взрослых мышей после введения RWM наблюдалась легкая потеря слуха.[98, 100] Эксперименты Zhu et al. продемонстрировали сильную корреляцию между выпотом в среднем ухе, который возникает у мышей после операции «круглого окна», и нарушением слуха.[102]

В отличие от вышеупомянутых методов, вирусная генотерапия, проводимая через инъекцию в задний полукружной канал (PSCC), эффективно трансдуцирует волосковые клетки как вестибулярного нерва, так и улитки.[64] При инъекциях в PSCC терапевтический агент обычно доставляется через отверстие в PSCC. Исследовательская группа Zhu's обнаружила, что продолжительность периферической лимфоидной утечки и скорость инъекции значительно влияют на послеоперационные результаты восстановления слуха, что заставило их изменить традиционную хирургическую технику для процедур PSCC.[103] Хотя скорость трансдукции волосковых клеток у взрослых мышей была ниже, чем у новорожденных, при эквивалентной вирусной нагрузке, эффективная трансдукция внутренних и внешних волосковых клеток взрослых мышей достигалась дозозависимым образом. Кроме того, PSCC анатомически легко локализовать у грызунов, поскольку он расположен вне барабанной полости. Это облегчает хирургическую локализацию и манипуляции, сводя к минимуму риск повреждения внутреннего уха во время операции [104].

Кроме того, кохлеарному акведуку уделялось лишь ограниченное внимание как потенциальному пути доставки векторов, несмотря на его прямое жидкостное соединение между внутричерепной спинномозговой жидкостью и перилимфой улитки. Такой подход требует доступа к черепу и большего объема инъекции по сравнению с прямой кохлеарной инъекцией. В январе 2023 года Ranum и др.[105] продемонстрировали надежную трансдукцию волосковых клеток и различных других клеток спиральной связки и спирального лимба через спинномозговую жидкость с использованием всех трех серотипов AAV (AAV1, AAV2 и AAV9) у NHP. Аналогично, Mathiesen и др.[106] сообщили, что улитковый акведук проявляет лимфоподобные свойства как костный канал, соединяющий спинномозговую жидкость с жидкостью внутреннего уха. Восстановление слуха у взрослых мышей может быть достигнуто путем введения вирусной конструкции в цистерну magna через кохлеарный акведук. Однако следует отметить, что этот эффект был оценен только после двухнедельного периода лечения, и для определения его долгосрочной эффективности необходимы дальнейшие исследования. Чтобы повысить достоверность полученных результатов, будущие исследования будут направлены на использование моделей NHP. Кроме того, эти результаты свидетельствуют о том, что генотерапия, вводимая через спинномозговую жидкость, имеет многообещающий потенциал для решения проблемы потери слуха.

В настоящее время AAV-опосредованная доставка генов продемонстрировала свою эффективность и осуществимость на мышиных моделях, однако для клинического применения требуется дальнейшее подтверждение. Помимо обеспечения эффективной трансдукции генов, опосредованной капсидом AAV, в волосковые клетки улитки, важно также оценить эффективность трансдукции этих капсидов в волосковых клетках улитки NHP (Таблица 6). Различные векторы AAV, такие как AAV1, AAV8 и AAV9, показали высокую эффективность трансдукции во внутренних волосковых клетках улитки, но ограниченную эффективность в наружных волосковых клетках. Напротив, варианты на основе капсида AAV9 демонстрируют многообещающий исследовательский потенциал и значительный терапевтический эффект у мышей с синдромом Ашера 3А и мутантных мышей с отоферлином. Такие репрезентативные примеры, как PHP.B, AAV-S и Anc80L65, имеют огромное исследовательское значение для терапии доставки генов, направленной на наследственную тугоухость. По мере продвижения исследований эффективности трансдукции различных капсидов, направленных на клетки улитки NHP, клиническое применение AAV-опосредованной генотерапии представляется неминуемым.

Table 6. Different AAVs for Transducing NHP or Human Inner Ear Cells.

Терапевтическая эффективность и хирургический ущерб, наносимый препаратами внутреннему уху, определяются используемым методом доставки. С появлением генотерапии в клинических условиях целевая аудитория для доставки лекарств постепенно расширилась от мышей до NHP. Несмотря на различия в строении улитки в разных моделях животных, большинство операций по доставке препаратов для генотерапии включают два основных процесса - хирургическое воздействие и введение препарата. Примечательно, что анатомическая структура внутреннего уха в моделях NHP очень похожа на человеческую. В моделях NHP для доставки лекарств обычно используется хирургический подход, заключающийся в воздействии на круглое окно через сосцевидное углубление[107, 109]. Этот подход имеет сходство с операцией кохлеарной имплантации, что позволяет клиническим врачам быстро овладеть этой техникой. Кроме того, компания Akouos, занимающаяся генотерапией, добилась эффективной трансдукции внутренних волосковых клеток путем введения вектора Anc80L65 через RWM после создания отверстий в дне стремечка[109].

NHP имеют сходство с человеком в плане иммунитета и метаболизма, что делает их ценными моделями для оценки токсичности и фармакологии векторных систем AAV. В исследовании Zhang et al. AAV1-EGFP вводили во внутреннее ухо NHP в течение 4 недель, что привело к широкому распространению в различных органах без явной системной острой токсичности.[6] Qi et al. провели предварительную проверку безопасности генотерапии AAV-OTOF у NHP и показали, что местное введение не влияет на нормальный слух.[5] После местного введения во внутреннее ухо NHP в различных дозах, распространение AAV наблюдалось в таких органах, как мозг и печень. Хотя за короткий период наблюдения не было обнаружено никаких органических поражений, долгосрочные риски остаются неопределенными. Более того, после локального введения вируса во внутреннее ухо NHP в крови обнаруживается быстрое увеличение количества AAV-нейтрализующих антител. Этот факт подчеркивает необходимость учитывать влияние доставки вируса на иммунные органы при исследовании безопасности локальных инъекций. Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что долгосрочный мониторинг безопасности должен быть сосредоточен не только на слуховой системе, но и включать в себя бдительность в отношении потенциальных изменений, происходящих в других системах органов.

В настоящее время генотерапия глухоты находится на стадии клинических исследований. Первое клиническое испытание генотерапии глухоты было проведено компанией Novartis Pharmaceuticals (NCT02132130) с использованием CGF166, рекомбинантного аденовирусного вектора 5, содержащего кДНК, кодирующую человеческий дисрегуляторный фактор транскрипции (HATH1). Однако это исследование, включавшее 22 участника, не дало значительных улучшений в восстановлении слуха [110].

Что касается наследственной глухоты, то в настоящее время в мире проводится 6 клинических испытаний, в которых особое внимание уделяется DFNB9 (рис. 3). Эти испытания проводятся уважаемыми исследовательскими группами, включая Otovia Therapeutics, Rrgener Therapeutics, HuidaGene, Akouos, Decibel Therapeutics и Sensorion. В пяти из них для введения полноразмерной ДНК OTOF используется AAV-вектор, а в одном - РНК-редактирование. Details are in the caption following the image



Figure 3 Preclinical research and clinical translation of DFNB9 gene therapy for hereditary deafness.

Qi et al. использовали специфический для волосковых клеток промотор Myo15 для эффективной доставки экзогенных трансгенов во внутренние волосковые клетки мышей и обезьян-синемордых. AAV-OTOF продемонстрировал стабильную и длительную экспрессию полноразмерного OTOF, что привело к восстановлению слуха у взрослых мышей с точечной мутацией Otof в течение как минимум 150 дней, достигнув уровня, сопоставимого с мышами дикого типа. Ни у мышей, ни у обезьян синемордых не наблюдалось явных системных токсических реакций, не было заметно краткосрочных или долгосрочных эффектов на слух, двигательную функцию или память. [5] Результаты двух пациентов с глухотой DFNB9 (5-летний участник (односторонняя инъекция), 8-летний участник (двусторонняя инъекция), NCT05901480) продемонстрировали значительное улучшение слуховой функции на всех речевых частотах через 3 месяца, сравнимое с наблюдаемым в контралатеральных ушах с кохлеарными имплантами и приближающееся к нормальному уровню слуха[14] (Advanced Science, 8 1, 2024). Необходимы дальнейшие долгосрочные наблюдения для изучения потенциального дополнительного влияния на слух в ухе, подвергшемся генотерапии, при использовании слуховых аппаратов и контралатеральных кохлеарных имплантатов до введения препаратов генотерапии.

Аналогичные результаты были получены в исследовании Lv и Wang, в котором оценивалась эффективность и безопасность AAV1-hOTOF у 11 пациентов с мутациями OTOF (ChiCTR2200063181). Однократная интракохлеарная инъекция AAV1-hOTOF через RWM с использованием наружного слухового прохода была проведена у 6 младенцев/детей, а двусторонняя ушная генная терапия - у 5 младенцев/детей. В течение 26-недельного периода наблюдения ни у одного из 11 пациентов не наблюдалось токсических реакций или серьезных нежелательных явлений, а у 10 пациентов наблюдалось восстановление после начала лечения с постепенным усилением эффекта с течением времени[15, 16] (Lancet, 24th 1, 2024; Nature Medicine, 5 6, 2024).

Препарат для генотерапии AK-OTOF, разработанный компанией Akouos, получил одобрение Управления по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств США (FDA) в сентябре 2022 года и в настоящее время проходит фазу 1/2 клинических испытаний (NCT05821959). После введения одной дозы AK-OTOF в одностороннюю улитку первый пациент продемонстрировал полное восстановление слуха на всех исследуемых частотах в течение 30 дней. Был достигнут порог в диапазоне от 65 до 20 дБ HL, причем на некоторых частотах уровень слуха находился в пределах нормы. Как хирургическая процедура дозирования, так и терапия AK-OTOF хорошо переносились без каких-либо серьезных нежелательных явлений.[111]

Компания Decibel Therapeutics использовала AAV1 и Myo15 для направленной экспрессии OTOF, что привело к устойчивому улучшению слуховой функции у мышей в течение как минимум 52 недель. В октябре 2022 года FDA одобрило IND препарата DB-OTO. В исследовании NCT05788536 препарат DB-OTO вводился в улитку односторонне. Во время запланированного контрольного визита пациенты продемонстрировали усиленный слуховой ответ по сравнению с исходным уровнем на 6-й неделе, что было оценено с помощью ABR и поведенческой аудиометрии с чистым тоном [112].

Sensorion использовала двойной вектор AAV6 для эффективной доставки полной последовательности Otof, что привело к трансдукции до 50% во внутренние волосковые клетки и достижению порогов слуха от 40 дБ до 60 дБ у обработанных мышей.[10] Клинические испытания терапевтического потенциала OTOF-GT (SENS-501) были начаты во Франции, Италии и Германии, однако набор пациентов еще не начался.

Используя инструмент для редактирования одного основания РНК CRISPR/Cas13 (emxABE), исследователи успешно восстановили слуховую функцию у гомозиготных мышей с точечным мутантом Otof^Q829X/Q829X, достигнув уровня, сопоставимого с тем, который наблюдается у животных дикого типа. [8] Безопасность и переносимость однократного введения во внутреннее ухо через круглое окно у детей с врожденной глухотой, несущих мутацию Otof^Q829X/Q829X, в настоящее время изучается в рамках зарегистрированного клинического исследования на сайте Clinicaltrials.gov (NCT06025032), однако набор пациентов пока не проводился. Эти результаты подчеркивают эффективность генотерапии в качестве метода лечения наследственной глухоты DFNB9 и дают надежду на применение генотерапии у других людей, страдающих другими типами наследственной тугоухости.

Безопасность является первостепенной задачей в клинических испытаниях генотерапии. Оценка безопасности препаратов для генотерапии внутреннего уха в первую очередь направлена на подтверждение надежности путей доставки лекарств и обеспечение безопасности этих терапевтических агентов. В качестве способа доставки генотерапии исследователи выбрали воздействие на RWM во время операции кохлеарной имплантации. Через три месяца после операции у макак циномолгус не наблюдалось значительного снижения слуха, а также морфологических или патологических изменений в системных органах, что свидетельствует о безопасности доставки AAV[5].

Иммуногенность и тканевой тропизм вирусов AAV были широко изучены. Однако из-за широкой распространенности серотипов AAV в человеческой популяции частота положительных результатов варьирует от 30 до 70 % в зависимости от различных серотипов и экспериментальных когорт [2, 113, 114], поэтому безопасность использования AAV остается предметом серьезного беспокойства. Клиническое исследование, проведенное Lv et al., исключило пациентов, у которых развились AAV1-нейтрализующие антитела в титрах, превышающих 1:2000. У всех участников наблюдалось повышение уровня AAV1-нейтрализующих антител и отрицательный Т-клеточный ответ на капсид AAV1 с исходного уровня до 6-й и 13-й недель [15]. Наличие повышенных концентраций нейтрализующих антител у не реагирующих на них пациентов во время клинических испытаний может способствовать ограниченной терапевтической эффективности.

Не-патогенная природа AAV традиционно считалась общепринятой, однако последние эксперименты и отчеты поставили под сомнение это преобладающее мнение. В частности, исследование, проведенное Gates и др., выявило временную связь между AAV2 и необъяснимыми случаями гепатита.[115] В августе 2022 года компания Novartis подтвердила факт двух летальных исходов в России и Казахстане через 5-6 недель после лечения Zolgensma у пациентов детского возраста. Оба случая были связаны с острой печеночной недостаточностью - известным побочным эффектом, связанным с приемом Zolgensma. Более высокая доза препарата могла стать основным фактором, способствовавшим их заболеваемости. Впоследствии появилось еще одно сообщение из Италии, где у пациента, получавшего Zolgensma, наблюдался гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз, свидетельствующий о чрезмерной иммунной активации после генотерапии спинальной мышечной атрофии. Эти инциденты подчеркивают острую необходимость всестороннего подтверждения и рассмотрения вопросов безопасности AAV. Несмотря на то, что до сих пор не было отмечено никаких неприятных реакций при генотерапии внутреннего уха, важно отметить, что период наблюдения остается ограниченным, а долгосрочное наблюдение за пациентами является обязательным.

Прогресс в генотерапии глухоты был значительным, а ген OTOF стал первым успешным примером и ознаменовал собой большой прорыв, который может послужить катализатором значительных достижений в этой области. В настоящее время исследования в области генотерапии наследственной глухоты по-прежнему сосредоточены в основном вокруг гена OTOF. Такой выбор может быть обусловлен тем, что дефекты в гене OTOF оказывают относительно минимальное влияние на структуру и среду внутреннего уха, что позволяет в значительной степени сохранить целостность волосковых клеток. После восстановления гена OTOF волосковые клетки и слуховые цепи продолжают нормально функционировать. Эти результаты закладывают основу для лечения пациентов с мутациями в гене OTOF.

Несмотря на то, что это самая ранняя генетическая глухота, успешно поддающаяся генотерапии, наследственная DFNB9 все еще ставит несколько вопросов относительно применения таких методов лечения. Эффективность и дозировка генотерапии при DFNB9 не были тщательно изучены, также не проводились долгосрочные испытания безопасности. Очень важно наблюдать за пациентами в течение длительного периода времени, чтобы определить, влияет ли одностороннее введение препарата генотерапии на слуховую функцию на контралатеральной стороне или на другие физиологические функции через кровообращение и спинномозговую жидкость. Кроме того, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять, как различные типы мутаций в OTOF могут влиять на эффективность препарата у пациентов. Различия в восстановлении слуха у пациентов с DFNB9 и их корреляция с возрастом на момент операции ставят вопрос об оптимальном терапевтическом окне для генотерапии в этой популяции. Наконец, поскольку DFNB9 относится к расстройствам спектра слуховой нейропатии, остается неизвестным, может ли генотерапия восстановить распознавание речи и слуховую функцию именно в условиях шума.

DFNB9 - редкое заболевание, которое заслуживает внимания к распространенным наследственным генам глухоты. Мутации GJB2 составляют около 50 % аутосомно-рецессивных мутаций и являются одними из наиболее распространенных несиндромальных мутаций глухоты. Белок Cx26, кодируемый геном GJB2, в основном экспрессируется в опорных клетках, сосудистом стриатуме и спиральном лимбусе.[116] В доклиническом исследовании лечения GJB2 компания Otonomy сообщила, что препарат OTO-825 продемонстрировал эффективность в восстановлении потери слуха в двух животных моделях с помощью одной дозы. В настоящее время компании Sensorion и Akouos также исследуют препараты для генотерапии GJB2, которые пока находятся на ранних стадиях фундаментальных исследований. Decibel Therapeutics продвигает препараты AAV.103*, нацеленные на мутации GJB2, в рамках процесса IND-ENABLING. Однако стратегии лечения, применяемые этими исследовательскими группами, и эффективность этих препаратов для пациентов остаются неизвестными. Многочисленные клинические исследования показали, что несиндромальная глухота, вызванная мутациями в гене GJB2, характеризуется различными клиническими фенотипами, такими как двусторонняя симметрия, возраст начала заболевания, степень глухоты и стабильность.[117] Поэтому людям с различными мутациями в GJB2 может потребоваться индивидуальная точная генотерапия.

Разработка программ генотерапии основывается на всестороннем понимании механизмов, лежащих в основе патогенеза заболевания. DFNB9 - это форма наследственной глухоты, характеризующаяся четко определенным механизмом, при котором мутации в гене OTOF приводят к нарушению проводимости слухового нерва, что в конечном итоге приводит к глухоте. Благодаря четкому патогенезу DFNB9 является единственным наследственным заболеванием глухоты, при котором слух был успешно восстановлен благодаря клиническому применению препаратов генотерапии.

Однако для таких распространенных генов наследственной глухоты, как GJB2 и SLC26A4, механизмы, лежащие в основе глухоты, сложны и не имеют эффективной мышиной модели, способной точно имитировать начало заболевания. У пациентов с GJB2-ассоциированной глухотой сохраняются по крайней мере некоторые слуховые волосковые клетки и нейроны, а потеря слуха обычно находится в диапазоне от умеренной до глубокой. Напротив, у мышей Gjb2-CKO/KO наблюдается большое количество отсутствующих волосковых клеток и нейронов, и они быстро прогрессируют до тяжелой глухоты, что плохо имитирует клинический фенотип.[117] В настоящее время только мутация GJB2 R75W[118] и модель мутантной мыши GJB2 35delG[51], созданная Li и др. с помощью метода компенсации тетраплоидных эмбрионов, относительно хорошо имитируют глухоту человека. Однако для других типов мутаций не существует особенно хороших модельных мышей. Фенотип мутанта SLC26A4 характеризуется пороками развития внутреннего уха. Сообщалось о семи моделях мышей, ни у одной из которых не наблюдалось зоба. Три из этих моделей мышей (Slc26a42Dontuh/2Dontuh, Slc26a4p.C565Y и Slc26a4p. T721M) [119-121] имеют нормальную функцию слуха, а остальные четыре (Slc26a41Dontuh/1Dontuh, Slc26a4p.L236P, Slc26a4loop и Pds-/-)[122-127] имеют умеренное или тяжелое нарушение функции слуха, аномальную вестибулярную функцию и т.д. Поэтому достижение трансформации для них остается сложной задачей.

Кроме того, разнообразный набор экспрессируемых генов глухоты в различных клетках внутреннего уха представляет собой дополнительное препятствие для точной генотерапии, что подчеркивает важность определения вирусных векторов, способных точно воздействовать на эти специфические клетки. Впоследствии подходящая модель мыши была использована для исследования эффективности и безопасности препарата генотерапии, после чего была проведена дальнейшая оценка его биобезопасности у NHP. В клинической практике необходимо создать более надежную систему оценки генотерапии, усовершенствовать механизмы отбора пациентов и критерии оценки эффективности препаратов, оптимизировать хирургический путь доставки препарата во внутреннее ухо и обеспечить стандартизированный послеоперационный уход. Кроме того, долгосрочное наблюдение за пациентом имеет решающее значение для обеспечения безопасности препарата в организме пациента.

Генотерапия на основе AAV представляет собой многообещающий терапевтический подход к лечению наследственной глухоты.