Наследственные кардиомиопатии представляют собой генотипически и фенотипически разнообразную группу заболеваний, которые вносят значительный вклад в заболеваемость и смертность во всех возрастных группах [1,2]. Терапевтический подход к кардиомиопатиям исторически был направлен на лечение нейрогормонального ответа на сердечную недостаточность, а не на лечение основной причины. В последнее время были разработаны методы лечения, ориентированные на конкретное заболевание, например, специфические методы лечения сердечного амилоидоза и гипертрофической кардиомиопатии. Лечение, направленное на генотип, с помощью генотерапии открывает перспективы лечения первопричины наследственной кардиомиопатии [3].
2. Gene therapy approaches
Генная терапия может предоставить функциональную копию дисфункционального гена (замена гена) или действовать путем прямого изменения последовательности ДНК (редактирование генов, (табл. 1).
Table 1. Gene therapy approaches. CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats, DSB: double-stranded break, pegRNA: prime editing guide RNA.
В этом обзоре мы сосредоточимся на ген-заместительных терапиях с использованием адено-ассоциированного вируса (AAV) в качестве вектора доставки, поскольку он используется в последних клинических испытаниях. К ним относятся недавно одобренная FDA генjтерапия на основе AAV для лечения мышечной дистрофии Дюшенна (DMD), а также испытания I и II фазы для лечения болезни Danon и Fabry [[4], [5], [6]]. AAV состоит из одноцепочечной последовательности ДНК, заключенной в не-развивающийся икосаэдрический белковый капсид, и может нести до 4,7 кб генетического материала [7]. Вирусы проникают в клетку через рецептор-опосредованный эндоцитоз и после клеточной транспортировки доставляются в ядро [8]. Они подвергаются вирусной распаковке и последующей сборке шаблона двухцепочечной ДНК из своего одноцепочечного генома, который может быть использован для экспрессии трансгенных продуктов [8,9]. Векторы AAV могут приводить к длительной экспрессии генов, даже если они не интегрируются в геном клетки [9,10]. Устойчивый перенос генов, низкая иммуногенность и цитотоксичность, а также широкий тропизм среди различных вирусных серотипов привели к тому, что векторы AAV стали широко использоваться для доставки генов [9]. Несмотря на прогресс, достигнутый в процессе производства AAV-векторов, и их более низкий воспалительный профиль по сравнению с другими вирусными векторами, иммунные реакции хозяина на компоненты вектора и продукты трансгенов остаются проблемой для эффективности и безопасности генной терапии [11].
3. Immune response to adeno-associated virus (AAV) vectors
Как и другие распространенные патогены, векторы AAV подвержены пред-существующему иммунитету, врожденному иммунитету и адаптивному иммунитету (центральная иллюстрация).
3.1. Pre-existing immunity
Распространенность нейтрализующих антител (Nab), направленных против AAV дикого типа (WT), зависит от возраста и может достигать 45% для широко используемого AAV9 [11]. Предсуществующий иммунитет возникает в результате предыдущего контакта с WT AAV, и даже низкий титр Nab может эффективно нейтрализовать вектор, выступая в качестве барьера для успешного переноса генов, а не для безопасности пациента [11]. Поэтому кандидатов для генной терапии проверяют на наличие Nab, причем титр нейтрализующих антител в диапазоне более 1:40-1:1000 является критерием исключения для клинических испытаний [12,13]. Примечательно, что Nab могут развиваться и после введения AAV-генов, что ограничивает возможность введения эффективных последующих доз [14]. Стратегии, позволяющие обойти эту проблему, включают насыщение Nabs пустыми капсидами, выбор серотипов AAV с меньшей распространенностью предсуществующих Nabs, инженерию AAV с новыми структурами и химическую модификацию капсидов [12].
3.2. Innate immunity
Капсид, геном и трансгенные продукты вызывают различные иммунные реакции. Врожденный иммунитет - это быстрый, не-специфический ответ, который не формирует иммунологическую память [15]. Он инициируется распознаванием патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) макрофагами и нейтрофилами с помощью toll-like receptors (TLRs) и определяет активацию факторов транскрипции NF-kb (ядерный фактор каппа b) и IRF (интерферон-регулирующий фактор), которые вызывают экспрессию провоспалительных цитокинов или интерферонов I типа, соответственно [16]. В контексте генотерапии, доставляемой AAV, капсидные антигены могут служить в качестве PAMP, активирующих TLR2, неметилированные CpG-мотивы в геноме вектора двухцепочечной ДНК могут активировать TLR9, а двухцепочечная РНК может активировать ассоциированный с дифференцировкой меланомы белок 5 (MDA5), вызывающий врожденный иммунитет [10, [17-20]].
3.3. Adaptive immunity
Адаптивный иммунитет начинает действовать через четыре-семь дней после врожденного иммунитета и характеризуется активацией и дифференцировкой Т- и В-лимфоцитов, которые могут уничтожить антиген посредством направленного гуморального или цитотоксического ответа [[21-[23]]. В конечном итоге образуются Т- и В-лимфоциты памяти, которые могут повторно активироваться в случае последующего воздействия антигена [24]. Классический или альтернативный пути активации комплемента могут возникать в ответ на появление антител к компонентам AAV и представляют собой механизм, лежащий в основе тромботической микроангиопатии [14,25]. Антигенпрезентирующие клетки (APC), подвергшиеся воздействию капсидных или трансгенных эпитопов, могут активировать цитотоксические CD8+ T-клетки, которые могут уничтожать AAV-трансдуцированные клетки, сводя на нет терапевтический эффект и повреждая окружающие ткани, вызывая воспаление [26]. Системное и внутримышечное введение, использование вездесущих промоторов, большой, внутриклеточный и высоко гликозилированный трансген, а также низкая гепатоцеллюлярная экспрессия являются факторами риска повышенной иммуногенности трансгенного продукта [27]. В то время как цитолитические ответы на капсидные белки вектора сохраняются только до деградации антигена, ответы CD8+ Т-клеток на трансген продолжаются до удаления всех APCs и Т-клеток или после вмешательства иммуносупрессивных регуляторных Т-клеток [28]. Цитолитические Т-клетки, ассоциированные со снижением экспрессии трансгена, были обнаружены в биоптатах печени после внутримышечной доставки микродистрофина и a-1-антитрипсина [29,30].
4. Immunologic toxicity of AAV gene therapy
К распространенным токсическим эффектам генотерапии с использованием AAV-доставки относятся гепатоксичность и тромботическая микроангиопатия (ТМА). Редким исходом AAV-терапии является миокардит. Токсичность ганглиев дорсальных корешков и гепатоцеллюлярная карцинома также могут возникать и рассматриваются в других источниках [14,31].
4.1. Hepatoxicity
Гепатоксичность - наиболее распространенное побочное явление, наблюдаемое после системного введения векторов AAV [32,33]. Она может проявляться в виде повышения уровня печеночных ферментов (аланиновой трансаминазы [ALT] и аспартатаминотрансаминазы [AST]), печеночной недостаточности и даже смерти [32]. Сродство системно доставляемой AAV-терапии к печени высоко, а воздействие эпитопа облегчается фенестрированным эндотелием печеночных синусоидов [33]. Кроме того, двойное кровоснабжение и медленная hematic скорость потока через синусоиды могут продлить пребывание векторов AAV в печени, что приводит к высоким дозам AAV, обнаруженным в этом районе по сравнению с другими органами [33]. Капсидные белки AAV также могут сохраняться в печени, способствуя отсроченному гепатотоксическому ответу, наблюдаемому при терапии AAV [14]. Гепатоксичность наблюдалась в клинических испытаниях генотерапии на основе AAV для лечения спинальной мышечной атрофии (SMA), Х-сцепленной миотубулярной миопатии (XLMTM) и гемофилии [32].
Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) сообщило, что по крайней мере один случай гепатоксичности произошел примерно у одной трети пациентов, получавших генотерапию SMA на основе AAV9 в дозе 1,1E14 вг/кг [32]. Было описано два случая стероид-реактивной острой печеночной недостаточности с печеночной энцефалопатией и нарушением синтетической функции, а иммунологическая природа этого явления была подтверждена биопсией печени, в которой были обнаружены инфильтраты CD8+ [33,34]. В клиническом исследовании ASPIRO для XLMTM, в котором часто встречаются гепатобилиарные осложнения, гепатоксичность привела к смерти четырех пациентов [25,33]. Первые три смерти произошли при дозах 4,8-7,7E15 vg/кг и характеризовались экстремальным повышением билирубина с последующим повышением трансаминаз, отсутствием реакции на иммуномодуляторы, внутрипеченочным и каникулярным холестазом и вторичным фиброзом без воспалительного инфильтрата на аутопсии [33,35]. Исследование было приостановлено, а затем отменено; через неделю произошла четвертая смерть от гепатоксичности [14,36]. Гепатоксичность также наблюдалась в ходе испытаний направленной на печень генотерапии при гемофилии [33]. Повышение уровня аминотрансфераз, в первую очередь ALT, примерно через один-три месяца после введения вектора AAV коррелировало со снижением активности факторов VIII и IX в нескольких исследованиях [33]. Чаще всего это было связано с цитотоксическим Т-клеточным ответом [22,33,37,38]; хотя также сообщалось о случаях повышения уровня аминотрансфераз без клеточного иммунного ответа с помощью иммуноферментного анализа (ELISPOT) на интерферон-гамма [39,40].
4.2. Thrombotic microangiopathy
Тромботическая микроангиопатия (ТМА) характеризуется повреждением эндотелия и микрососудистым тромбозом, проявляющимся гемолитической анемией, застойной тромбоцитопенией и поражением конечных органов [25]. Клинические испытания компаний Pfizer и Solid Biosciences по оценке микродистрофина, доставляемого с помощью AAV9, для лечения DMD были временно приостановлены из-за возникновения ТМА у четырех из 15 пациентов, получавших генотерапию, которая проявлялась в виде тромбоцитопении, острого почечного повреждения, гемолиза, сердечно-легочного повреждения или их комбинации [41]. Двое пациентов умерли, а двое были успешно вылечены с помощью eculizumab, диализа и/или переливания тромбоцитов [41,42]. В клиническом испытании 1-й фазы генотерапии болезни Данона компания Rocket Pharmaceuticals сообщила о случае ТМА у одного из двух пациентов, получавших высокую дозу препарата (RP-A501, AAV9-доставляемый трансген LAMP2B), который полностью разрешился после применения экулизумаба и гемодиализа [43,44]. Onasemnogene abeparvovec (AAV9-доставляемый трансген SMN1), одобренный FDA препарат для лечения SMA, был связан с 9 случаями ТМА у детей на 1400 пролеченных детей, один из которых привел к летальному исходу [45,46]. В серии из трех пациентов с ТМА после терапии Onasemnogene abeparvovec лечение плазмаферезом у одного пациента, поддерживающей терапией у другого и переливанием крови, eculizumab и увеличением кортикостероидов у третьего пациента успешно разрешило ТМА осложнение [46].
В клиническом исследовании I/II фазы с открытым названием INGLAXA-1 и -2 оценивается безопасность и переносимость 4D-310 (AAV2/6-доставляемой человеческой альфа-галактозидазы A) у пациентов с болезнью Фабри с поражением сердца, получающих или не получающих заместительную ферментную терапию с профилактической иммуносупрессией кортикостероидами [47]. У трех пациентов в этом исследовании возникла преходящая острая ТМА с началом на 3-7 день [47]. Одному пациенту не потребовалось никакого вмешательства, одному было назначено лечение экулизимабом, а одному - экулизумаб и временный диализ [47]. У одного пациента наблюдалась преддозовая активация классического и альтернативного путей, а у двух пациентов - повышенный титр анти-С102 IgM [47]. Таким образом, была выдвинута гипотеза, что предварительное лечение rituximab/sirolimus может предотвратить IgM-ответ и активацию комплемента [47]. У 15 пациентов, получавших предварительное лечение rituximab/sirolimus, по сравнению с 23 пациентами, не получавшими предварительного лечения, анти-AAV9 IgM и IgG после терапии AAV9 не повышались, и, таким образом, комплемент не активировался, предотвращая ТМА [47]. В связи с этими неблагоприятными событиями FDA приостановило программу [5]. Было предложено изменение протокола, включающее применение иммуносупрессивной схемы rituximab/sirolimus, добавление предварительного скрининга на комплемент и исключение пациентов с активацией комплемента до дозирования [5].
4.3. Myocarditis
Миокардит - это воспалительное заболевание миокарда, имеющее несколько этиологий - от токсической до инфекционной и иммунологической [48]. Острый миокардит характеризуется коротким началом симптомов и презентацией (обычно в течение месяца) при повышении тропонинов, нарушениях движения стенок и воспалительном инфильтрате в миокарде (табл. 2).
Таблица 2. Clinical features of acute myocarditis. CK-MB: creatinine kinase-MB, CRP: C-reactive protein, ESR: erythrocyte sedimentation rate, PCR: polymerase chain reaction, RV: right ventricle, LV: left ventricle, EF: ejection fraction.
Хотя миокардит при генотерапии с использованием AAV-генов встречается нечасто, в последнее время он привлек к себе внимание в связи с серьезными побочными реакциями, наблюдавшимися в двух различных испытаниях генотерапии DMD [32]. У двух пациентов, получавших генную терапию PF-06939926 компании Pfizer с использованием вектора AAV9, и у одного пациента, получавшего генотерапию SRP-9001 компании Sarepta с использованием вектора AAVrh74, развился миокардит [49,50]. Используемая доза варьировалась между 1 х E13 и 2 х E14 векторных геномов на килограмм массы тела, а симптомы проявились через 3-6 недель после введения. Миокардит привел к смерти одного из пациентов в неамбулаторной группе исследования компании Pfizer, что привело к приостановке клинических исследований Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США [50]. Признаки миокардита у трех пациентов, участвовавших в этих исследованиях, включали повышенный уровень тропонина, снижение фракции выброса, очаговые нарушения движения стенок при эхокардиографии и повышенный Т2-взвешенный сигнал на магнитно-резонансной томографии сердца (МРТ), проведенной у двух из трех пациентов [49]. Помимо миокардита, у этих пациентов, а также у двух других пациентов, участвовавших в испытании генотерапии DMD, развился тяжелый миозит, проявлявшийся выраженным поражением мышц конечностей, а также слабостью бульбарных и дыхательных мышц, что привело к необходимости проведения временной вентиляционной поддержки у трех из них [49].
После исследования, проведенного внешним комитетом по мониторингу данных, у всех пациентов с миозитом/миокардитом была выявлена последовательная картина мутации, включающая большие делеции в области от экзона 8 до экзона 21 гена DMD [49]. Конструкции микродистрофина, используемые для генотерапии, кодируют эпитопы из экзонов с 8 по 11, экспрессирующие N-концевую доменную петлю 1 - поверхностно-экспонированный, иммуногенный компонент белка дистрофина [49]. Последний у этих пациентов отсутствовал и рассматривался иммунной системой как несамостоятельный. Был сделан вывод, что иммунологический триггер миокардита содержится в трансгенном продукте, а не в самом векторе AAV, и критерии включения в клинические испытания были скорректированы, чтобы исключить пациентов, генетически подверженных риску иммунных реакций [49].
Генотерапия высокой дозой продукта (14 vg на килограмм внутривенного введения рекомбинантного AAV9, содержащего инактивированный Staphylococcus aureus Cas9, слитый с транскрипционным активатором VP64 для повышения транскрипции дистрофина) привело к смерти 27-летнего пациента с поздней стадией DMD [51]. Диагноз был поставлен в возрасте 5 лет, пациентка имела прогрессирующий рестриктивный дефект легких и не могла самостоятельно ходить с 18 лет. Профилактическая иммуносупрессия включала глюкокортикоиды и сиролимус. На первый день после введения вектора у пациента наблюдались преждевременные сокращения желудочков и повышение уровня BNP и NTproBNP, а с третьего дня ему потребовалась не-инвазивная вентиляция легких из-за респираторного ацидоза. На пятый день после введения AAV-терапии фракция выброса левого желудочка снизилась с 55-60 % до 45-50 %, а тропонин I повысился; таким образом, был заподозрен миоперикардит [51]. На шестой день у пациента развился острый респираторный дистресс-синдром ARDS) [51]. Несмотря на лечение многочисленными иммунодепрессантами (глюкокортикоиды, eculizumab, tocilizumab и anakinra), у пациента произошла остановка сердца, он был помещен на экстракорпоральную мембранную оксигенацию и скончался на 8-й день после генотерапии [51]. На вскрытии было обнаружено бивентрикулярное фиброзно-жировое замещение без признаков активного воспаления или миокардита, а в легких наблюдались характерные последствия ARDS [51]. Распределение вектора AAV9 оказалось неожиданно высоким в легочной ткани по сравнению с сердечной и скелетной мышцами [51]. Особенности, характерные для этого пациента, могли способствовать развитию осложнений. Более низкая мышечная масса пациента (45 %) могла привести к относительно большей дозе вектора на ядро мышцы по сравнению с другими исследованиями [51]. В исходном состоянии у него наблюдалась сердечно-легочная дисфункция и ограниченный физиологический резерв, что могло препятствовать восстановлению после ARDS [51].
О миокардите после генной терапии с использованием AAV сообщалось и у не-человекообразных приматов. McTiernan et al. исследовали реакцию на доставку AAV-вектора путем прямой инъекции в сердце взрослых бабуинов [52]. Сравнивая две группы бабуинов, одной из которых вводили AAV-2-конструкцию рецептора фактора некроза опухоли-альфа II IgG-Fc слитого белка (TNFRII-Fc) ( n=4
), а другим вводили эквивалентную дозу пустого капсида AAV-2 ( n=2), миокардит наблюдался у всех бабуинов, получавших терапию TNFRII-Fc, и не наблюдался ни у одного бабуина, получавшего пустой капсид [52]. Миокардит проявлялся изменениями ЭКГ по сравнению с исходным уровнем (выраженная инверсия Т-волны и/или депрессия ST в прекордиальных отведениях) и гистологическим подтверждением воспалительного инфильтрата в миокарде при обычном окрашивании гематоксилином и эозином с увеличением количества CD8+ T-клеток при иммунофлуоресцентном окрашивании [52]. Изменений при эхокардиографии не наблюдалось ни в одной из групп [52]. Данные о большом инфильтрате CD8+ клеток у животных, получавших AAV-TNFRII-Fc, и минимальном инфильтрате у животных, получавших пустой капсид, проявляющемся в поздние сроки (как через 5, так и через 12 недель после введения генотерапии), позволяют предположить, что механизмом развития миокардита у этих животных является адаптивный иммунитет, приводящий к активации цитотоксических Т-клеток [52]. Однако специфический генный продукт, использованный в данном исследовании, подавлял TNF, что могло препятствовать развитию Т-регуляторных клеток, способствующих толерантности к капсидным антигенам AAV [53]. Это могло привести к усилению первоначального врожденного иммунного ответа на вектор AAV с последующим цитотоксическим иммунным ответом, приводящим к миокардиту [53]. Таким образом, биологическое действие этого специфического трансгена, а не иммунный ответ на сам трансген, мог способствовать иммунной активации, приведшей к миокардиту [53].
Аналогичным образом развитие миокардита наблюдалось в недавнем исследовании, в котором проводилась генотерапия болезни Помпе у макак-резусов с использованием вектора AAVhu68, кодирующего человеческую кислотно-альфа-глюкозидазу (hGAA), меченную пептидом инсулиноподобного фактора роста 2 (vIGF2) [54]. У одного из двух животных, получавших низкодозовую генотерапию, и у четырех из девяти животных, получавших высоко дозовую терапию, было обнаружено повышение уровня тропонина I, коррелирующее с гистопатологическими признаками сердечных инфильтратов, богатых CD-8+ Т-клетками, что соответствует заболеваемости миокардитом почти на 50%, независимо от дозовой зависимости [54].
У этих животных наблюдался богатый CD8+ Т-клетками и бедный CD4/FoxP3-позитивными регуляторными Т-клетками инфильтрат в миокарде [54]. С помощью ELISPOT-теста был отмечен более высокий ответ на пул пептидов hGAA у трех из пяти животных, перенесших миокардит [54]. Этим трем животным было проведено генотипирование основного комплекса гистосовместимости (MHC) с помощью глубокого секвенирования, и все они несли по крайней мере один аллель гаплотипа MHC I Mamu-A002.01 [54]. Таким образом, гаплотип MHC I в сочетании с высокой экспрессивностью иммуногенного гена hGAA в сердечной ткани мог способствовать развитию миокардита [54]. Следует отметить, что выводы, сделанные на основе исследований с использованием не-человеческих приматов, в которых человеческие гены переносятся животным, могут увеличить вероятность воздействия не-самостоятельных эпитопов и, следовательно, могут не соответствовать результатам клинических испытаний на людях [54]. Однако в данном исследовании наблюдалась высокая гомология между hGAA и резус-GAA (95% последовательности, 907/952 аминокислот идентичны), что делает менее вероятным, что перенос человеческого гена в организм макак был основной причиной иммунной активации [54].
5. Immunosuppression after AAV gene therapy
![Генная терапия может предоставить функциональную копию дисфункционального гена (замена гена) или действовать путем прямого изменения последовательности ДНК (редактирование генов, (табл. 1). Table 1. Gene therapy approaches. CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats, DSB: double-stranded break, pegRNA: prime editing guide RNA. В этом обзоре мы сосредоточимся на ген-заместительных терапиях с использованием адено-ассоциированного вируса (AAV) в качестве вектора доставки, поскольку он используется в последних клинических испытаниях. К ним относятся недавно одобренная FDA генjтерапия на основе AAV для лечения мышечной дистрофии Дюшенна (DMD), а также испытания I и II фазы для лечения болезни Danon и Fabry [[4], [5], [6]]. AAV состоит из одноцепочечной последовательности ДНК, заключенной в не-развивающийся икосаэдрический белковый капсид, и может нести до 4,7 кб генетического материала [7]. Вирусы проникают в клетку через рецептор-опосредованный эндоцитоз и после клеточной транспортировки доставляются в ядро [8]. Они подвергаются вирусной распаковке и последующей сборке шаблона двухцепочечной ДНК из своего одноцепочечного генома, который может быть использован для экспрессии трансгенных продуктов [8,9]. Векторы AAV могут приводить к длительной экспрессии генов, даже если они не интегрируются в геном клетки [9,10]. Устойчивый перенос генов, низкая иммуногенность и цитотоксичность, а также широкий тропизм среди различных вирусных серотипов привели к тому, что векторы AAV стали широко использоваться для доставки генов [9]. Несмотря на прогресс, достигнутый в процессе производства AAV-векторов, и их более низкий воспалительный профиль по сравнению с другими вирусными векторами, иммунные реакции хозяина на компоненты вектора и продукты трансгенов остаются проблемой для эффективности и безопасности генной терапии [11]. 3. Immune response to adeno-associated virus (AAV) vectors Как и другие распространенные патогены, векторы AAV подвержены пред-существующему иммунитету, врожденному иммунитету и адаптивному иммунитету (центральная иллюстрация). 3.1. Pre-existing immunity Распространенность нейтрализующих антител (Nab), направленных против AAV дикого типа (WT), зависит от возраста и может достигать 45% для широко используемого AAV9 [11]. Предсуществующий иммунитет возникает в результате предыдущего контакта с WT AAV, и даже низкий титр Nab может эффективно нейтрализовать вектор, выступая в качестве барьера для успешного переноса генов, а не для безопасности пациента [11]. Поэтому кандидатов для генной терапии проверяют на наличие Nab, причем титр нейтрализующих антител в диапазоне более 1:40-1:1000 является критерием исключения для клинических испытаний [12,13]. Примечательно, что Nab могут развиваться и после введения AAV-генов, что ограничивает возможность введения эффективных последующих доз [14]. Стратегии, позволяющие обойти эту проблему, включают насыщение Nabs пустыми капсидами, выбор серотипов AAV с меньшей распространенностью предсуществующих Nabs, инженерию AAV с новыми структурами и химическую модификацию капсидов [12]. 3.2. Innate immunity Капсид, геном и трансгенные продукты вызывают различные иммунные реакции. Врожденный иммунитет - это быстрый, не-специфический ответ, который не формирует иммунологическую память [15]. Он инициируется распознаванием патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) макрофагами и нейтрофилами с помощью toll-like receptors (TLRs) и определяет активацию факторов транскрипции NF-kb (ядерный фактор каппа b) и IRF (интерферон-регулирующий фактор), которые вызывают экспрессию провоспалительных цитокинов или интерферонов I типа, соответственно [16]. В контексте генотерапии, доставляемой AAV, капсидные антигены могут служить в качестве PAMP, активирующих TLR2, неметилированные CpG-мотивы в геноме вектора двухцепочечной ДНК могут активировать TLR9, а двухцепочечная РНК может активировать ассоциированный с дифференцировкой меланомы белок 5 (MDA5), вызывающий врожденный иммунитет [10, [17-20]]. 3.3. Adaptive immunity Адаптивный иммунитет начинает действовать через четыре-семь дней после врожденного иммунитета и характеризуется активацией и дифференцировкой Т- и В-лимфоцитов, которые могут уничтожить антиген посредством направленного гуморального или цитотоксического ответа [[21-[23]]. В конечном итоге образуются Т- и В-лимфоциты памяти, которые могут повторно активироваться в случае последующего воздействия антигена [24]. Классический или альтернативный пути активации комплемента могут возникать в ответ на появление антител к компонентам AAV и представляют собой механизм, лежащий в основе тромботической микроангиопатии [14,25]. Антигенпрезентирующие клетки (APC), подвергшиеся воздействию капсидных или трансгенных эпитопов, могут активировать цитотоксические CD8+ T-клетки, которые могут уничтожать AAV-трансдуцированные клетки, сводя на нет терапевтический эффект и повреждая окружающие ткани, вызывая воспаление [26]. Системное и внутримышечное введение, использование вездесущих промоторов, большой, внутриклеточный и высоко гликозилированный трансген, а также низкая гепатоцеллюлярная экспрессия являются факторами риска повышенной иммуногенности трансгенного продукта [27]. В то время как цитолитические ответы на капсидные белки вектора сохраняются только до деградации антигена, ответы CD8+ Т-клеток на трансген продолжаются до удаления всех APCs и Т-клеток или после вмешательства иммуносупрессивных регуляторных Т-клеток [28]. Цитолитические Т-клетки, ассоциированные со снижением экспрессии трансгена, были обнаружены в биоптатах печени после внутримышечной доставки микродистрофина и a-1-антитрипсина [29,30]. 4. Immunologic toxicity of AAV gene therapy К распространенным токсическим эффектам генотерапии с использованием AAV-доставки относятся гепатоксичность и тромботическая микроангиопатия (ТМА). Редким исходом AAV-терапии является миокардит. Токсичность ганглиев дорсальных корешков и гепатоцеллюлярная карцинома также могут возникать и рассматриваются в других источниках [14,31]. 4.1. Hepatoxicity Гепатоксичность - наиболее распространенное побочное явление, наблюдаемое после системного введения векторов AAV [32,33]. Она может проявляться в виде повышения уровня печеночных ферментов (аланиновой трансаминазы [ALT] и аспартатаминотрансаминазы [AST]), печеночной недостаточности и даже смерти [32]. Сродство системно доставляемой AAV-терапии к печени высоко, а воздействие эпитопа облегчается фенестрированным эндотелием печеночных синусоидов [33]. Кроме того, двойное кровоснабжение и медленная hematic скорость потока через синусоиды могут продлить пребывание векторов AAV в печени, что приводит к высоким дозам AAV, обнаруженным в этом районе по сравнению с другими органами [33]. Капсидные белки AAV также могут сохраняться в печени, способствуя отсроченному гепатотоксическому ответу, наблюдаемому при терапии AAV [14]. Гепатоксичность наблюдалась в клинических испытаниях генотерапии на основе AAV для лечения спинальной мышечной атрофии (SMA), Х-сцепленной миотубулярной миопатии (XLMTM) и гемофилии [32]. Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) сообщило, что по крайней мере один случай гепатоксичности произошел примерно у одной трети пациентов, получавших генотерапию SMA на основе AAV9 в дозе 1,1E14 вг/кг [32]. Было описано два случая стероид-реактивной острой печеночной недостаточности с печеночной энцефалопатией и нарушением синтетической функции, а иммунологическая природа этого явления была подтверждена биопсией печени, в которой были обнаружены инфильтраты CD8+ [33,34]. В клиническом исследовании ASPIRO для XLMTM, в котором часто встречаются гепатобилиарные осложнения, гепатоксичность привела к смерти четырех пациентов [25,33]. Первые три смерти произошли при дозах 4,8-7,7E15 vg/кг и характеризовались экстремальным повышением билирубина с последующим повышением трансаминаз, отсутствием реакции на иммуномодуляторы, внутрипеченочным и каникулярным холестазом и вторичным фиброзом без воспалительного инфильтрата на аутопсии [33,35]. Исследование было приостановлено, а затем отменено; через неделю произошла четвертая смерть от гепатоксичности [14,36]. Гепатоксичность также наблюдалась в ходе испытаний направленной на печень генотерапии при гемофилии [33]. Повышение уровня аминотрансфераз, в первую очередь ALT, примерно через один-три месяца после введения вектора AAV коррелировало со снижением активности факторов VIII и IX в нескольких исследованиях [33]. Чаще всего это было связано с цитотоксическим Т-клеточным ответом [22,33,37,38]; хотя также сообщалось о случаях повышения уровня аминотрансфераз без клеточного иммунного ответа с помощью иммуноферментного анализа (ELISPOT) на интерферон-гамма [39,40]. 4.2. Thrombotic microangiopathy Тромботическая микроангиопатия (ТМА) характеризуется повреждением эндотелия и микрососудистым тромбозом, проявляющимся гемолитической анемией, застойной тромбоцитопенией и поражением конечных органов [25]. Клинические испытания компаний Pfizer и Solid Biosciences по оценке микродистрофина, доставляемого с помощью AAV9, для лечения DMD были временно приостановлены из-за возникновения ТМА у четырех из 15 пациентов, получавших генотерапию, которая проявлялась в виде тромбоцитопении, острого почечного повреждения, гемолиза, сердечно-легочного повреждения или их комбинации [41]. Двое пациентов умерли, а двое были успешно вылечены с помощью eculizumab, диализа и/или переливания тромбоцитов [41,42]. В клиническом испытании 1-й фазы генотерапии болезни Данона компания Rocket Pharmaceuticals сообщила о случае ТМА у одного из двух пациентов, получавших высокую дозу препарата (RP-A501, AAV9-доставляемый трансген LAMP2B), который полностью разрешился после применения экулизумаба и гемодиализа [43,44]. Onasemnogene abeparvovec (AAV9-доставляемый трансген SMN1), одобренный FDA препарат для лечения SMA, был связан с 9 случаями ТМА у детей на 1400 пролеченных детей, один из которых привел к летальному исходу [45,46]. В серии из трех пациентов с ТМА после терапии Onasemnogene abeparvovec лечение плазмаферезом у одного пациента, поддерживающей терапией у другого и переливанием крови, eculizumab и увеличением кортикостероидов у третьего пациента успешно разрешило ТМА осложнение [46]. В клиническом исследовании I/II фазы с открытым названием INGLAXA-1 и -2 оценивается безопасность и переносимость 4D-310 (AAV2/6-доставляемой человеческой альфа-галактозидазы A) у пациентов с болезнью Фабри с поражением сердца, получающих или не получающих заместительную ферментную терапию с профилактической иммуносупрессией кортикостероидами [47]. У трех пациентов в этом исследовании возникла преходящая острая ТМА с началом на 3-7 день [47]. Одному пациенту не потребовалось никакого вмешательства, одному было назначено лечение экулизимабом, а одному - экулизумаб и временный диализ [47]. У одного пациента наблюдалась преддозовая активация классического и альтернативного путей, а у двух пациентов - повышенный титр анти-С102 IgM [47]. Таким образом, была выдвинута гипотеза, что предварительное лечение rituximab/sirolimus может предотвратить IgM-ответ и активацию комплемента [47]. У 15 пациентов, получавших предварительное лечение rituximab/sirolimus, по сравнению с 23 пациентами, не получавшими предварительного лечения, анти-AAV9 IgM и IgG после терапии AAV9 не повышались, и, таким образом, комплемент не активировался, предотвращая ТМА [47]. В связи с этими неблагоприятными событиями FDA приостановило программу [5]. Было предложено изменение протокола, включающее применение иммуносупрессивной схемы rituximab/sirolimus, добавление предварительного скрининга на комплемент и исключение пациентов с активацией комплемента до дозирования [5]. 4.3. Myocarditis Миокардит - это воспалительное заболевание миокарда, имеющее несколько этиологий - от токсической до инфекционной и иммунологической [48]. Острый миокардит характеризуется коротким началом симптомов и презентацией (обычно в течение месяца) при повышении тропонинов, нарушениях движения стенок и воспалительном инфильтрате в миокарде (табл. 2). Таблица 2. Clinical features of acute myocarditis. CK-MB: creatinine kinase-MB, CRP: C-reactive protein, ESR: erythrocyte sedimentation rate, PCR: polymerase chain reaction, RV: right ventricle, LV: left ventricle, EF: ejection fraction. Хотя миокардит при генотерапии с использованием AAV-генов встречается нечасто, в последнее время он привлек к себе внимание в связи с серьезными побочными реакциями, наблюдавшимися в двух различных испытаниях генотерапии DMD [32]. У двух пациентов, получавших генную терапию PF-06939926 компании Pfizer с использованием вектора AAV9, и у одного пациента, получавшего генотерапию SRP-9001 компании Sarepta с использованием вектора AAVrh74, развился миокардит [49,50]. Используемая доза варьировалась между 1 х E13 и 2 х E14 векторных геномов на килограмм массы тела, а симптомы проявились через 3-6 недель после введения. Миокардит привел к смерти одного из пациентов в неамбулаторной группе исследования компании Pfizer, что привело к приостановке клинических исследований Управлением по контролю за продуктами и лекарствами США [50]. Признаки миокардита у трех пациентов, участвовавших в этих исследованиях, включали повышенный уровень тропонина, снижение фракции выброса, очаговые нарушения движения стенок при эхокардиографии и повышенный Т2-взвешенный сигнал на магнитно-резонансной томографии сердца (МРТ), проведенной у двух из трех пациентов [49]. Помимо миокардита, у этих пациентов, а также у двух других пациентов, участвовавших в испытании генотерапии DMD, развился тяжелый миозит, проявлявшийся выраженным поражением мышц конечностей, а также слабостью бульбарных и дыхательных мышц, что привело к необходимости проведения временной вентиляционной поддержки у трех из них [49]. После исследования, проведенного внешним комитетом по мониторингу данных, у всех пациентов с миозитом/миокардитом была выявлена последовательная картина мутации, включающая большие делеции в области от экзона 8 до экзона 21 гена DMD [49]. Конструкции микродистрофина, используемые для генотерапии, кодируют эпитопы из экзонов с 8 по 11, экспрессирующие N-концевую доменную петлю 1 - поверхностно-экспонированный, иммуногенный компонент белка дистрофина [49]. Последний у этих пациентов отсутствовал и рассматривался иммунной системой как несамостоятельный. Был сделан вывод, что иммунологический триггер миокардита содержится в трансгенном продукте, а не в самом векторе AAV, и критерии включения в клинические испытания были скорректированы, чтобы исключить пациентов, генетически подверженных риску иммунных реакций [49]. Генотерапия высокой дозой продукта (14 vg на килограмм внутривенного введения рекомбинантного AAV9, содержащего инактивированный Staphylococcus aureus Cas9, слитый с транскрипционным активатором VP64 для повышения транскрипции дистрофина) привело к смерти 27-летнего пациента с поздней стадией DMD [51]. Диагноз был поставлен в возрасте 5 лет, пациентка имела прогрессирующий рестриктивный дефект легких и не могла самостоятельно ходить с 18 лет. Профилактическая иммуносупрессия включала глюкокортикоиды и сиролимус. На первый день после введения вектора у пациента наблюдались преждевременные сокращения желудочков и повышение уровня BNP и NTproBNP, а с третьего дня ему потребовалась не-инвазивная вентиляция легких из-за респираторного ацидоза. На пятый день после введения AAV-терапии фракция выброса левого желудочка снизилась с 55-60 % до 45-50 %, а тропонин I повысился; таким образом, был заподозрен миоперикардит [51]. На шестой день у пациента развился острый респираторный дистресс-синдром ARDS) [51]. Несмотря на лечение многочисленными иммунодепрессантами (глюкокортикоиды, eculizumab, tocilizumab и anakinra), у пациента произошла остановка сердца, он был помещен на экстракорпоральную мембранную оксигенацию и скончался на 8-й день после генотерапии [51]. На вскрытии было обнаружено бивентрикулярное фиброзно-жировое замещение без признаков активного воспаления или миокардита, а в легких наблюдались характерные последствия ARDS [51]. Распределение вектора AAV9 оказалось неожиданно высоким в легочной ткани по сравнению с сердечной и скелетной мышцами [51]. Особенности, характерные для этого пациента, могли способствовать развитию осложнений. Более низкая мышечная масса пациента (45 %) могла привести к относительно большей дозе вектора на ядро мышцы по сравнению с другими исследованиями [51]. В исходном состоянии у него наблюдалась сердечно-легочная дисфункция и ограниченный физиологический резерв, что могло препятствовать восстановлению после ARDS [51]. О миокардите после генной терапии с использованием AAV сообщалось и у не-человекообразных приматов. McTiernan et al. исследовали реакцию на доставку AAV-вектора путем прямой инъекции в сердце взрослых бабуинов [52]. Сравнивая две группы бабуинов, одной из которых вводили AAV-2-конструкцию рецептора фактора некроза опухоли-альфа II IgG-Fc слитого белка (TNFRII-Fc) ( n=4 ), а другим вводили эквивалентную дозу пустого капсида AAV-2 ( n=2), миокардит наблюдался у всех бабуинов, получавших терапию TNFRII-Fc, и не наблюдался ни у одного бабуина, получавшего пустой капсид [52]. Миокардит проявлялся изменениями ЭКГ по сравнению с исходным уровнем (выраженная инверсия Т-волны и/или депрессия ST в прекордиальных отведениях) и гистологическим подтверждением воспалительного инфильтрата в миокарде при обычном окрашивании гематоксилином и эозином с увеличением количества CD8+ T-клеток при иммунофлуоресцентном окрашивании [52]. Изменений при эхокардиографии не наблюдалось ни в одной из групп [52]. Данные о большом инфильтрате CD8+ клеток у животных, получавших AAV-TNFRII-Fc, и минимальном инфильтрате у животных, получавших пустой капсид, проявляющемся в поздние сроки (как через 5, так и через 12 недель после введения генотерапии), позволяют предположить, что механизмом развития миокардита у этих животных является адаптивный иммунитет, приводящий к активации цитотоксических Т-клеток [52]. Однако специфический генный продукт, использованный в данном исследовании, подавлял TNF, что могло препятствовать развитию Т-регуляторных клеток, способствующих толерантности к капсидным антигенам AAV [53]. Это могло привести к усилению первоначального врожденного иммунного ответа на вектор AAV с последующим цитотоксическим иммунным ответом, приводящим к миокардиту [53]. Таким образом, биологическое действие этого специфического трансгена, а не иммунный ответ на сам трансген, мог способствовать иммунной активации, приведшей к миокардиту [53]. Аналогичным образом развитие миокардита наблюдалось в недавнем исследовании, в котором проводилась генотерапия болезни Помпе у макак-резусов с использованием вектора AAVhu68, кодирующего человеческую кислотно-альфа-глюкозидазу (hGAA), меченную пептидом инсулиноподобного фактора роста 2 (vIGF2) [54]. У одного из двух животных, получавших низкодозовую генотерапию, и у четырех из девяти животных, получавших высоко дозовую терапию, было обнаружено повышение уровня тропонина I, коррелирующее с гистопатологическими признаками сердечных инфильтратов, богатых CD-8+ Т-клетками, что соответствует заболеваемости миокардитом почти на 50%, независимо от дозовой зависимости [54]. У этих животных наблюдался богатый CD8+ Т-клетками и бедный CD4/FoxP3-позитивными регуляторными Т-клетками инфильтрат в миокарде [54]. С помощью ELISPOT-теста был отмечен более высокий ответ на пул пептидов hGAA у трех из пяти животных, перенесших миокардит [54]. Этим трем животным было проведено генотипирование основного комплекса гистосовместимости (MHC) с помощью глубокого секвенирования, и все они несли по крайней мере один аллель гаплотипа MHC I Mamu-A002.01 [54]. Таким образом, гаплотип MHC I в сочетании с высокой экспрессивностью иммуногенного гена hGAA в сердечной ткани мог способствовать развитию миокардита [54]. Следует отметить, что выводы, сделанные на основе исследований с использованием не-человеческих приматов, в которых человеческие гены переносятся животным, могут увеличить вероятность воздействия не-самостоятельных эпитопов и, следовательно, могут не соответствовать результатам клинических испытаний на людях [54]. Однако в данном исследовании наблюдалась высокая гомология между hGAA и резус-GAA (95% последовательности, 907/952 аминокислот идентичны), что делает менее вероятным, что перенос человеческого гена в организм макак был основной причиной иммунной активации [54]. 5. Immunosuppression after AAV gene therapy](https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S0167527323017072-ga1.jpg){kind=link}