Генотерапия - это медицинский метод лечения, который заключается во введении, удалении или изменении генетического материала в клетках организма для лечения или профилактики заболеваний (рис. 1). Последние достижения в области генотерапии привели к созданию методов лечения серьезных моногенных заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия, β-талассемия, первичный иммунодефицит и потеря зрения, а также В-клеточного рака, с которыми традиционные подходы не могут справиться (High and Roncarolo, 2019). В настоящее время (по состоянию на 7 ноября 2024 года) в Соединенных Штатах одобрено 11 препаратов генотерапии регулирующим органом (Food and Drug Administration, (FDA)) (https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products).



Fig. 1 Administration routes and delivery platforms for anti-VEGF ocular gene therapy. (A) Delivery routes and LV-/AAV vector-based platforms for ocular gene therapy. (B) Invasion of CNV through Bruch's membrane with consequent disturbances in the normal retinal anatomy (C) Subretinal delivery of vector. (D) Transcription and synthesis of anti-VEGF RNAi in RPE cells. (E) Reduction of VEGF and CNV following anti-angiogenic gene therapy. AAV, adeno-associated virus; AMD, age-related macular degeneration; BrM, Bruch's membrane; CC, choriocapillaris; CNV, choroidal neovascularisation; LV, lentiviral vector; RPE, retinal pigment epithelium; PR OS, photoreceptor outer segments; VEGF, vascular endothelial growth factor. Inspired by (Askou et al., 2023; High and Roncarolo, 2019).

В области глаз совместные усилия фундаментальных и клинических исследователей привели к созданию первой генотерапии с использованием адено-ассоциированного вируса (AAV) на основе препарата voretigene neparvovec (Luxturna, Spark Therapeutics). Препарат направлен на моногенный тип пигментного ретинита, вызванного генетическими вариантами в RPE65, который кодирует важнейший фермент в зрительном цикле (Cideciyan, 2010). Пораженные люди могут потерять зрение уже при рождении, а спонтанное течение заболевания приводит к полной слепоте у большинства пораженных (Cideciyan, 2010). Однако результаты исследований третьей фазы показали, что генотерапия с использованием voretigene neparvovec может улучшить или задержать прогрессирование заболевания у некоторых людей (Russell et al., 2017). Таким образом, опыт лечения RPE65-ассоциированного пигментного ретинита позволил выделить генотерапию сетчатки в качестве важного метода лечения заболеваний сетчатки в XXI веке (Askou et al., 2021). В результате появился растущий список генотерапий, проходящих клинические испытания для лечения AMD и DME (табл. 1), а также 57 исследований для различных наследственных дистрофий сетчатки (ClinicalTrials.gov по состоянию на 7 ноября 2024 года).

Table 1. Active and completed gene therapy-based clinical trials against nAMD, dAMD and DME.

Существует огромный потенциал для распространения опыта терапии, заменяющей дефицитные гены при наследственных заболеваниях сетчатки, на модификацию генов, изменяющую экспрессию молекул, вовлеченных в процессы заболевания сетчатки. Это может включать в себя несколько стратегий в зависимости от терапевтической цели и методологии, необходимой для достижения этой цели.

В центре внимания генной аугментации находится замена дефектного гена на нормальную версию гена, что актуально, когда заболевание вызвано специфической и хорошо известной генетической мутацией. Это может быть актуально в семейных случаях заболеваний сетчатки, которые обычно связаны с возрастом и воздействием, например, в семьях с моногенным риском, связанным с нарушениями в системе комплемента (Tran et al., 2019). Лечение предполагает доставку терапевтического гена (также известного как «трансген») в соответствующую ткань-мишень с последующим введением в клетки для замены или дополнения дефектного гена.

Генотерапия, включая генную аугментацию, часто проводится с помощью вирусных векторов, предназначенных для интеграции здорового гена в один или несколько локусов хромосом, или для доставки не-интегрирующего вектора в долгоживущую постмитотическую или медленно делящуюся клетку (рис. 1). В зависимости от природы клетки-мишени и применяемого промотора обе стратегии могут обеспечить экспрессию терапевтического гена на протяжении всей жизни клетки.

Редактирование генов и замена последовательностей ДНК - еще одна стратегия восстановления функциональности клеток с генетическими изменениями. Этот подход может быть направлен на варианты генов, ответственных за аутосомно-доминантные заболевания, когда патогенный вариант имеет доминантно-негативный или усиленный функциональный эффект и требует аллель-специфического глушения (Hansen et al., 2023). Кроме того, этот метод подходит для генов, слишком больших для доставки с помощью адено-ассоциированного вируса (AAV) (см. ниже). Таким образом, некоторые наследственные заболевания не поддаются простому генному дополнению, и поэтому новые стратегии лечения, основанные на репарации ДНК, являются предметом интереса исследователей и клиницистов во всем мире. Передовым методом редактирования генов и замены последовательностей ДНК является использование технологии clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9), которая позволяет точно редактировать и заменять определенные последовательности в ДНК (Chavez et al., 2023; Chehelgerdi et al., 2024; Hansen et al., 2023; Li et al., 2023; Lin et al., 2020; Wang and Doudna, 2023). Это позволяет точно скорректировать генетические варианты.

Механизм работы CRISPR/Cas9 и появление технологий на основе CRISPR претерпели значительные изменения за последние годы и были рассмотрены в нескольких известных работах (Chavez et al., 2023; Chehelgerdi et al., 2024; Hansen et al., 2023; Li et al., 2023; Lin et al., 2020; Wang and Doudna, 2023).

Вкратце, терапия с помощью редактирования генов, в частности с использованием CRISPR/Cas9, показала свою перспективность для коррекции генетических нарушений в сетчатке. Среди них EDIT-101 (AGN-151587) прошел I/II фазу испытаний (BRILLIANCE) для лечения врожденного амавроза Лебера 10 типа без каких-либо сообщений о серьезных побочных эффектах. Кроме того, есть доказательства того, что EDIT-101 может вызывать продуктивное редактирование генов in vivo, синтезируя терапевтические уровни белка CEP290 и улучшая функцию колбочковых фоторецепторов (Maeder et al., 2019). Это достижение основано на технологии CRISPR/Cas9, которая изменила редактирование и геномную инженерию по сравнению с предыдущими подходами, основанными на ДНК-связывающей дизайнерской нуклеазе. Новаторское открытие CRISPR принесло Jennifer Doudna и Emmanuelle Charpentier Нобелевскую премию по химии 2020 года (Doudna and Charpentier, 2014). Технология состоит из двух основных компонентов: (i) эндонуклеазы Cas9 и (ii) единичной направляющей РНК (sgRNA), которая направляет комплекс к целевой последовательности ДНК. После связывания с мишенью CRISPR/Cas9 комплекс способен создавать двунитевые разрывы (DSB). Это позволяет осуществлять направленное редактирование генов через подверженное ошибкам соединение не-гомологичных концов (NHEJ) или через неэффективную гомологичную направленную репарацию (HDR).

Рисками подхода CRISPR являются внецелевые эффекты и хромосомные перестройки (Doudna, 2020; Lieber, 2008, 2010; Yu and Wu, 2018). Для преодоления этих проблем были разработаны DSB-независимые методы, такие как редактирование оснований и прайминг (Anzalone et al., 2019; Gaudelli et al., 2017; Komor et al., 2016). Редакторы оснований преобразуют определенные основания, но ограничены «посторонним редактированием» и ограниченным окном редактирования (Rees and Liu, 2018). Прайм-редактирование было представлено в 2019 году и предлагает более широкие возможности, включая исправление точечных мутаций, инсерций и делеций без DSB, что потенциально может исправить 89 % генетических вариантов человека (Anzalone et al., 2019). Хотя первые исследования показали многообещающие результаты, все еще существует недостаточная эффективность, которая ограничивает клиническое применение этого метода при наследственных заболеваниях сетчатки. При заболеваниях с небольшой популяцией пациентов, как показало испытание BRILLIANCE, разработчики могут быть вынуждены приостановить набор пациентов и начать более широкое сотрудничество, чтобы продвинуть разработку таких методов лечения, как EDIT-101. Это может привести к задержке клинического применения.

Генотерапия также может быть использована для изменения экспрессии белков (рис. 1B-D). Этого можно достичь путем введения генетического материала, который, например, снижает экспрессию определенного гена с последующим уменьшением количества соответствующего белка. Как и в случае увеличения генов, применение интегрирующих или не-интегрирующих вирусных векторов обеспечивает оптимальную экспрессию терапевтического гена на протяжении всей жизни клетки (рис. 1А). Распространенным методом является использование компонентов пути РНК-интерференции (RNAi) (рис. 2А и Б), описанного Andrew Fire и Craig Mello более 25 лет назад (Fire et al., 1998). За свое открытие они были удостоены Нобелевской премии по физике и медицине в 2006 году. Снижение активности специфических генов, имеющих значение для глазной генотерапии, эффективно достигается с помощью малых интерферирующих РНК (siRNA), коротких шпилечных РНК (shRNA), микроРНК (miRNA) или генов, кодирующих, например, эффекторные молекулы на основе siRNA/miRNA (Corydon et al., 2023). Эти молекулы вызывают нокдаун специфических генов, уничтожая молекулы РНК-мишени путем комплементарного сопряжения оснований (рис. 2A и B).



Fig. 2. Summary of the RNAi mechanism and viral vector-based delivery of RNAi therapeutics. (A) LV- and AAV vector-based delivery of genes encoding shRNA- and agshRNA-based RNAi therapeutics. Following expression, the RNAi therapeutics are transported from the nucleus to the cytoplasm via a XPO5-based mechanism. (B) RNAi pathway and formation of RNAi therapeutics that are loaded into RISC to mediate homology-dependent degradation of target mRNA (magenta). The shRNA hairpin, composed of a target strand (blue) and a passenger strand (red), is processed both by the Dicer enzyme. Consequently, both strands may be loaded into RISC giving rise to either silencing of the target gene (PTGS) or off-targeting delivered by e.g. the passenger strand. (C) The activity from the co-delivered passenger strand of the hairpin is eliminated resulting in the formation of only the target strand from the agshRNA hairpin. AAV, adeno-associated virus; Ago2, Argunaute2; agshRNA, ago2-dependent shRNA; LV, lentiviral vector; PTGS, post-transcriptional gene silencing; RISC, RNA-induced silencing complex; RNA pol III, RNA polymerase III; shRNA, short hairpin RNA.

Препараты на основе RNAi набрали значительные обороты, что привело к одобрению пяти терапевтических средств для лечения тяжелых системных заболеваний (Corydon et al., 2023). Накопленный к настоящему времени опыт позволяет предположить, что RNAi может способствовать революции в методах лечения заболеваний сетчатки, а специфическое нацеливание на гены через эндогенный механизм миРНК обладает не имеющим аналогов потенциалом. В связи с этим механизм RNAi и разработка RNAi-терапевтических препаратов были широко изучены и недавно рассмотрены в нескольких известных работах (Hu et al., 2020; Lin et al., 2020; Mencia et al., 2023; Setten et al., 2019; Traber and Yu, 2023).

Очень важно, чтобы трансген, независимо от того, предназначен ли он для замены ДНК или для вмешательства в синтез белка, мог быть доставлен в физиологически значимую целевую ткань (ткани), чтобы он мог достичь стабильной экспрессии и чтобы сохранялась функциональная целостность клеток-мишеней. Это предъявляет требования к платформе, необходимой для доставки генного материала. Существует две основные платформы доставки, основанные на интегрирующих или неинтегрирующих векторах.

AAV является примером не-интегрирующей векторной платформы доставки, которая может быть использована в глазу. Рекомбинантные векторы AAV сконструированы из не-патогенного и не-развивающегося парвовируса. При использовании соответствующего промотора терапевтический ген помещается между двумя не-кодирующими вирусными упаковочными сигналами для создания вектора (рис. 1). Эффективность упаковки трансгена в вектор значительно снижается для последовательностей ДНК длиной более 4,7 кб, что является одним из немногих ограничений системы доставки AAV-векторов. Это ограничение можно обойти, разделив интересующий ген на две части, которые будут упакованы в отдельные AAV-векторы. Такой подход с использованием двух AAV-векторов часто приводит к низкой или умеренной эффективности восстановления (Carvalho et al., 2017; Tornabene et al., 2019; Trapani et al., 2014), хотя значительные улучшения в восстановлении больших кодирующих последовательностей были достигнуты благодаря использованию, например, систем на основе транс-сплайсинга мРНК (Riedmayr et al., 2023).

В настоящее время существует шесть препаратов на основе векторов AAV, получивших разрешение на коммерческое использование для лечения заболеваний различных органов, включая глаз (Blair, 2022; Dunbar et al., 2018; Heo, 2023; Keeler and Flotte, 2019; Tai et al., 2022; Yld-Herttuala, 2012), а по состоянию на 27 августа 2024 года на сайте ClinicalTrials.gov было зарегистрировано 200 интервенционных клинических испытаний с использованием AAV. Клинические испытания, направленные на лечение AMD и DME, преимущественно используют AAV для доставки трансгена (Таблица 1) (Askou et al., 2023).

Рекомбинантные лентивирусные векторы (LV) - это интегрирующие векторы с профилем доставки трансгенов, имеющим значительный потенциал для клинического применения (Arsenijevic et al., 2022). Лентивирусы - это подкласс ретровирусов, содержащих РНК-геномы, которые могут переносить гены как в делящиеся, так и в неделящиеся клетки (рис. 1А). LV создаются путем замены ретровирусных генов на терапевтическую экспрессионную кассету, содержащую промотор и интересующий ген. Преимуществами LV для лечения глазных заболеваний являются большая продолжительность экспрессии и высокая емкость упаковки генома (около 9 кб). Этот потенциал особенно привлекателен для мультигенной антиангиогенной генотерапии или редактирования генов, что может быть актуально для лечения заболеваний сетчатки, когда терапия направлена на несколько генов. Трансдукция на основе LV в клетки сетчатки часто более изменчива, а успешное проникновение при заболеваниях сетчатки может зависеть от расстояния диффузии в ткани, которое может быть увеличено в условиях увеличения объема ткани, таких как отек, кровоизлияние и пролиферация клеток, и уменьшено в условиях атрофической потери ткани (Arsenijevic et al., 2022). Важным направлением развития является повышение селективности LV, что, как ожидается, позволит расширить круг глазных заболеваний, которые можно лечить с помощью генотерапии.

Другим популярным типом вирусных векторов, который широко используется в клинических испытаниях, является аденовирусный вектор (Bulcha et al., 2021). Хотя аденовирусные векторы обеспечивают очень большую емкость упаковки (26-45 кб) и обладают широким тропизмом, позволяющим инфицировать многие типы клеток, эта платформа доставки сопряжена с риском вызвать сильный иммунный ответ. Поэтому в настоящее время аденовирусные векторы не являются привлекательным выбором платформы для генотерапии сетчатки.

Для доставки генетического материала в сетчатку также были исследованы не-вирусные платформы доставки, основанные на физических методах, таких как электропорация, или химических методах, таких как системы на основе липидов. Несмотря на определенный прогресс в развитии этих технологий (Holmgaard et al., 2021), результаты в целом не обнадеживают (Oliveira et al., 2017). Для того чтобы не-вирусная доставка стала клинической платформой для генотерапии сетчатки, необходимы дальнейшие усовершенствования, например, на основе (i) липидных наночастиц (LNPs) (Gautam et al., 2023) лентивирусных наночастиц (LVNPs) (Haldrup et al., 2023) или (ii) нейропротекторных пептидов, доставляемых топически.

Окулярная генотерапия требует рассмотрения нескольких вопросов безопасности. Потенциальные неблагоприятные эффекты генного материала включают глушение других генов, мутагенез, сверхэкспрессию или дисрегуляцию производства трансгена (фенотоксичность), неадекватные иммунные реакции (иммунотоксичность), а также передачу инфекции домашним контактам и потомству. В настоящее время очевидно, что основные риски, связанные с интеграцией векторов, обусловлены их потенциалом к инсерционному мутагенезу. Это происходит, когда вектор встраивается в ДНК клетки и нарушает функциональный элемент, например ген (Braun et al., 2014; Hacein-Bey-Abina et al., 2003; High and Roncarolo, 2019; Howe et al., 2008; Ott et al., 2006). Чтобы снизить риск инсерционного мутагенеза, были разработаны более безопасные LV третьего поколения (см. ниже) (Dull et al., 1998). Кроме того, стимуляция иммунных реакций (Anguela and High, 2019; Bainbridge et al., 2015; Bouquet et al., 2019; Raper et al., 2003) была решена с помощью адъювантной иммуномодуляции (Dunbar et al., 2018).

Эти корректировки значительно изменили риски осложнений при генотерапии (Corrigan-Curay et al., 2012; Manno et al., 2006; Mingozzi et al., 2007), а недавний обзор случаев, подвергшихся генотерапии AAV, охватывающий более 3000 пациентов, пролеченных за более чем 20 лет, позволяет сделать вывод, что генотерапия AAV является безопасным, хорошо переносимым и эффективным методом лечения (Kuzmin et al., 2021). Также было показано, что LV обладают ограниченной генотоксичностью, особенно в не-делящихся глазных клетках (Arsenijevic et al., 2022; Campochiaro et al., 2017; Parker et al., 2022). Дальнейшие исследования безопасности должны быть сосредоточены на длительности клинического ответа, который в идеале должен наблюдаться в течение всей жизни.

Хотя векторы LV и AAV не способны к непрерывной репликации, существует теоретический риск восстановления или мобилизации вируса дикого типа, способного к репликации, если вектор и вирус дикого типа будут инфицировать одну и ту же ткань. Кроме того, может произойти контаминация векторного препарата вирусом, компетентным к репликации (Marcucci et al., 2018). Для предотвращения этих рисков требуется строгий контроль качества промышленных процессов, связанных с синтезом векторов и генов.

Системы LV третьего поколения включают в себя несколько функций безопасности, которые превосходят системы второго поколения (Dull et al., 1998; Gandara et al., 2018). Вирусный ген tat, необходимый для репликации HIV-1 дикого типа, был удален. Функции упаковки вектора распределены между тремя отдельными плазмидами, а не двумя, что минимизирует риск рекомбинации во время амплификации плазмид и производства вирусного вектора. Кроме того, измененная последовательность 3' длинного терминального повтора (LTR), несущая делецию вирусного промотора, делает вектор «самоинактивирующимся». Это предотвращает повторную упаковку интегрированных генов и уменьшает нарушения в работе соседних генов из-за отсутствия сильных вирусных энхансеров. Вместо родного оболочечного белка HIV-1 используется гетерологичный поверхностный белок (например, VSV-G). В настоящее время VSV-G является наиболее широко используемым гликопротеином для псевдотипирования лентивирусных векторов, поскольку он позволяет трансдуцировать более широкий спектр типов клеток (Dull et al., 1998; Gandara et al., 2018).

Глаз является идеальной мишенью для генотерапии благодаря плотному барьеру с окружающими органами, что позволяет точно доставлять вектор к клеткам сетчатки. Это снижает системное воздействие и обеспечивает иммунную привилегию против препаратов, доставленных в глаз. Кроме того, оптическая прозрачность преломляющих сред и сетчатки способствует видимости флуоресцентных репортерных белков, экспрессируемых одновременно с вектором генотерапии в экспериментальных исследованиях, и позволяет неинвазивно оценивать эффект с помощью электроретинографии (ЭРГ), фундускопии и оптической когерентной томографии (ОКТ) in vivo (Fishman et al., 2005). Параллельно с этими стандартно используемыми в клинике методами новые поведенческие методики, такие как анализ оптомоторных реакций (OMR), становятся ценными и универсальными инструментами для изучения фенотипов и поиска новых лекарств для лечения глазных заболеваний (Shi et al., 2018). Другие поведенческие методы, используемые для оценки эффективности лечения, включают Y-лабиринт, который позволяет измерить кратковременную пространственную память животных (Maurice et al., 1994). OMR и Y-лабиринт имеют такие преимущества, как высокая чувствительность, быстрое тестирование, опора на врожденные реакции и возможность проведения исследований на неанестезированных животных без обучения (Gudapati et al., 2020). Наконец, небольшой размер глаза по сравнению с другими органами предполагает, что клинический эффект может быть достигнут при низких дозах вектора, а поверхностное расположение в теле подразумевает, что векторы могут быть введены непосредственно в клеточную мишень в глазу.

Генотерапия может быть доставлена путем инъекции в субретинальное или супрахороидальное пространство или в стекловидное тело и может привести к трансдукции генного материала в другие типы клеток, помимо клеток RPE, включая фоторецепторы (рис. 1А). Нацеливание на такие специфические типы клеток может быть облегчено выбором серотипа, обладающего сродством к этим клеткам (Lebherz et al., 2008; Luo et al., 2024). В других экспериментах введение LV в супрахороидальное пространство (Luo et al., 2024) или стекловидное тело (Kellish et al., 2023) было эффективным для воздействия как на фоторецепторы, так и на клетки трабекулярной сетки, хотя эффективность этого метода оспаривается. Супрахороидальная инъекция AAV2.8-GFP в глаза крыс, не-человекообразных приматов и свиней приводит к широкой экспрессии GFP (Ding et al., 2019). Другие исследования показывают, что супрахороидальная доставка AAV2.8 приводит к диффузной, периферической экспрессии в клетках RPE, но вызывает локальную инфильтрацию воспалительных клеток (Yiu et al., 2020). Кроме того, AAV2.8 может трансдуцировать фоторецепторные клетки после супрахороидального переноса. Простота способа введения в стекловидное тело подразумевает, что процедура может быть проведена в амбулаторных условиях. Эти преимущества в сочетании со всесторонним пониманием молекулярных механизмов, лежащих в основе заболеваний сетчатки, внесли значительный вклад в развитие генотерапии в глазу (Bennett, 2003).

Серотипы AAVs различаются по своей способности воздействовать на определенные типы клеток, что называется тропизмом. Поскольку дефекты фоторецепторов являются основной причиной наследственных заболеваний сетчатки, очень важно определить серотипы AAV, которые могут эффективно воздействовать на фоторецепторы. Было показано, что AAV2 подходит для этой цели благодаря своей способности трансдуцировать фоторецепторы и RPE через взаимодействие с гепарансульфатным протеогликаном (HSPG), рецептором фактора роста фибробластов 1 (FGFR1) и интегрином αVβ5 (Ali et al., 1996).

Доставка генов может быть улучшена с помощью рекомбинантных векторов AAV, таких как AAV2.8, которые объединяют геном AAV2 с капсидами других серотипов и тем самым улучшают трансдукцию и снижают иммунные реакции. Современные методы, включая направленную эволюцию и вставки пептидных библиотек, могут помочь в разработке AAV с оптимизированными свойствами. Специфические модификации, такие как мутация тирозина в фенилаланин (Y-F) в AAV2, могут предотвратить деградацию под действием клеточных процессов и повысить эффективность трансдукции (Petrs-Silva et al., 2009).

За последнее десятилетие значительный прогресс в доклинических исследованиях позволил определить, какие серотипы AAV и методы введения наиболее эффективны для доставки генов в ключевые типы глазных клеток (Xia and Guo, 2023). Нацеливание на клетки RPE путем субретинальной инъекции может быть достигнуто с помощью AAV, которые включают AAV2.2, AAV2.4, AAV2.5 и AAV2.8. Среди них AV2.R100 показал самую высокую эффективность при интравитреальном введении. Фоторецепторы эффективно поражаются AAV2.2, AAV2tYF, AAV2.5 и AAV2.8 после субретинального введения, а AAV2.R100, AAV2.7m8, AAV.GL и AAV2.NN демонстрируют высокую эффективность после интравитреального введения.

Наиболее эффективными серотипами, нацеленными на клетки RPE после интравитреальной инъекции, являются AAV2.R100, AAV2.7m8, AAV-LSV1 и AAV2.2, а в лабораторных исследованиях этот путь введения был признан эффективным при использовании AAV.ShH10(YF), AAV.ShH13 и AAV7m8. Однако глиальные клетки Müller лучше всего поддаются воздействию AAV2/1 и AAV2/9 после субретинальной инъекции. Трансдукция клеток трабекулярной сетчатой оболочки оказалась сложной, причем эффективными оказались только самокомплементарные (sc) векторы AAV2. Трансдукция других типов глазных клеток, таких как клетки цилиарного эпителия, эндотелиальные клетки сосудов или перициты, менее эффективна (Xia and Guo, 2023).

Значительное внимание уделяется трем инновационным вариантам векторов адено-ассоциированного вируса (AAV) - AAVDJ, AAVrh10 и Anc80. Каждый из этих векторов был разработан для расширения возможностей генотерапии с помощью различных и передовых инженерных подходов. AAVDJ создан путем перетасовки ДНК и направленной эволюции. Эти методы объединяют генетические элементы нескольких серотипов AAV для создания гибридного вектора с повышенной инфекционностью и целевой тканевой специфичностью. Вектор AAVDV эффективно трансдуцирует внутреннюю и внешнюю сетчатку мыши, не вызывая функциональной токсичности (Katada et al., 2019). AAVrh10 получен из AAV, выделенных из не-человеческих видов, и обеспечивает уникальное преимущество для терапии у человека. Вектор способен трансдуцировать наружные клетки сетчатки у грызунов и кроликов после интравитреальной инъекции (Zeng et al., 2019). Поэтому вектор AAVrh10 может быть полезным кандидатом для интравитреальной доставки генов в клетки фоторецепторов и RPE. Использование AAVrh10 от разных видов животных может предотвратить иммунные реакции, которые вызывают AAV, специфичные для человека. Это может привести к более стабильной и длительной экспрессии генов у пациентов и стать перспективным вариантом для пациентов, у которых выработался иммунитет к обычным человеческим AAV. Anc80 был разработан методом реконструкции предковых последовательностей и представляет собой подход, позволяющий предсказывать и реконструировать древние последовательности AAV. Этот метод направлен на воссоздание стабильной версии AAV, которая нацелена на широкий спектр типов клеток и обладает повышенной инфекционностью и безопасностью для применения у человека. Было показано, что в мышиной сетчатке Anc80L65 нацелен на пигментный эпителий сетчатки и фоторецепторы, причем сродство к фоторецепторам колбочкам сопоставимо с другими AAV (Carvalho et al., 2018).

В совокупности можно сделать вывод, что векторы, имеющие актуальное значение для доклинической генотерапии сетчатки, - это рекомбинантные AAV2.2, AAV2.5, AAV2.8, AAV-LSV1 и AAV2.7m8.

Разработка новой генотерапии обычно состоит из нескольких этапов, начиная с клеточных исследований и исследований на животных тканях, которые переходят в исследования на человеческих тканях и затем в клинические испытания. При лечении моногенных заболеваний сетчатки успех терапии можно оценить по ее способности предотвращать или замедлять клиническое течение заболевания на животных моделях и в клинике. Однако разработка новых методов лечения приобретенных или старческих заболеваний, вызванных патологической экспрессией генов, затруднена из-за того, что животных моделей для этих заболеваний мало. Для изучения патологической неоваскуляризации в основном используются две модели, одна из которых основана на экспрессии генов, а другая - на разрыве мембраны Бруха в результате травматического вмешательства или лазерной фотокоагуляции. В первой модели используются трансгенные мыши, у которых CNV развивается в результате избыточной экспрессии VEGF (Kokki et al., 2018). Однако ключевым элементом формирования CNVs при AMD является изменение структурной целостности мембраны Бруха с последующей инвазией хороидальных сосудов в виде CNVs в сетчатку. Поэтому разрушение барьерных свойств мембраны Бруха под воздействием внешних травм было введено в качестве другой модели CNV у экспериментальных животных.

Лазер-индуцированная CNV - наиболее часто используемая животная модель на мышах и крысах (Fabian-Jessing et al., 2022). Кроме того, для изучения лазерно-индуцированной CNV можно использовать более крупных животных, таких как домашние свиньи (Hansen et al., 2021; Jakobsen et al., 2023; Kiilgaard et al., 2005) и NHPs приматы (Goody et al., 2011). Эти животные имеют большее сходство с человеком, что позволяет создать условия, приближенные к клинической ситуации. Поэтому эти модели имеют решающее значение для нашего понимания формирования CNV и для разработки анти-VEGF терапии и других инновационных методов лечения.

Физиология и патофизиология сетчатки у мышей и людей заметно различаются, что может повлиять на поглощение вектора. Кроме того, генотерапия у мышей в некоторых случаях назначается сразу после рождения, что соответствует внутриутробному лечению у человека. Клинические испытания показали, что, несмотря на эффективную доставку трансгенов в сетчатку (при рецессивных заболеваниях), терапевтический эффект может быть непродолжительным, поскольку дегенеративный процесс не останавливается (Cideciyan et al., 2013). Существуют значительные различия во врожденном и адаптивном иммунном ответе у разных видов, что актуально, поскольку большинство векторов получены из «человеческих» AAV. Поэтому вполне вероятно, что нейтрализующие антитела играют гораздо большую роль в клинических испытаниях, чем в животных моделях. Эти проблемы подчеркивают сложность перевода результатов, полученных на животных моделях, на генную терапию у людей.

Оценка эффективности и трансляционного потенциала новых методов лечения проводится на мышах, но также требует использования крупных животных моделей, таких как собаки, свиньи и NHP. Однако даже при эффективной трансдукции в этих моделях результаты не всегда можно без проблем перенести на человека. Для некоторых дистрофий сетчатки проблема выходит за рамки эффективности трансдукции и включает в себя диссоциацию между структурой и функцией (Askou et al., 2021). Это особенно очевидно для пациентов с RPE65, где «нормализация» метаболизма в зрительном пигменте может улучшить зрение. В других случаях терапия может лишь замедлить процесс дегенерации. Перенос результатов исследований на животных, направленных на ранние стадии заболевания, также затруднен, когда болезнь человека поражается на поздних стадиях (Acland et al., 2005; Bennicelli et al., 2008). Поэтому, несмотря на многообещающие доклинические результаты на крупных животных моделях, успешный перевод на лечение людей все еще ожидается.

Выбор промотора для генотерапии должен быть тщательно продуман. Например, в ДНК AAV для достижения эффективного уровня экспрессии необходимо, чтобы промотор располагался перед кодирующей последовательностью трансгена. Кроме того, чтобы обеспечить специфическую экспрессию, промотор должен быть адаптирован к типу клеток-мишеней. В качестве примера можно привести промотор цитомегаловируса человека (CMV), широко используемый в доклинических и клинических исследованиях, который может обеспечивать экспрессию как в фоторецепторах, так и в клетках RPE, а промотор опсина человека подходит для обеспечения экспрессии гена в колбочках (Li et al., 2008).

Промоторы Pol II отвечают за транскрипцию большинства генов у эукариот, в то время как промоторы Pol III участвуют в транскрипции нескольких классов не-кодирующих РНК. Промотор U6 относится к последней категории и широко используется для экспрессии shRNAs и сгРНК в широком спектре тканей. Промоторы Pol II, часто используемые в векторах для наращивания генов, включают CMV, вирус саркомы Роуса (RSV), вирус симуляции 40 (SV40) и фактор элонгации 1a (EF1a) млекопитающих. Все они являются вездесущими промоторами и, как правило, обеспечивают высокую экспрессию трансгена.

Использование тканеспецифичных промоторов Pol II в экспрессионной кассете может ограничить нежелательную экспрессию трансгена, что придает вектору важную функцию безопасности. В соответствии с этим для разработки генотерапии сетчатки были использованы промоторы, специфичные для RPE, колбочек и палочек, включая промотор вителлиформной макулярной дистрофии (VMD2), промотор L-опсина (PR1.7) и промотор фосфодиэстеразы 6B (PDE6B) (Askou et al., 2019; McClements et al., 2022; Ye et al., 2016). К сожалению, тканеспецифичные промоторы Pol III недоступны, но первичные каркасы миРНК (pri-miRNA) могут обеспечить тканеспецифичную экспрессию миРНК (Alsing et al., 2022). Активность промоторов в животных моделях может отличаться от таковой у людей. Это может побудить использовать промоторы, которые уже одобрены или протестированы в клинических условиях.

Вклад авторов в развитие генотерапии глазных заболеваний был направлен на достижение устойчивого подавления VEGFA на основе RNAi с целью ингибирования синтеза CNV (Corydon et al., 2023; Elbashir et al., 2001; Fire et al., 1998; Lin et al., 2020). Мы использовали shRNAs в сочетании с доставкой AAV для получения целевой экспрессии мощных генных регуляторных молекул (Askou et al., 2012).

Эффективность анти-VEGFA shRNA проверяли в клетках RPE человека, а для доставки in vivo наиболее мощной shRNA (обозначенной как sh9) векторы AAV упаковывали в капсид серотипа 8 (AAV2.8). Экспрессия молекул sh9 обеспечивалась промотором U6 человека. В мышиной модели, вызванной лазерным излучением, субретинальная доставка вектора на основе AAV2.8 уменьшила размер CNV на 48 %, продемонстрировав потенциал устойчивой анти-VEGFA терапии на основе RNAi (Askou et al., 2012). В этих исследованиях впервые было показано надежное ингибирование CNV с помощью shRNAs, доставляемых с помощью AAV, что подтверждает результаты доставки голых молекул siRNA или аденовирусных векторов, кодирующих shRNAs которые оба направлены против VEGF (Cashman et al., 2006; Reich et al., 2003).

На основе этих результатов мы разработали мультигенный вектор, который позволяет экспрессировать РНК и транслируемые белки с антиангиогенным действием вместе с флуоресцентным репортером (Askou et al., 2015). Насколько нам известно, это первое исследование, в котором использовался термин «мультигенный вектор» применительно к генотерапии глазной неоваскуляризации. Целью исследования было изучить, как можно сочетать глушение синтеза VEGFA на основе миРНК с доставкой терапевтических белков (рис. 3), и было доказано, что можно одновременно воздействовать на несколько областей в одной мРНК или на несколько разных генов. Важно отметить, что мультигенный вектор для антиангиогенотерапии предназначен для экспрессии анти-VEGFA миРНК и терапевтических белков с одного промотора (Askou et al., 2015).



Fig. 3. Outline of “multigenic gene therapy”. The multigenic AAV vector is designed to deliver simultaneous expression of anti-VEGFA miRNAs and e.g. the secreted, antiangiogenic protein PEDF from a single promoter. Targeting of additional pathways or biological processes involved in the pathogenesis of nAMD might be achieved by this strategy. The genetic elements encoding the different therapeutics are shown either by two boxes (coloured orange and purple), representing “dual therapy”, or three boxes (coloured orange, rose, and purple), illustrating “triple therapy”. For visual inspection purposes the multigenic AAV vector also carry a GFP-expression cassette (not shown). The yellow arrow denotes the promoter driving the expression of the multigenic cassette. AAV, adeno-associated virus; CNV, choroidal neovascularisation; miRNA, microRNA; PEDF, pigment epithelium-derived factor; VEGF, vascular epithelial growth factor. The figure was inspired by (Askou et al., 2021) and created using BioRender.com.

Для одновременной доставки нескольких генов требовался большой размер мультигенной экспрессионной кассеты. Поэтому в основу применяемого вектора была положена лентивирусная система доставки. Исследование продемонстрировало эффективное подавление VEGFA in vitro и экспрессию трансгена in vivo с помощью промотора VMD2, специфичного для RPE, в составе вектора (Askou et al., 2015). После однократной субретинальной инъекции LVs в сетчатку мыши была получена клеточно-специфическая и надежная экспрессия в клетках RPE на срок до 9 месяцев. Эффект глушения VEGFA, последовавший за субретинальной доставкой мультигенного вектора, был подтвержден снижением размера лазерно-индуцированных CNV в этой модели грызунов.

Поскольку платформа доставки на основе AAV является первым выбором в генотерапии сетчатки, мы задались целью разработать мультигенную экспрессионную кассету, которая могла бы поместиться в вектор AAV. С ее помощью мы хотели изучить in vivo антиангиогенный эффект векторов, кодирующих фактор, продуцируемый пигментным эпителием (PEDF), и несколько миРНК, нацеленных на мРНК VEGFA (Askou et al., 2019). Мультигенные AAV-векторы были упакованы в капсид серотипа 5 (AAV2.5) из-за их тропизма к RPE, а исследование группы Ауриккио показало, что эффективность упаковки больших генов в AAV-векторы зависит от серотипа (Allocca et al., 2008). Субретинальные инъекции этих частиц AAV2.5 обеспечили широко распространенную экспрессию, специфичную для RPE, в мышиной сетчатке и значительно уменьшили вызванную лазером CNV в этой модели (Askou et al., 2019). Примечательно, что мы наблюдали повышенную, хотя и не статистически значимую, эффективность благодаря комбинированной экспрессии нескольких антиангиогенных молекул (анти-VEGFA миРНК и PEDF) из одного и того же вектора. Эта первая попытка протестировать мультигенную систему в векторах AAV позволяет предположить, что антиангиогенная генотерапия двойного действия может стать важнейшим инструментом для будущих методов лечения заболеваний глаз, связанных с CNV.

Полученные результаты открывают большие перспективы для развития систем доставки генов, предназначенных для комбинированной терапии неоваскулярных заболеваний, таких как nAMD. Возможными ко-экспрессируемыми белками могут быть антиангиогенные, противовоспалительные или, как было проверено в нашем исследовании, нейротрофические факторы, такие как PEDF (Dawson et al., 1999; He et al., 2015; Tombran-Tink et al., 1991; Wang et al., 2008; Zhang et al., 2008). PEDF - широко экспрессируемый многофункциональный член семейства ингибиторов сериновых протеиназ (серпинов) (Tombran-Tink et al., 2005). Измененные уровни PEDF были обнаружены в стекловидном теле пациентов с диабетической ретинопатией (Boehm et al., 2003; Ogata et al., 2002), а снижение уровня PEDF наблюдалось у людей с CNV, связанным с AMD (Holekamp et al., 2002). Полученные результаты позволяют предположить, что комбинированная доставка трансгенов, подавляющих экспрессию VEGF и стимулирующих экспрессию PEDF, в места ангиогенеза может стать потенциальным инструментом для лечения состояний, сопровождающихся патологическим ростом глазных сосудов. Это один из путей, которым мы сейчас занимаемся.

Несколько попыток направлены на решение связанных с RNAi проблем, связанных с чрезмерной экспрессией не-целевых генов, перенасыщением путей процессинга миРНК, которые имеют решающее значение для нормального функционирования клеток, и предотвращением непреднамеренных иммунных реакций. Для устранения этих опасений недавно были разработаны так называемые «agshRNAs» (Ago2-зависимые shRNAs), которые значительно снижают риск off-targeting эффектов и перенасыщения эндогенного пути (Harwig et al., 2017; Shang et al., 2015). Благоприятные эффекты этих новых эффекторов RNAi достигаются за счет (i) устранения активности из совместно поставляемой пассажирской нити шпильки (см. рис. 2B и C) и (ii) встраивания agshRNAs в каркас при-миРНК, что позволяет настраивать (например, тканеспецифическую) экспрессию эффектора RNAi, сохраняя эффективность нокдауна.

Чтобы повысить эффективность и специфичность, а также изучить возможности повышения безопасности, мы разработали VEGFA-таргетные агшРНК и агshRNAs вшитые в миРНК (миР-agshRNAs), которые были включены в тканеспецифичные экспрессионные кассеты и LV (Alsing et al., 2022). По сравнению с аналогами shRNAs VEGFA-таргетные agshRNAs и миР-agshRNAs продемонстрировали повышенную специфичность и безопасность, сохранили высокую эффективность нокдауна и устранили активность пассажирских нитей. Кроме того, агshRNAs нацеленные на VEGFA, значительно повышают жизнеспособность клеток и снижают конкуренцию с процессингом эндогенных миРНК. Анализ РНК-секвенирования LV-трансдуцированных клеток RPE показал, что VEGFA-таргетные шРНК обычно приводят к большему изменению уровня экспрессии генов и активируют связанные с иммунитетом пути, чем VEGFA-таргетные agshRNAs. У мышей субретинальное введение LV, кодирующих тканеспецифические VEGFA-таргетные miR-агshRNAs привело к ограничению экспрессии VEGFA в RPE и значительному нокдауну VEGFA в трансдуцированных клетках RPE. В целом, наши результаты свидетельствуют о том, что agshRNAs и миР-агshRNAs нацеленные на VEGFA, имеют важные преимущества по сравнению с shRNAs нацеленными на VEGFA. Это делает данный подход клинически значимым с точки зрения эффективности, специфичности и безопасности (Alsing et al., 2022).

Для дальнейшего изучения трансляционного потенциала miR-агshRNAs которые могут одновременно воздействовать на два мощных целевых сайта VEGFA (Kaadt et al., 2019), этот принцип был проверен на свиной экспериментальной модели CNV (Haldrup et al., 2024). Поскольку мало что известно о результатах генотерапии сетчатки у свиней, мы оценили характеристики трансдукции и профиль безопасности для сетчатки одноцепочечных (ss) и sc рекомбинантных векторов адено-ассоциированного вируса 2.8 (AAV2.8), кодирующих зеленый флуоресцентный белок (GFP), на этом животном. Целью нашего исследования было определить эффективность и безопасность этих векторов для потенциального терапевтического использования, сосредоточившись на их способности эффективно и безопасно доставлять генотерапию в сетчатку.

Результаты исследования оказались обнадеживающими. VEGFA-таргетированные miR-agshRNAs значительно уменьшили CNV по сравнению с не-целевым контролем. Кроме того, исследование показало, что векторы ssAAV2.8 и scAAV2.8 эффективно трансдуцируют клетки RPE свиньи, хотя они демонстрируют различные характеристики трансдукции и имеют разные профили безопасности для сетчатки. Субретинальное введение scAAV2.8/GFP сопровождалось ранним снижением экспрессии трансгена и изменениями в структуре сетчатки, что было расценено как признак токсичности. Отсутствие глазного воспаления в течение всего периода исследования свидетельствует против иммуноопосредованного фона для этой токсичности. Это подтверждается данными о том, что неблагоприятные глазные иммунные реакции после субретинальной инъекции отмечаются в основном при более высоких дозах вектора (Beltran et al., 2010; Bucher et al., 2021). То, что признаки токсичности проявлялись преимущественно в глазах, инъецированных scAAV2.8/GFP, указывает на вероятную связь либо с высоким уровнем, либо с быстрым началом экспрессии GFP.

В целом, полученные результаты свидетельствуют об устойчивом антиангиогенном эффекте VEGFA-таргетных миР-агшРНК в крупной трансляционной животной модели (рис. 4). Насколько нам известно, данное исследование представляет собой первую оценку эффективности генотерапии на основе AAV для доставки RNAi терапевтических препаратов, нацеленных на VEGFA, в модели CNV свиньи. Безопасность и переносимость лечения могут предсказать успешную клиническую трансляцию (Haldrup et al., 2024). Это позволяет предположить, что доставка анти-VEGFA RNAi терапевтических препаратов на основе AAV может стать ценным инструментом для лечения nAMD в будущем.



Fig. 4. AAV-mediated anti-angiogenic gene therapy using VEGFA-targeting miR-agshRNA reduces CNV in a large animal model. Representative porcine RPE/choroidal flat mounts collected on day 42 post-injection from two treatment groups: Targeting (ssAAV2.8/13–12) and non-targeting (ssAAV2.8/S1-S2). The two ssAAVs carry a GFP-expression cassette in addition to their miR-agshRNAs (A) Column 1 (scale bar = 800 µm): Overview of RPE/choroidal flat mounts with GFP (green), CD31 (red), and GS-IB4 (blue) staining. Columns 2–4 (scale bars = 100 µm): Magnified images of CNV regions within white boxes, showing specific staining for CD31, GS-IB4, and the two combined. (B) The CD31-positive CNV area. (C) Measurements of the GS-IB4-positive areas in each porcine (P10-P18) individual. AAV, adeno-associated virus; CD31, cluster of differentiation 31; CNV, choroidal neovascularisation; GS-IB4, Griffonia simplicifolia type I lectin; ss, single-stranded. Reproduced from (Haldrup et al., 2024).

Несмотря на успешные результаты, мы и другие исследователи столкнулись с низкими показателями успешности лазерно-индуцированной CNV в свиной модели, а фотокоагуляция часто приводила к значительным сопутствующим повреждениям нейроретины, включая глиоз (Kiilgaard et al., 2005; Lassota et al., 2007). Это могло быть связано с вариабельностью процедур и различиями в глазах, например, пигментацией, что могло вызвать колебания в повышении температуры и рассеивании световой энергии на окружающую сетчатку (Brinkmann et al., 2012; Jain et al., 2008; Mьller et al., 2011). Поэтому в параллельном исследовании мы изучали возможность разработки улучшенной свиной модели для CNV, индуцированной фотокоагуляцией, которая давала высокие показатели успеха в сочетании с минимальным термическим повреждением нейроретины (Hansen et al., 2021).

Интересно, что исследование показало, что введение субретинального физраствора может защитить сетчатку от термического повреждения, не снижая при этом успешности экспериментальной CNV. Наблюдаемая защита от термического повреждения нейроретины, скорее всего, отражает способность субретинально введенного физраствора поглощать направленное распространение тепла, генерируемого при поглощении света в пигментном эпителии сетчатки. Кроме того, отсутствие формирования CNV в очагах поражения, обработанных субретинально физраствором, позволяет предположить, что нейроретина не была вовлечена в процесс формирования этих очагов. Был сделан вывод, что поражения CNV, индуцированные в присутствии субретинального солевого раствора, могут более точно отражать процессы, связанные с формированием CNV при nAMD (Hansen et al., 2021).

Кроме того, исследование показало, что влияние вмешательств, направленных на смягчение развития экспериментальной CNV, лучше всего оценивать в течение нескольких недель после фотокоагуляции, которая была использована для формирования CNV. Таким образом, эта трансляционная модель предлагает основу для разработки и оценки новых методов лечения неоваскулярных заболеваний сетчатки (Hansen et al., 2021).

Перед проведением клинических испытаний генотерапия должна быть оценена, например, на эксплантных культурах RPE/хороидальных клеток человека ex vivo, первичных клетках RPE, индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, полученных из iPSC, органоидах сетчатки и/или на NHP. Поэтому краткосрочные и долгосрочные исследования in vivo по экспрессии рекомбинантных AAV-трансгенов в NHP, наряду с подходами на основе клеток, которые иногда являются более практичной альтернативой экспериментам на NHP, могут дать многообещающие сведения, которые помогут продвинуться в применении глазной генотерапии у людей. Важно отметить, что эксплантологические культуры RPE/хороидальной оболочки ex vivo сохраняют сложные клеточные взаимодействия между этими двумя структурами in situ.

Мы (Lindholm A.B. и Corydon T.J., неопубликованные результаты) и другие исследователи (Toops et al., 2014) показали, что первичный свиной RPE (ppRPE) демонстрирует большое сходство с морфологией и экспрессией клеток RPE in vivo и поэтому является подходящей моделью для изучения, например, поляризованной секреции RPE, тканеспецифичной экспрессии, эффективности терапии или доставки векторов (рис. 5A и B). Кроме того, использование ppRPE позволяет сократить количество экспериментальных животных.



Fig. 5. In vitro models for validation of gene therapy using primary porcine RPE cells and human retinal tissue. (A) RPE/choroidal explants from slaughterhouse pig eye. The red signals (ZO-1) illustrate the characteristic hexagonal shape of the viable monolayer RPE cells. (B) LV-based gene delivery to isolated ppRPE cells resulting in robust expression of GFP marker protein. (C) Human RPE/choroidal explants with punch biopsies. (D) Viable human RPE/choroidal explantt. GFP, green fluorescent protein; RPE, retina pigment epithelium; ppRPE, primary porcine RPE; ZO-1; zonula occludens-1 (Lindholm A.B. and Corydon T.J., unpublished results).

Важным трансляционным шагом является повторение экспериментов на животных на первичных культурах RPE человека. Поэтому в настоящее время мы проводим эксперименты на RPE/хороидальных эксплантатах из глаз, которые энуклеируются в рамках лечения глазных заболеваний и в которых можно выделить здоровые участки сетчатки и хориоида, например, у пациентов с глазными меланомами (рис. 5C и D). Мы считаем, что это важный шаг на пути к переводу базовых генетических экспериментов и экспериментов на животных в клиническую терапию.

Расширяющийся спектр активных и завершенных клинических исследований, направленных на лечение nAMD, dAMD и DME (табл. 1), отражает значительный прогресс и инвестиции в развитие глазной генотерапии от фундаментальной науки до клинической практики. Эти испытания в основном направлены на доставку анти-VEGF терапии на основе AAV, в некоторых случаях направленной на несколько ангиогенных факторов. Современные подходы включают ABBV642 (молекула иммуноглобулина с двойным вариабельным доменом, специфически связывающая VEGF и PDGR-BB), faricimab (биспецифическое антитело, направленное на VEGFA и ангиопоэтин-2), ADVM-022 (aflibercept), XG102-031 (слитый белок, сочетающий домен ангиопоэтина с рецептором VEGF (ABD-VEGFR)) и 4D-150 (анти-VEGFC миРНК вместе с кодон-оптимизированной последовательностью для aflibercept, направленная на четыре ключевых ангиогенных фактора, участвующих в развитии nAMD и DME). Эти подходы подчеркивают тенденцию к мультитаргетингу и указывают на ограничения традиционных монотерапий.

Недавние доклинические исследования показали многообещающие результаты таких новых методов лечения, включая мультигенный AdC68-PFC, который направлен на антиангиогенные и противовоспалительные пути через скоординированную экспрессию PEDF, sFlt-1 и sCD59 (Wei-Zhang et al., 2023). Кроме того, AAV2/8-опосредованная доставка PEDF-P2A-sCD59 и sFLT-1-P2A-sCD59 продемонстрировала безопасность и долгосрочную эффективность, сравнимую с анти-VEGF терапией (Bai et al., 2024). Роль механической мишени рапамицина (mTOR) в патогенезе AMD также вызывает значительный интерес (Go et al., 2020; Panwar et al., 2023; Wang et al., 2022; Yu et al., 2014; Zhang et al., 2020; Zhao et al., 2011), причем результаты исследований связывают гиперактивную сигнализацию mTORC1 с дегенерацией сетчатки (Cai et al., 2022). Ключевые исследования выявили молекулярных игроков, таких как ALKBH5 и DARPP-32, которые влияют на прогрессирование заболевания посредством воздействия на путь AKT/mTOR (Cai et al., 2022; Sun et al., 2023). Ингибиторы этих белков, такие как IOX1 и потенциальные блокаторы DARPP-32, открывают новые терапевтические возможности для лечения заболеваний сетчатки.

Перспективным невирусным подходом для генотерапии сетчатки являются инкапсулированные клетки, которые позволяют экспрессировать цилиарный нейротропный фактор в течение более десяти лет после однократной инъекции (Kauper et al., 2023). Наконец, инструменты CRISPR были применены доклинически для нокаута таких мишеней, как VEGF (Holmgaard et al., 2017, 2021; Park et al., 2023; Xie et al., 2024) и индуцибельные факторы гипоксии (Koo et al., 2018; Xie et al., 2024). В настоящее время проводится клиническое испытание I фазы с использованием Cas-13 для воздействия на VEGF (табл. 1).

В целом, последние достижения свидетельствуют о переходе к комплексным, многоцелевым стратегиям, которые выходят за рамки традиционной монотерапии и направлены на борьбу с ангиогенезом и основными механизмами заболевания при AMD и других болезнях сетчатки.

Разработка генотерапии для ингибирования развития CNV направлена на лечение одной из двух угрожающих зрению конечных точек AMD с патологическим ростом хороидальных сосудов. Однако необходимо предотвратить переход ранних стадий заболевания в поздние с угрожающими зрению проявлениями, которые включают как nAMD, так и dAMD с географической атрофией. К сожалению, борьба с этими проявлениями заболевания более сложна. Развитие dAMD начинается с накопления отработанных продуктов в мембране Бруха с сопутствующим увеличением диффузионного расстояния от хороида до сетчатки. Эти накопления могут быть видны при офтальмоскопии в виде локализованных беловатых участков, называемых друзами (drusen). Процесс продолжается с потерей клеток RPE и высвобождением содержащегося в них меланина, что клинически может проявляться в виде пигментных аномалий. Развитие заболевания включает в себя несколько процессов, таких как нарушение опосредованной лизосомами аутофагии, которая служит защитным механизмом против воспаления, окислительного стресса и старения клеток RPE (Kaarniranta et al., 2023). Воспалительные процессы включают активацию комплемента (Tzoumas et al., 2023), что подтверждается данными о том, что мутации в эндогенных регуляторах комплемента являются основными вариантами риска и что активация комплемента является частью процесса заболевания (de Jong et al., 2021). Среди многочисленных ингибиторов комплемента, которые оценивались для лечения dAMD, недавно было показано, что пегилированный анти-C3 и C3b пептид и РНК-аптамер, нацеленный на C5, замедляют прогрессирование GA (Liao et al., 2020). Кроме того, на поздних стадиях заболевания трансдифференцировка эпителиальных клеток в миофибробласты участвует в развитии фиброзного рубцевания, и этот процесс может быть связан с TGF-β (Fan et al., 2020).

Обнадеживает тот факт, что в двух клинических испытаниях уже применяется генотерапия против dAMD (табл. 1). Однако сложная природа ранних стадий AMD и развития dAMD с вовлечением иммунологических, сенесцентных и других факторов предполагает, что будущие методы лечения должны иметь несколько мишеней. Этого можно достичь с помощью множественной генотерапии, направленной на ингибирование комплемента, нормализацию аутофагии и блокирование трансдифференцировки в миофибробласты. Поэтому одним из ответов на этот сложный вызов может стать наша множественная генотерапия, основанная на одновременной экспрессии миРНК, подавляющих синтез VEGF и стимулирующих синтез PEDF, доставляемых с помощью AAV-векторов (Askou et al., 2019). Кроме того, расширение ингибирования пути VEGF в принципе может быть использовано на других комбинациях миРНК или расширено до миРНК, направленных на несколько целевых локусов.

Концепция воздействия на различные медиаторы в развитии AMD уже была рассмотрена путем внедрения многоцелевых препаратов, таких как ABBV642 и фарицимаб (Ding et al., 2017; Nicolo et al., 2021). Концепция двойного генного таргетинга в настоящее время проверяется в исследовании с интравитреальной доставкой модифицированного AAV-вектора, который кодирует как афлиберцепт, так и ингибирующую VEGFC миРНК (Khanani et al., 2023). В другом доклиническом исследовании изучался хирургический метод использования фибриновых гидрогелей в качестве средства доставки AAV для трансдукции в клетки RPE в модели свиньи (Scruggs et al., 2024). Полученные данные свидетельствуют о том, что такие гидрогели могут действовать как система «медленного высвобождения» с длительным высвобождением векторов AAV при сохранении их инфекционности. Этот принцип может позволить более точно нацеливать и улучшать трансдукцию генов в RPE и сетчатку, тем самым минимизируя риски, связанные с субретинальными инъекциями (Scruggs et al., 2024). Другие системы доставки могут включать LNPs, LVNPs или местное применение генных препаратов, что позволяет обойти необходимость вирусной доставки и сопутствующие неблагоприятные эффекты (Avrutsky et al., 2023; Drag et al., 2023; Haldrup et al., 2023; Herrera-Barrera et al., 2023; Wang et al., 2024).

Решение текущих проблем с безопасностью и эффективностью генотерапии сетчатки может быть ускорено, если сообщество генных терапевтов будет готово поделиться открытиями в области дизайна векторов и серотипов AAV в рамках коллективных усилий, но эта цель может быть заблокирована коммерческими интересами. Кроме того, при утверждении новых методов терапии для клинических испытаний следует использовать векторы, серотипы и промоторы, которые уже были проверены и одобрены для использования в медицине. Такой подход не только опирается на существующие данные о безопасности и эффективности, но и сокращает время и ресурсы, необходимые для разработки совершенно новых систем. Это может способствовать более быстрому переходу от исследований к клиническому применению на благо пациентов.

Наконец, больше внимания следует уделять стратификации пациентов с AMD для более персонализированного лечения. Генная терапия наиболее актуальна для пациентов, которым, как ожидается, потребуется много инъекций используемых в настоящее время анти-VEGF-компонентов. Поэтому необходимо провести исследования, чтобы предсказать реакцию каждого отдельного пациента на текущие анти-VEGF-препараты, чтобы пациенты, у которых положительный и отрицательный эффект от повторных инъекций взвешивается против положительного и отрицательного эффекта генотерапии.

В последние десятилетия появились новые методы лечения заболеваний сетчатки, основанные на введении в стекловидное тело антител или рецепторов-приманок. Необходимость повторных инъекций этих соединений является тяжелым бременем как для пациентов, так и для системы здравоохранения, поэтому существует потребность в альтернативных методах лечения с более эффективным, безопасным и экономически выгодным профилем. Генотерапия, направленная на изменение экспрессии соединений, вовлеченных в процессы заболевания, может стать одним из ответов на этот вызов в будущем. Желательно развивать технологию, позволяющую одновременно доставлять модифицирующие гены с несколькими мишенями (например, множественная генотерапия), а также использовать в качестве систем доставки другие средства, отличные от вирусных векторов, что создаст основу для дальнейшего расширения клинических испытаний против различных типов AMD. Несмотря на то, что в настоящее время разработка сосредоточена на AMD, можно ожидать, что она принесет пользу и при других заболеваниях. Разработка анти-VEGF антител для лечения nAMD также принесла пользу в лечении DME и центрального отека у пациентов с RVO. В будущем можно ожидать аналогичного расширения потенциальных мишеней заболеваний для генотерапии.