Посещений:
АНТИСМЫСЛОВЫЕ ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ



Использование для терапии DMD и SMA

Antisense Oligonucleotide-Based Therapy for Neuromuscular Disease
Valentina Sardone, Haiyan Zhou, Francesco Muntoni, Alessandra Ferlini and Maria Sofia Falzarano
Molecules 2017, 22(4), 563; doi:10.3390/molecules22040563

Different classes of antisense oligonucleotides are being tested in several clinical trials, and limitations of their clinical efficacy and toxicity have been reported for some of these compounds, while more encouraging results have supported the development of others. New generation antisense oligonucleotides are also being tested in preclinical models together with specific delivery systems that could allow some of the limitations of current antisense oligonucleotides to be overcome, to improve the cell penetration, to achieve more robust target engagement, and hopefully also be associated with acceptable toxicity. This review article describes the chemical properties and molecular mechanisms of action of the antisense oligonucleotides and the therapeutic implications these compounds have in neuromuscular diseases. Current strategies and carrier systems available for the oligonucleotides delivery will be also described to provide an overview on the past, present and future of these appealing molecules.


Рисунки к статье

Хотя белки являются наиболее распространенными мишенями для уже одобренных лекарств [1], поиски сфокусированы и на открытии новых биологически активных молекул, воздействующих на нуклеиновые кислоты [2]. Среди этих новых соединений, антисмысловые олигонуклеотиды (ASOs) предлагаются для лечения нейродегенеративных заболеваний [3]. Использование ASOs, нацеленных специфически на hnRNAs или mRNAs, делает возможным вмешательство в механизм сплайсинга или регуляции трансляции белков, или связывания РНК/белок. Таким образом, молекулы ASO могут изменять экспрессию специфических генов применительно к патологиям, не поддающихся лечению известных лекарств [4,5].
Более ранние исследования в нейромышечной области дали интересные, хотя иногда довольно противоречивые результаты в экспериментальных клинических испытаниях, когда два класса ASOs (a 2'-O-methyl и a phosphorodiamidate morpholino) были использованы для синтеза белка дистрофина при Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) путем модуляции сплайсинга [6].
Совсем недавно Spinraza (прежде известный как Nusinersen), O-(2-methoxyethyl) модифицированный ASO применялся intrathecally, был использован в фазе I-III исследованиях на младенцах и детях со Spinal Muscular Atrophy (SMA), с очень обнадеживающей переносимостью и высоко достоверным клиническим успехом при лечении пациентов [7,8].
Несколько клинических испытаний, базирующихся на ASO терапии, описаны с прекрасными результатами также для др. болезней, таких как лечение инфекции hepatitis C virus (HCV) путем целенаправленного воздействия на микроРНК Miraversen, a locked nucleic acid-modified DNA phosphorothioate олигонуклеотида, сцепленного с N-acetylgalactosamine carbohydrate структурой [9].

1.1. ASO Therapy in Duchenne Muscular Dystrophy


Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) является редким и прогрессирующим нейромышечным заболеванием, затрагивающим приблизительно 1 из 5000 новорожденных мальчиков. Болезнь характеризуется прогрессирующим истощением и слабостью мышц, приводящим к потере способности к перемещению в среднем юношеском возрасте [10]. DMD обусловливается мутациями в гене дистрофина. Согласно Leiden muscular dystrophy базе данных (www.dmd.nl), делеции или удвоения экзонов присутствуют приблизительно у 80% пациентов с DMDs, тогда как 20% несут маленькие мутации [11]. ASOs были также разработаны для индукции пропуска экзонов и восстановления рамки считывания транскрипции, которая нарушена в случаях DMD, несущих мутации рамки считывания. ASOs способствуют трансляции белка дистрофина с внутренней делецией, воспроизводящей более умеренный мутантный аллель Becker Muscular Dystrophy (BMD) [12]. Восстановление более короткого белка должно замедлять дегенерацию мышечных волокон и ослаблять прогрессирование болезни. С конца 1990s, переключающие сплайсинг ASOs стали активно проверяться на клеточных моделях (животных и и человека) [13,14] и на модельных животных (включая мышей и собак [15]). Большинство мутаций при DMD образуют кластер в горячих точках между экзоном 43 и 53, указывая, что 69% пациентов с делециями могут быть подвергнуты пропуску одиночных экзонов, увеличиваясь до 90% , если происходит пропуск множественных экзонов [16].
В частности, мутации поддающиеся пропуску в экзоне 51, составляют 13% мальчиков с DMD, образуя самую большую группу пациентов с потенциально возможным лечением с помощью подхода пропуска экзонов: по этой причине терапия с помощью ASO прежде всего была разработана для коррекции этой группы DMD пациентов.

1.2. ASO Therapy in Spinal Muscular Atrophy


Spinal Muscular Atrophy (SMA) это аутосомно рецессивное заболевание, характеризующееся прогрессивной симметричной мышечной атрофией и слабостью, как результат дегенерации двигательных нейронов в спинном мозге. Это наиболее распространенная генетическая причина детской смертности, поражающей 1 на 6000 до 1 на 10000 рождений живых детей, при этом частота носительства 1 на 35~50 в генеральной популяции [17,18]. Генетический дефект у SMA пациентов заключается в потере survival of motor neuron (SMN) белка, вызываемой в 95% случаев гомозиготными делециями гена Survival of Motor Neuron 1 (SMN1) [19]. Локус SMN является частью геномной инвертированной дупликации в хромосоме 5 человека, которая дает ген паралог, SMN2. SMN2 не изменен у всех SMA пациентов. Более того, количество копий SMN2 может варьировать в генеральной популяции, а при SMA, существует обратная корреляция между количеством копий SMN2 и тяжестью болезни [20,21]. Гены SMN1 и SMN2 отличаются по нескольким экзонным и интронным SNPs, хотя не вызываются аминокислотные замены этими вариантами. Среди них, переход одиночного нуклеотида cytosine (C) в thymidine (T) в SMN2 в позиции 6 экзона 7, что существенно нарушает сплайсинг этого экзона и приводит преимущественно (~90%) к пропуску экзона 7 [22-25]. Оставшиеся 10% от этих транскриптов содержат экзон 7, однако, низкое количество возникающего в результате белка недостаточно для полной компенсации потери гена SMN1.
SMA на сегодня неизлечима; однако, достигнут существенный прогресс в разработке терапевтических стратегий. Поскольку фундаментальный дефект при SMA это дефицит белка SMN, то большинство стратегий сфокусировано на усилении экспрессии белка SMN. Сюда входят следующие: (i) ASO терапия для перенаправления сплайсинга экзона 7 в SMN2, чтобы увеличить количество транскриптов SMN2 полной длины [26-30]; (ii) генотерапия по увеличению функционального SMN белка путем введения экзогенного гена SMN1, используя вирусный вектор [31-34]; и (iii) низкомолекулярные лекарства для стимуляции активности промотора [35-38]. Кроме того, используются и др. стратегии, включая нейропротекцию с помощью небольших соединений и трансплантации стволовых клеток нейронов [39-41].

2. Cellular Uptake Mechanism of Antisense Oligonucleotides


Клеточные и внеклеточные нуклеазы способны быстро деградировать не модифицированные ДНК и РНК ASOs и по этой причине эти молекулы не могут быть использованы без модификации in vivo. Эффективные ASO д. обладать высокой специфичностью и соединяться со своей молекулой мишенью без эффектов вне мишени. ASOs пересекают клеточную мембрану используя разные методы интернализации, исходя из их химической структуры и свойств мембраны клеток мишеней. Было продемонстрировано, что ASOs могут проникать в клетки путем диффузии [42], также с помощью наиболее изученного и описанного ASO потребления посредством эндоцитоза [7].

2.1. ASO Internalization Process Mediated by Endocytosis


Процесс интернализации ASO обеспечивается с помощью разных и сложных путей. Clathrin-обеспечиваемый эндоцитоз является одним из наиболее распространенных процессов интернализации, происходящим после взаимодействия лиганда с рецептором клеточной поверхности [43]. Caveolin 1 является др. белком, который может обеспечивать интернализацию малых молекул и обычно экспрессируется в богатых холестерином клеточных мембранах [44]. Существуют также clathrin- и caveolin-независимые пути, которые нуждаются в привлечении др. белков, таких как flotillins, путь CLIC/GEEC и протеин киназа, относящаяся к семейству PAK [45].

2.2. ASO Uptake by Cell-Penetrating Peptides


Открытые в конце 1980s, cell penetrating peptides (CPPs) являются др. механизмом усиления интернализации ASO. CPPs являются малыми пептидами, обычно менее 30 аминокислот, способные пересекать клеточную мембрану [46]. Первые CPP были открыты как последовательности из 9 аминокислот, экспрессируемые trans-activactor protein (TAT) [47,48]. Приблизительно в тот же период др. пептидный регион из 60 аминокислот был открыт из гомоеобоксного белка antennapedia у Drosophila [49]. Эта пептидная последовательность впоследствии была названа Penetratin, она способна пересекать клеточную мембрану дифференцированных нейронов [49]. CPPs, сцепленные с ASOs, изучаются на животных моделях нескольких нейромышечных заболеваний [50] и недавно этот метод доставки обнаружил обещающие результаты по эффективному целенаправленному воздействию также в ЦНС с помощью системной доставки [51]. Большинство CPPs имеют высокий катионный заряд и это делает их конъюгацию с негативно заряженными ASO практически невозможной [52]. По этой причине большинство успешных экспериментов конъюгации CPP было осуществлено с нейтрально заряженными ASOs, такими как peptide nucleic acid (PNA) или phosphorodiamidate morpholino (PMO) [46]. Было продемонстрировано, что CPPs, сконъюгированные с 20-mer PNA для целенаправленной коррекции дистрофина в экзоне 23 у DMD мышиных моделей (mdx), обнаруживают высокую активность по пропуску экзонов в дифференцированных мышечных трубках мышей и более высокие количества волокон, позитивных по дистрофину после инъекции в tibilias anterior мышей mdx по сравнению с голой PNA [53]. CPP-ASO конъюгаты также целенаправлено воздействуют на скелетные мышцы и также способны поддерживать восстановление дистрофина в сердце mdx мышей обработанных CPP-ASO [54], хотя токсичность, наблюдаемая для некоторых из этих соединений на преклинических моделях, не позволяет их клиническое использование для клинических испытаний [54].

2.3. Limiting Factors for ASOs Uptake


Обычно клеточные модели, используемые для изучения потребления ASO, не отражают сложности доставки in vivo. Многие факторы д. рассматриваться после применения ASO, такие как период полу-жизни лекарства, скорость очистки, фармакодинамические и фармакокинетический свойства. ASOs д. применяться в разного диапазона дозах, в зависимости от типа ASO и от ткани мишени. Более того, некоторого типа ASO, накапливающиеся в печени, почках и кишечнике, нуждаются в высоких дозах применения, чтобы достигать подходящей фармакологической концентрации в любой из тканей мишеней. Тем не менее, когда ASO успешно проходят in vitro и in vivo проверку пригодности, то подходы по клиническому применению, легкость проведения и соотношение цена и эффективность д. учитываться. В самом деле ASO д. синтезироваться крупномасштабно и под контролем Good Manufacturing Practice (GMP).

3. Different Chemistries of Antisense Oligonucleotides


Не модифицированные молекулы ДНК и РНК не могут быть использованы, не только потому, что они чувствительны к внутри- и внеклеточным нуклеазам. Нуклеиновые кислоты без модификаций связываются слабо с плазматическими белками и очень быстро отфильтровываются почками и выделяются в мочу.

3.1. Phosphorothioate ASOs


Первая генерация лекарств ASO, синтезированная и клинически протестированная была phosphorothioate (PS) основа. Эти молекулы обладают избыточной резистентностью к нуклеазам благодаря замене non-bridging phosphate кислорода на атом серы (Figure 1) [55]. PS ASOs способны индуцировать расщепление RNase H, способствуя деградации транскрипта мишени. Эти вещества обнаруживают повышенное связывание с плазматическими белками, что приводит к пролонгации их полу-жизни [56].

Figure 1. Chemical modifications of ASO backbone. PS, phosphorotioate; NP, N3'-P5' phosphoroamidate; OMe, 2'-O-methyl; MOE, 2'-O-methoxy-ethyl; LNA, locked nucleic acid; PMO, phosphoroamidate morpholino; PNA, peptide nucleic acid; tcDNA, tricyclo DNA.
Др. модификация остова заключается в замене 3' кислорода на кольцо деоксирибозы с 3' amino атомом [56]. Эти соединения, наз. N3' P5' phosphoramidate oligodeoxynucleotides, обладают высокой стабильностью к нуклеотической деградации и повышенным связыванием мишени, но не активируют RNase H.

3.2. 2'-O-Methyl and 2'-O-Methoxyethyl ASOs


Модификации основного остова структуры PS повышают стабильность, как это происходит в 2'-O-methly (2'MeO) и в 2'-O-methoxyethyl (2'MOE) ASOs (Figure 1). Эти химические модификации делают ASOs более резистентными к нуклеазам и даже более специфичными в отношении их связывания РНК [56]. По сравнению с phosphodiester, эти молекулы д. быть потенциально более цитотоксичными из-за их химической структуры и д. вызывать иммуногенную реакцию [57].

3.3. Locked Nuclei Acid ASOs


Locked nuclei acid (LNA) соединения были сгенерированы в качестве вынужденного аналога 2'O-methyl-RNA, где 2' остаток прикреплен к атому углерода в положении 4' (Figure 1). Этот связующий мостик приводит к 3'-endo-конформации, которая уменьшает конформационную гибкость рибозы. Они не поддерживают активность RNase H, но при добавлении gapmer они могут вызывать снижение продукции транскриптов, обусловленное с помощью RNase H [58]. LNAs являются резистентными к нуклеазам, не токсичными и негативно заряженными. Совместное применение с катионовыми липидными полимерами усиливает скорость пересечения мембраны и повышает эффективность доставки. LNAs были успешно протестированы в отношении индукции пропуска экзона 46 в клетках пациентов с DMD, несущих делецию экзона 45 [59].

3.4. Phosphorodiamidate Morpholino ASOs


Химические модификации могут быть также созданы в сахарной основе с образованием phosphorodiamidate соединений. Phosphorodiamidate морфолино (PMO) принадлежат к этому семейству, и они были синтезированы с кольцом morpholino на месте кольца furanose. Атом азота morpholino соединен с гидроксильной группой с помощью 3' остатка посредством phosphorodiamidate сцепления (Figure 1). Morpholino олигомеры были задуманы James E. Summerton (Gene Tools) и разработаны в сотрудничестве с биотехнической компанией (Antivirals, переименованной в AVI-BioPharma и совсем недавно в Sarepta Therapeutics). Чтобы взаимодействовать с PMO мишенью, они д. быть длиной, по крайней мере, в 15 нуклеотидов; это повышает их специфичность и снижает их эффекты вне мишени [56]. Они не токсичны, заряжены нейтрально и хорошо растворимы в воде. PMOs блокируют трансляцию белка, но не активируют деградацию транскриптов, вызываемую с помощью RNase H. Благодаря своим характеристикам они широко используются для блокирования трансляции или для антисмыслового переключения сплайсинга (splice switching antisense) [60].

3.5. Peptide Nucleic Acids ASOs


Peptide nucleic acids (PNAs) к др. семейству ASOs, созданных с помощью структурных изменений в остове нуклеиновых кислот. Сахарный фосфатный остов замещается пептидом, который придает молекуле способность противостоять клеточным и внеклеточным нуклеазам и протеазам. По сравнению с 2'-OMePS соединениями остова, PNAs обладают высоко повышенным сродством к ДНК и РНК [61]. Благодаря своей катионной природе, они плохо растворимы в воде и с большим трудом трансфицируются. Добавления лизина к пептидной последовательности д. повышать растворимость [62]. PNA, конъюгированные с CPPs демонстрируют более высокую эффективность пропуска по сравнению с голой PNA [53].

3.6. Tricyclo-DNA ASOs


Новый класс соединений разработан недавно: tricyclo-DNA (tcDNA) ASOs. tcDNA могут быть синтезированы с помощью стандартной phosphoramite химии и являются устойчивыми к активности нуклеаз [63]. Химически, tc-DNA происходят из остова ДНК с добавлением связей между C (5') и C (3') (Figure 1). Недавно Goyenvalle с сотр. показали, что tc-DNA ASO способны улучшать кардио-респираторную и нейромышечную функции в двух моделях DMD у мышей: модельные мыши mdx и Utrn (кодирующего utrophin)-Dmd двойные нокаутные мыши, обнаруживающие ещё большую мышечную дистрофию, чем мыши mdx [64-66]. Эти авт. показали, что tc-DNA в 3-4 раза более эффективна в отношении индукции пропуска экзонов по сравнению применения той же самой дозы 2'-O-Me или PMO ASOs. Интересно, что они также продемонстрировали, что tc-DNA ASOs были способны пересекать гемато-энцефалический барьер (BBB) и корректировать также дефицит дистрофина в сердцах mdx мышей. Если эти ASOs окажутся надежными в ходе преклинических токсикологических испытаний, они смогут оказаться привлекательными для лечения не только нейромышечных симптомов при DMD, но и также ассоциированной кардиомиопатии и поведенческих аномалий, часто ассоциирующих с данным нарушением [12].

4. Mechanism of Action of ASOs


ASOs могут модулировать экспрессию генов, действуя разными способами, исходя из их химии и финальной мишени.
Одним из механизмов является RNase H-обусловленная деградация с помощью избирательного расщепления пре-мРНК. Поскольку ASOs имеют 2' модификации, а RNase H нуждается в 2'-O, то д. быть вставлены gapmer антисмысловые нуклеотиды. Gapmers состоят из центрального региона, который поддерживает активность RNase H , а на флангах химически модифицированные концы, которые защищают ASO от нуклеаз [7,67].
Др. хорошо изученным подходом является модулирование сплайсинга ядерной пре-мРНК. ASOs могут целенаправленно воздействовать на специфические регионы, такие как 5'/3' сплайс-соединения или сайты энхансеров/сайленсеров экзонного/интронного сплайсинга (ESEs или ISEs, ESSs или ISSs), приводя к пропуску или включению экзона. Эта стратегия может быть использована для: (i) восстановления рамки считывания мРНК с помощью пропуска экзона при болезнях. таких как DMD, при которых делеции сдвига рамки считывания или не-смысловые мутации вызывают потерю функционального белка; (ii) помощи включения экзона, как это происходит при SMA, когда ASOs индуцируют включение экзона 7 в ген SMN2 e; (iii) внесения out-of-frame делеции для снижения экспрессии белка как при болезни Алцгеймера или Amyotrophic Lateral Sclerosis (Figure 2) [67].

Figure 2. Antisense-mediated exon skipping mechanisms. (a) Cryptic splicing mutations induce the inclusion of an aberrant exon (black box) into the mature transcript and the ASO can skip the cryptic exon restoring the normal transcript; (b) exon inclusion can be induced by ASO that, targeting the intronic splicing silencers (ISS) generated by the mutation, restores the correct exon inclusion (red box); (c) ASO can be used for switching between alternative splicing isoforms; (d) ASO can support exon skipping restoring the correct reading frame; (e) ASO can induce the translation of an internally deleted protein or can generate reading frame disruptions with consequent partially or complete transcript knockdown.

ASOs может также целенаправленно воздействовать на microRNA (miRNAs) которые участвуют в механизмах многих болезней и могут быть использованы в качестве терапевтического инструмента. miRNAs способны замалчивать мРНК мишени, а также влиять на профили экспрессии множественных мРНК. Целенаправленная регуляция miRNA путем использования ASOs может быть очень эффективной при клинических вмешательствах, как это было продемонстрировано для инфекции hepatitis C (antimiR122), рака груди (anti-miR221), и опухолей головного мозга (anti-miR155) [68,69]. Catapano с колл, показали, что системное лечение SMA мышей с помощью одиночной дозы олигомера PMO25 способно обратить вспять измененные уровни miR-132 в спинном мозге, мышцах и сыворотке [70].
Недавние исследования по Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy (FSHD) подтвердили, что целенаправленное воздействие на сигнал полиаденилирования мРНК и/или расщепление сайта Double homeobox 4 (DUX4) транскрипционного фактора с использованием ASOs, может стать потенциальной и многообещающей стратегией подавления экспрессии DUX4 [71,72].
ASOs могут также вмешиваться в связи между белками и патогенными видами РНК. Myotonic dystrophy type 1 (DM1) является нейромышечной болезнью, вызываемой экспансией повторов CUG в 3'-нетранслируемом регионе транскриптов DM protein kinase (DMPK) [73]. Разработан morpholino ASO, CAG25, и он способен формировать стабильный RNA-morpholino гетеродуплекс с патогенным транскриптом DMPK, несущим повторы CUG. Таким способом CAG25 блокирует взаимодействие этих аномальных видов РНК с др. белками, такими как muscleblind-like 1 (MBNL1), который играет фундаментальную роль в контроле аппарата сплайсинга [74]. Mulders с колл. разработали 2'-O-methyl-phosphorothioate modified (CAG)7 ASO, который замалчивает токсический DMPK транскрипт и вызывает нормализующий эффект на сплайсинг аберрантной пре-мРНК [75].

5. Pre-Clinical and Clinical Approaches of ASOs in DMD


Разные, осуществляющие переключение сплайсинга, ASOs были разработаны и описаны в отношении их химических свойств и исходов в пре-клинических и клинических испытаниях. Данные клинических испытаний, где были использованы ASOs для лечения DMD пациентов представлены в Table 1.

Table 1. Summary table of clinical trials based on ASO therapy for treating neuromuscular disorders. DMD, Duchenne Muscular Dystrophy; PS, phosphorothioate; 2?OMe, 2?-O?methyl; PMO, phosphorodiamidate morpholino; SMA, Spinal Muscular Atrophy; MOE, 2?-O-methoxyethyl. (*) indicates that the same patient group was monitored in both the two studies.

5.1. Phosphorothioate ASOs


Phospohorothioate ASOs были первыми соединениями, разработанными и успешно использованными для лечения cytomegalovirus-induced retinitis у AIDS пациентов [76].
A 31-mer PS был разработан и впервые тестирован в 2006 у одного DMD пациентап, несущего делецию в экзоне 10 гена дистрофина. Они продемонстрировали, что лекарство надежное и может быть введено внутримышечно. Наблюдалось восстановление дистрофина как на транскрипционном, так и трансляционном уровне с помощью PCR и иммунофлюоресцентной техники, соотв. [77].

5.2. 2'OMe ASOs


В 2007, Prosensa разработала 2'OMePS ASO для лечения DMD пациентов, потенциально для лечения с помощью пропуска экзона 51. Лекарство, первоначально названное PRO051, в конечном итоге было переименовано в Drisapersen, вводилось с помощью внутримышечных инъекций в мышцу tibialis anterior 4 DMD пациентам. После одиночного введения, количественное определение белка осуществляли с помощью Western blot, показавшем восстановление с 17% до 35% от нормального уровня, когда уровни экспрессии дистрофина нормализовали относительно уровней laminin A2. После воздействия ASO экспрессия дистрофина в волокнах варьировала в пределах 64% и 97% [78]. Это предварительное исследование заложило основу для open-label dose эскалации фазы I-IIa испытания, в которых Drisapersen был применен к 12 пациентам еженедельно путем абдоминальных подкожных инъекций в течение 5 недель. Были тестированы разные дозы (0.5, 2.0, 4.0 и 6.0 mg/kg) после оценки безопасности все пациенты получали 6.0 mg/kg дозовый режим в течение дополнительных 12 недель [79]. Биопсии мышцы tibialis anterior были взяты на исходе и после 2-х недель после введения последней дозы Drisapersen только у 3-х пациентов, соотв. группе, получавших дозу 0.5 mg/kg лекарства. Др. группа пациентов (2, 4 и 6 mg/kg) подвергалась процедуре мышечных биопсий спустя 2 и 7 недель после воздействия последней дозы. Результаты этого исследования оказались интересными увеличением позитивных по дистрофину мышечных волокон и увеличение общей экспрессии белка дистрофина (количественная оценка Western blot) [79]. Также 6-minute walk test (6MWT) отражал клинический успех Drisapersen со средним (±SD) улучшением 35.2 ± 28.7 m после лечения. Однако, эти данные по восстановлению дистрофина необходимо интерпретировать с осторожностью из-за того, что очень немногие пациенты (n = 3) получившие предсказанные терапевтические дозы подвергались на старте мышечной биопсии, что затрудняло демонстрацию продукции низких уровней дистрофина по отношению к низкому фоновому уровню остаточной экспрессии дистрофина, обычное состояние у мальчиков с DMD [12]. Недавно 188 недель спустя после open label extension описано состояние тех же самых DMD пациентов [79]. В самом деле, авт признались, что невозможно определить уровни дистрофина, индуцированного с помощью Drisapersen ASO из-за отсутствия baseline мышечной биопсии. Тем не менее клиническая оценка этих пациентов продемонстрировала очень обнадеживающее улучшение оценки 6 min walk test по сравнению to natural history controls, подтвеждая эффект лекарства на замедление прогрессирования болезни [80].
Отдельная фаза II исследования, контролируемая плацебо, была проведена, чтобы оценить безопасность и эффективность двух доз Drisapersen вводимых (непрерывно или прерывисто) в период 48 недель [81].
Биопсии мышц проводили спустя 1 неделю и 45 недель лечения. Биологические подходы, такие как RT-PCR, Western blot и immunofluorescence выявили небольшую фармакодинамику эффекта (восстановление дистрофина) ассоциированную с режимом Drisapersen. Статистически достоверное улучшение моторной функции было выявлено у пациентов с непрерывным режимом спустя 24 недели лечения, но поскольку различия были недостоверны спустя 48 недель, а позитивная тенденция в пользу Drisapersen наблюдалась в этот момент времени [81].
В дальнейшем 186 DMD пациентов были привлечены в фазу Drisarpersen III клинического испытания. Результаты этого исследования, однако, неудачными по первичным клиническим результатам (улучшению теста 6 MWT в леченой группе DMD treated cohort compared to theпо сравнению с группой плацебо) [82]. Возможным объяснением различий между этим и предыдущими исследованиями является существенно более продвинутое состояние болезни у DMD мальчиков участвовавших в последней III фазе по сравнению с участвовавшими во II фазе исследования. Т.к. у DMD имелась существенная потеря мышечной массы, то вполне возможно, что терапия, имевшая целью замедлить течение болезни, оказалась не в состоянии продемонстрировать клиническую эффективность, когда болезнь прогрессировала и потеря мышечной массы была значительной.
В ноябре 2014, BIOMARIN, биофармацевтическая компания США US разработала терапию этой редкой болезни, приобретшая Prosensa с целью использования имущества несостоятельного должника для разработки ASO и получения от надзорных органов разрешения (от Food and Drug Administration (FDA) и European Medical agency (EMA)) [83].
Однако, BIOMARIN получила негативный ответ от FDA относительно Drisapersen в декабре 2015 [84] и вскоре после этог от EMA. Это заставило BIOMARIN остановить разработку Drisapersen (а также др. базирующихся на PS ASOs в преклинических и клинических испытаниях) [85]. В феврале 2017, закрыт официальный веб-сайт испытаний, где сообщалось о 5 DMD клинических испытаниях Drisapersen (Figure 3). Figure 3. DMD antisense oligonucleotides in clinical trials. Data extrapolated from https://clinicaltrials.gov February 2017.



5.3. Morpholino ASO


Др. группой химически модифицированных соедине6ний нуклеиновых кислот, протестированных в клинических испытаниях DMD, является семейство PMO. Их период полу-жизни в сыворотке довольно короткий благодаря тому факту, чта в качестве неизмененных молекул они экскретируются более быстро [60]. По этой причине PMO требуют применения высоких доз, чтобы достичь фармакологически активной концентрации. Но не смотря на использование высоких доз, PMOs, по-видимому, довольно надежны, как показали Sazani и сотр. многими повторяющимися инъекциями в течение 12 недель 320 мг/кг на cynomolgus обезьянах [86] и в последующих клинических исследованиях. Первые PMO ASO были разработаны для пропуска экзона 51 компанией AVI Biopharma, недавно переименованную в Sarepta Therapeutics. AVI-4658 PMO, теперь наз. Eteplirsen, был применен в форме внутримышечных инъекций в мышцу extensor digitorum brevis у 7 DMD пациентов [87]. 5 из 7 DMD пациентов получали наивысшие дозы (0.9 мг/кг) и у них не отмечено побочных эффектов. Биологическая эффективность AVI-4658 biological efficacy was proven byбыла подтверждена увеличением средней окраски на дистрофин (17%) в обработанной мышце по сравнению с контрлатеральной не обработанной мышцей. Сообщалось об увеличении до 42% позитивных на дистрофин волокон по сравнению с мышцами, в которые вводился солевой раствор. Последующая внетривенная эскалация дозы PMO была предпринята на 19 DMD пациентах для индукции пропуска экзона 51 [88]. Eteplirsen применялся от 0.5 до 20 мг/кг еженедельно внутривенно в течение 12 недель. Мышечные биоптаты брали до и после лечения и анализировали экспрессию дистрофина с помощью RT-PCR, иммунофлюоресценции и Western blot. 7 пациентов отвечали на лечение, обнаруживая увеличение дистрофина с 8.9% до 16.4% по сравнению с уровнями, наблюдавшимися в биоптатах перед началом лечения. Подсчитаны позитивные по дистрофину волокна, наивысший ответ характеризовался увеличением до 15%, 21% и 55% по сравнению с результатами в биоптатах перед лечением. У 3-х пациентов с наивысшей реакцией, с помощью Western blot удалось подтвердить ранние находки по увеличению уровня белка после лечения от 2% до 18%, от 0.9% до 17% и от 0% до 7.7% о сравнению с уровнями дистрофина, обнаруживаемы в здоровых контрольных мышцах. Впоследствие 12 пациентов были задействованы для фазы IIb испытания с использованием плацебо в контроле [89].
Данное исследование было задумано как 24-недельное, рандомизированное, double-blind, с контролем плацебо и были исследованы три кагорты: placebo (n = 4), 30 мг/кг (n = 4) и 50 mg/kg (n = 4). Переде началом из бицепсов брали биоптат. Первая биопсия планировалась после проведения лечения в течение 12 недель у немногих пациентов: 4-х из группы 50 мг/кг и 2-х из подгруппы с плацебо. Иммуноокрашивание на дистрофин, в частности подсчет дистрофин-позитивных волокон не выявил увеличения между мышцами, обработанными 50 мг/кг Eteplirsen, по сравнению с базисной биопсией. На 24 неделе, др. подгруппа пациентов подверглась биопсии (n = 4 из когорты 30 мг/кг и n = 2 из когорты с плацебо). В этом случае, Mendell с колл. наблюдали 22.9% дистрофин-позитивных волокон на мышечных срезах пациентов, леченых 24 недели 30 мг/кг/неделя Eteplirsen. Спустя 24 недели double-blind воздействия лечение стало open-label выделением пациентов с плацебо в леченных группах (по два пациента на каждую подгруппу). На 48 неделе взята третья биопсия из левой deltoid у всех 12 пациентов.
Данные режимов с двумя дозами (30 mg/kg and 50 mg/kg) после 48 недель применения Eteplirsen показали увеличение процента позитивных по дистрофину волокон до 47.3% по сравнению с мышцами перед лечением. Более того, на 48 неделе лечения наблюдалось увеличение среднего уровня дистрофина, определяемого с помощью иммунофлюоресценции. Эти данные следует интерпретировать с осторожностью, если сравнивать с клинической функциональной оценкой в виде теста 6MWT. Скорректированная средняя величина изменений с 6MWT baseline с лечением в течение 24 недель группами (30 mg/kg and 50 mg/kg) compared to tпо сравнению с подгруппой с плацебо оказалась статистически недостоверной. На 48 неделях данные теста 6MWT были статистически достоверны для группы с 50 мг/кг, но не для пациентов группы с 30 мг/кг. Это оказалось связанным с двумя пациентами из группы 30 мг/кг, которые обнаружили быстрое и глубокое прогрессирование болезни. Один из этих пациентов проходил 346 м перед началом, но показатель снизился до 112 м при 6MWT на 4- неделе. У этого пациента описано увеличение волокон, позитивных по дистрофину в биоптате после лечения, но в то же время он потерял способность передвигаться [89]. Это наблюдение подчеркивает важность включения критерия тщательного выбора с тщательным учетом тяжести болезни и насколько мышцы повреждены перед стартом.
В др. недавней работе [90] представлены дополнительные функциональные данные (6MWT и функциональный легочный тест) для DMD леченной популяции, описанной выше. 12 , ранее отобранные для 48 недельного лечебного исследования [89], не прекращали прием Eteplirsen. Данные теста 6MWT получали раз в полгода между 48 и 168 неделями лечения. Mendell с колл. показали, что применение Eteplirsen вызывало у пациентов более медленное снижение 6MWT по сравнению с не леченным контролем. В самом деле, эта DMD когорта всё ещё лечится Eteplirsen, не обнаруживая серьезных побочных явлений и обнаруживая сдержанный клинический успех [90]. Установлено, что снижение 6MWT может зависеть от генетической мутации и последующего отличия в клиническом фенотипе [90]. PMOs сегодня разрабатываемые Sarepta Therapeutics, которая спонсирует клинические испытания на разных ст. развития: изучение пропуска экзона 51 (Eteplirsen-AVI4658) сегодня находится в фазе III, тогда как клинические исследования пропуска экзона 45 (SRP-4045) и экзона 53 (SRP-4053) сегодня находятся в фазе II. Сегодня официальный веб-сайт описывает 7 DMD клинических испытаний, связанных с применением Eteplirsen (Figure 3). Sarepta обратилась к FDA об ускорении получения разрешения на Eteplirsen в октябре 2015 и 19 сентября 2016 получила условное разрешения от FDA [91] и biopharma company веб-сайт [92]. Sarepta сегодня тестирует и др. PMO ASOs для пропуска др. экзонов при DMD в преклинических исследованиях.

6. Pre-Clinical and Clinical Approaches of ASOs in SMA


Поскольку ген SMN2 интактен у вех пациентов с SMA и они имеют обычно более одной копии SMN2, то альтернативный сплайсинг гена SMN2 становится привлекательной терапевтической мишенью, чтобы увеличить включение экзона 7 в зрелый транскрипт. В гене SMN2 немногие регуляторные элементы, как было установлено, модулируют альтернативный сплайсинг экзона 7. Сюда входит элемент 1 в интроне 6, SF2/ASF или hnRNP A1 сайт связывания в экзоне 7, the Tra2-β1 сайт связывания в экзоне 7, the 3' кластер на 3'-конце экзона 7, splicing silencer N1 (ISS-N1) и недавно описанный ISS-N2 в интроне 7, и сайты связывания hnRNP A1 в интроне 7 (Figure 4) [22,23,93-99].

Figure 4. Schematic representation of SMN2 exon 7 splicing regulatory elements and ASO targets. The functional elements regulating exon 7 splicing in SMN2 are depicted at the top of the figure. ASOs targeting these regulatory elements are listed below, including bi-functional ASO (grey oval) and conventional ASOs (yellow rectangle).

Возможны два подходя для стимуляции включения SMN2 экзона 7: (i) использование ASOs, чтобы блокировать мотивы сайленсера, напр., exonic splicing silencers (ESSs) или intronic splicing silencers (ISSs); или (ii) использование би-функциональных ASOs, чтобы предоставить транс-действующие энхансеры сплайсинга экзона (ESEs) в экзоне 7. Би-функциональные ASOs были разработаны с одним доменом, который предназначен, чтобы отжигать (anneal) с экзоном мишенью и второй (хвостовой) домен, который содержит последовательности (напр., GGA мотив), с которым белки активаторы, такие как SR белки, будут соединяться. Метод, названный 'targeted oligonucleotide enhancers of splicing (TOES)', был описан, как использующий эту стратегию. TOES стимулирует сплайсинг SMN2 экзона 7в ядерных экстрактах бесклеточной модели и в фибробластах, полученных от SMA пациентов [100,101]. Сходная стратегия, "exon-specific silencing enhancement by small chimeric effectors" (ESSENCE), которая представлена минимальным синтетическим RS доменом, чтобы соперничать с функцией SR белков, обнаруживает эффективность в снижении сплайсинга экзона 7 in vitro [102]. В противоположность многообещающим результатам in vitro, оценка in vivo би-функциональных ASOs у SMA мышей показала значительно меньшую эффективность, чем обычных ASOs [103]. Би-функциональный ASO , целенаправленно воздействующий на интронный репрессорный элемент 1 (E1) в интроне 6 обнаруживают довольно слабую эффективность у SMA мышей с терминах нормализации фенотипа [103]. Однако, последующие исследования с использованием обычных ASOs, чтобы целенаправленно воздействовать на последовательность intronic splicing silencer N1 (ISS-N1) в интроне 7 заметно продвинули исследования с использованием ASOs в качестве терапевтической стратегии при SMA, т.к. они все обнаруживают поразительную эффективность в восстановлении SMA мышей разных трансгенных моделей с разными химическими модификациями ASOs.
ISS-N1 является последовательностью в 15 нуклеотидов, начинающейся с позиции +10 по +24 позицию нуклеотида в SMN2 интроне 7. Его функция заключается в регуляции включания экзона 7 в ген SMN2 [97,104]. Значительное количество исследований in vivo на трансгенных SMA мышах с использованием ASOs, воздействующих на последовательность ISS-N1, было проведено и получены довольно обнадеживающие данные пока для экспериментальной терапии SMA. В этих исследованиях протестированы три разные химические модификации в ISS-N1 ASOs. Химия этих ASOs включает 2'-OMe, 2'-O-2-methoxyethyl phosphorothioate (MOE) и PMO ASOs. Первое исследование ISS-N1 ASO проведено группой Krainer с использованием MOE инъецируемых внутривенно взрослым неповрежденным гетерозиготным hSMN2 трансгенным мышам. Поскольку наблюдалась достоверная коррекция сплайсинга экзона 7 в периферических тканях, напр., в печени, почках и мышцах, но не обнаруживалось коррекции в спинном мозге [104]. Этот результат был ожидаем, т.к. MOEs не пересекают BBB барьер. Прямое внесение в ЦНС ISS-N1 ASO на остове 2'-OMe, было описано у SMA трансгенных мышей. Хотя не наблюдалось достоверного улучшения SMN белка по всей ЦНС, которым сопровождалось увеличение веса тела после повторных intracerebroventricular (ICV) инъекций новорожденным Δ7SMA мышам, к сожалению, не приведены данные по жизнеспособности, когда эксперименты заканчивались на ст. P12 [105]. Более того, способствующий воспалению эффект в головном и спинном мозге был обнаружен, когда применяли 2'-OMe ASO в ЦНС, при отсутствии какого-либо эффекта на включение SMN2 экзона 7 [106]. Модификация остова в хим. состав MOE с использованием 18-mer ISS-N1 ASO (ASO-10-27), достоверно увеличивалась продолжительность жизни SMA мышей после системного введения [26]. Дальнейшие исследования in vivo ряда ASOs на остове PMO, с помощью целенаправленного воздействия на ISS-N1 мотив и фланкирующие последовательности было показано существенное восстановление у трансгенных мышей, моделирующих тяжелую SMA [28-30]. Имеется зависимый от длины эффект PMO ASO [29]. Преимущество остается за 25 mer PMO (-10, -34) перед более короткими 20 или 18 mer PMOs, по усилению сплайсинга SMN2 экзона 7 в клеточных и тканевых проверках, а также улучшается жизнеспособность SMA мышиных моделей, что подтверждено в трех независимых исследованиях [29,30,107,108]. Кроме того, комбинированное системное и локальное воздействие ICV PMO подтверждает большую целительность у SMNΔ7 мышей, чем индивидуальные соответствующие способы доставки [108]. При субоптимальной дозе 25 mer PMO генерирует промежуточных SMA мышей, второе же применение PMO с помощью системных инъекций существенно увеличивает жизнеспособность у улучшает фенотип по сравнению с ICV инъекциями [107].
Клинические испытания одного из этих соединений быстро прошло фазу I, перешло к фазе II, phase III исследований на детях с type I SMA, и более взрослыми не постельными детьми с SMA II и III. Эти ASO, наз. Nusinersen (IONIS-SMNRX, ASO-10-27), вводили детям с SMA компанией Ionis pharmaceutics в 2012 (ClinicalTrials.gov ID: NCT01494701) (http://clinicaltrials.gov). В первом open-label и escalating dose исследовании, описанном в Table 1, пациенты хорошо переносили одиночную терапевтическую дозу в 1, 3, 6 или 9 мг ASO, применяемого intrathecally с помощью спинномозговой пункции. Более того, наивысшая доза в 9 мг, предоставляла пациентам существенно улучшить функциональную способность спустя 3 мес. после дозы и возрастала далее спустя 9-14 мес. post dose во время расширенного исследования [8]. Базируясь на обнадеживающих данных, последующая фаза Ib/IIa тестировала безопасность, переносимость и фармакокинетику многих доз Nusinersen используемого intrathecally (ClinicalTrials.gov ID: NCT01703988) у SMA пациентов с 2 до 15 лет.
Наконец, крупная фаза III испытаний во многих центрах детей с SMA была начата Ionis по оценке эффективности и безопасности Nusinersen у детей с SMA (ClinicalTrials.gov ID: NCT02193074). Удивительно., это последнее исследование было недавно прервано , как исследование, столкнувшееся с pre-specified functional primary endpoints и сегодня все дети были переведены с плацебо на контролируемую часть исследования с открытым мечением, когда все дети получали активное лечение.
В декабре 2016, FDA объявило о разрешении Nusinersen, с коммерческим названием Spinraza, в качестве первого лекарства, одобренного для SMA [109]. Spinraza теперь доступен на рынке от Biogen [110]. SMA традиционно рассматривалась как болезнь с избирательной низкой двигательной активностью нейронов в передних рогах, служащих первичной патологической мишенью. Увеличение количества клинических и экспериментальных исследований показывает участие дополнительных периферических органов, таких как дисфункции сердца и некроз дистальных частей пальцев [111,112]. Спектр затронутых органов даже шире у мышей, моделирующих тяжелую SMA с вовлечением мышц, головного мозга, сердца, афферентных нервов, сосудистой сети, костей, поджелудочной железы, легких и даже репродуктивной системы [112-118]. Комбинированно применение в ЦНС и системно ASOs приводит к больше доле выживания у SMA трансгенных мышей [107,108]. Было продемонстрировано, что регулярное системное применение PMO ASO у модельных мышей со средним проявлением SMA от рождения до взрослой ст. демонстрирует терапевтическую пользу и улучшение SMA фенотипа, преимущественно за счет восстановления периферических SMN [107]. SMN является критическим для развития двигательных нейронов и созревания нейро-мышечных соединений [119,120] , а полная потеря SMN является эмбриональной леталью и приводит к гибели эмбрионов до имплантации [121,122].
С другой стороны, сообщения о пост-симптоматическом восстановлении сж системного введения ASO мышам с SMA показывает, что эффект, скорее всего, обусловлен укреплением сущестующих NMJs скорее, чем их созреванием [123]. Восстановление SMN с помощью ASO в периферических органах может вызывать дальнейший терапевтический успех и фенотипическое восстановление, по крайней мере, у мышей. Однако, значение патологии периферических органов для прогрессирования болезни у людей на сегодня неизвестно. Недавние положительные клинические испытания Ionis четко подтвердили, что восстановление экспрессии SMN белка в ЦНС достаточно, чтобы индуцировать существенный успех у детей с типа I SMA. Может ли быть вызыван подобный успех от восстановления SMN на периферии, остается под вопросом.

7. ASO Therapy in Other Neuromuscular Disorders


В последние годы стратегия антисмысловых олигонуклеотидов была оценена при лечении др. нейромышечных заболеваний, таких как миотоническая дистрофия, oculopharyngeal мышечная дистрофия, ламинопатии, болезнь Помпе, врожденные миастенические синдромы и facioscapulohumeral мышечная дистрофия [124].

7.1. Myotonic Dystrophy


Миотоническая дистрофия (DM) является одним из наиболее распространенных нейромышечных заболеваний у взрослых. Существуют две генетически отличающиеся формы, Myotonic dystrophy type 1 (DM1, Steinert's болезнь), вызываемая экспансией CTG повторов в 3' UTR регионе гена myotonic dystrophy protein kinase (DMPK) , и Myotonic dystrophy type 2 (DM2, проксимальная миотоническая дистрофия) обусловленная повторами CCTG в интроне 1 гена CNBP (известен также как CCHC-type zinc finger, нуклеиновые кислоты связывающий белок). На молекулярном уровне обе мутации вызывают токсическую избыточную функцию мутантной РНК, которая сохраняется в ядре в виде агрегатов или фокусов, затрагивающих функцию регуляторов альтернативного сплайсинга, таких как MBNL и CELF1 белков [125]. В настоящее время отсутствует лечение этой болезни даже с помощью разнообразных терапевтических подходов, нацеленных как на РНК, так и белок [124]. В преклинических исследованиях Wheeler с колл. разработали 2'-O-methoxyethyl (MOE) gapmer ASO, способный вызывать деградацию мутантных РНК транскриптов с помощью механизма RNAase-H. Они продемонстрировали, что MOE gapmer-ASO активен против мутантной мРНК DMPK с уменьшением in vivo и in vitro аберрантных транскриптов [125,126]. Эти результаты подтверждены в первом DM1 клиническом испытании, инициированными Ionis Pharmaceuticals, базируясь на стратегии ASO (ISIS-DMPKRx). Недавно проведена фаза I/IIa клинического испытания на DM1 взрослых пациентах законченная Ionis [127]. Это исследование с эскалацией дозы оценило безопасность и переносимость воздействия ASO целенаправлено на DMPK транскрипт. Получены мышечные биопсии и первичные биологические результаты (primary biological endpoints) были оценены в отношении мониторинга биомаркеров и изменений сплайсинга. Ionis сообщила о небольшом, но достоверном биологическом изменении в мышечных биоптатах пациентов и наблюдали, что концентрация ASO не достигала терапевтической дозы для поддержания потенциального клинического успеха. Поэтому Ionis решила остановить клинические испытания и расширить пре-клиническую разработку LICA (Ligand-Conjugated Antisense) молекул для лечения миотонической дистрофии [127].

7.2. Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy


Facioscapulohumeral muscular dystrophy (FSHD) является одной из наиболее превалирующих мышечных дистрофий у взрослых, она характеризуется слабостью затронутых мышц лица, плеч и рук. Около 95% пациентов (классифицированных как FSHD1) представлены делециями повторяющейся последовательности в D4Z4 регионе на хромосоме 4q35.3, а субпопуляция (5%) случаев (названная ка FSHD2) имеет мутации, которые осуществляют свой эффект с помощью D4Z4 зависимого от делеции пути [128,129]. Разные гены кандидаты были заподозрены и недавно де-репрессия ретрогена DUX4 была предложена в качестве причины патологии при FSHD в виде токсичной избыточной функции [130]. Следовательно, подавление аберрантной экспрессии DUX4 с помощью замалчивания гена д. стать обещающим терапевтическим подходом. Две группы, Marsollier et al. и Chen et al. сообщили об эффективности анти-смысловых phosphorodiamidate morpholino олигонуклеотидов по супрессии экспрессии DUX4 в FSHD клеточной модели [71,72] и в ксенографтам мышц от FSHD пациентов мышам [72] путем целенаправленного воздействия на сигнал полиаденилирования DUX4. Они также продемонстрировали, что PMO может снизить аномально высокую экспрессию многих генов, стоящих ниже пути DUX4. Эти результаты демонстрируют потенциал использования PMO для лечения FSHD.

8. Delivery of ASOs


Одним из основных вопросов использования ASOs с целью терапии является эффективная доставка к сайтам мишеням. Молекулы ДНК и РНК д. пересечь несколько физиологических барьеров прежде, чем достичь своих внутриклеточных мишеней [131].
После использования ASOs должны достигать ткани мишени, не затрагивая др. органы, избегая быстрой дегенерации в биологических жидкостях и быстрой очистки. Кроме того, они д. пересекать барьер сосудистого эндотелия и проникать в необходимый внутриклеточный компартмент [7,132]. Поскольку химические и физические свойства соединений ASO оказывают влияние на их фармакокинетику и биораспределение, то были предприняты обширные исследования по модификации химической структуры в целях улучшения их стабильности, специфичности и снижения токсичности [133]. Две основные стратегии могут быть использованы для доставки ASO: вирусная и не вирусная доставка.
Несмотря на то, что вирусные векторы являются эффективными системами доставки генетического материала и способны инфицировать большое количество клеточных типов, они обнаруживают некоторые ограничения для клинического использования. Этими ограничениями являются: (i) иммуногенность, которая приводит к слабому удержанию в клетке и индукции воспалительной реакции; (ii) риски возникновения опухолей; (iii) ограниченность загрузки на них и (iv) и проблемы scaling-up [131,134]. Не вирусная доставка представляет собой хорошую альтернативу благодаря отсутствию иммунной реакции [135], стабильности, возможности связывать большие количества нуклеиновых кислот и осуществлять модификации поверхности для целенаправленного воздействия на специфическую ткань [131].
Конъюгация свободных ASOs с невирусными поставщиками может быть достигнута с помощью двух подходов, один это инкорпорация их в нано-частицы (NPs), которые в зависимости от их размера и материала, будут предопределять биораспределение и взаимодействия ASO; второй - это конъюгация ASO с лигандами мишенями, которые могут распознавать специфические рецепторы и проникать в клетки посредством рецепторами обеспечиваемого эндоцитоза [7,132].
Главным отличием между двумя методами является размер, нано-шкала для первого и молекулярная шкала для второго метода и оба подхода имеют разные преимущества и недостатки. Благодаря своим размерам NPs имеют ограниченное биораспределение, поскольку они не могут эффективно пересекать эндотелий капилляров. Однако, благодаря малому размеру они быстро удаляются почками. Нано-частицы могут связывать большие количества олигонуклеотидов, которые будут проникать в клетку в виде одиночного события, но чтобы достичь эффективной концентрации ASO д. предоставляться большие количества нано-материалов для доставки и они будут накапливаться и могут вызывать токсичность, особенно если нано-частицы являются биологически совместимыми и не деградируют. В то время как молекулярные конъюгаты способны доставлять лишь одиночный нуклеотид для каждого потребления и необходимы многочисленные события для получения фармакологической концентрации. Более того, NPs-ASO комплекс может защищать нуклеиновые кислоты от нуклеаз в отличие от конъюгатов [7].
Разные исследования для повышения доставки в клетки терапевтических ASOs для регуляции сплайсинга РНК были предприняты с использованием богатых аргинином (CPPs). Как уже упоминалось в Section 2.2, наиболее успешные CPP конъюгации это с видами ASO заряженными нейтрально, такими как PNA и PMO [46]. Этот подход проверялся в преклинических исследованиях при DMD и SMA, и анализ in vivo был осуществлен как на mdx, так и SMA мышах.
Wu с колл. протестировали использование CPP, сконъюгированных с PMO на mdx мышах и продемонстрировали восстановление дистрофина в скелетных мышцах, а также в сердце [136]. Затем была разработана серия peptide nucleic acid/ PMO internalization peptides (Pips), происходящих из CPP Penatratin и была установлена их высокая устойчивость к протеолизу сыворотки. Pip2a и Pip2b пептиды были способны индуцировать пропуск экзонов в транскрипте дистрофина после внутримышечных инъекций mdx мышам [50]. Модификации Pips соединений привели к идентификации альтернативных CPP, сконъюгированных с ASO (Pip5e-PMO) с наилучшей модуляцией активности сплайсинга дистрофина после системного введения mdx мышам, включая и сердце [54].
Однако, позитивно заряженные пептиды увеличивали токсичность, делая их непригодными для применения в течение жизни как в случае с DMD [137].
Pip-PMO конъюгаты были также исследованы в преклинических исследованиях SMA. Недавно pip6a-PMO были исследованы на SMA и было показано восстановление во всем теле SMN на периферии и в тканях ЦНС после системного применения [138]. Успешное устранение SMA фенотипа и драматическое удлинение жизни у мышей с тяжелой SMA продемонстрировало высокий потенциал Pip-PMO терапии для SMA [138]. Пептид (RXR)4, B-пептид или фаговые пептиды обнаруживают усиление in vivo пропуска экзонов по сравнению с голым ASO, также и в сердечной мышце [133].
Др. класс конъюгатов - это vivo-morpholinos (vPMOs), dendrimeric octaguanidines олигомеры, способные модулировать эффективность сплайсинга [139]. Однако, не наблюдалось улучшения терапевтической эффективности in vivo у мышей, моделирующих тяжёлую SMA, когда vivo-morpholino сравнивали с голыми PMO, что, скорее всего, обусловлено потенциальной их активностью in vivo [29,108].
Wang с сотр. впервые оценивали катионовые polyelectrolytes (PEs) в качестве векторов для PMO in vitro и in vivo экспериментах (mdx mice мыши) . Они продемонстрировали, что серия poly (diallyldimethylammonium chloride) (PDDAC) полимеров может улучшать доставку PMO без локальной токсичности [140].
В последние годы прогресс нано-технологии предоставил несколько нано-систем для усиления целенаправленной доставки лекарств. Исходя из них, нано-частицы могут быть классифицированы по разным категориям и наиболее распространенными типами, используемыми для доставки лекарств являются:
  • Solid Lipid Nanoparticles (SLNs), которые делают натуральные, полусинтетические или синтетические липиды биологически совместимыми и легко продуцируются в крупных масштабах, они могут защищать лекарства от деградации и контролировать высвобождение молекул [141].
  • Полимерные нано-частицы (включая micelles, nanocapsules, nanospheres, colloids, dendrimers, core-shells), которые может быть загружено лекарство разными способами, т.e., отлавливанием, рассеиванием, растворением или адсорбцией [142]. Примером полимерных нано-частиц, используемых для конъюгации с ASOs для пропуска экзонов при DMD являются катионовые core-shell NPs, называемые T1 и ZM2, состоящие из polymethyl methacrylate (PMMA) сердцевины, окруженной катионовой оболочкой для связывания ASO binding. T1 и ZM2 NPs обнаруживают способность доставки 2'OMePS M23D ASO у mdx мышей. В частности, при внутрибрюшинном или оральном применении ZM2-ASOs комплексов, индуцирующих восстановление дистрофина в преклинических исследованиях [143-147].
  • Lipid-based Nanoparticles (LNPs), состоящие из катионного липида и др. соединений, наз. "helper lipids" , которые вносят вклад в их стабильность и эффективность доставки. LNPs для анти-смысловой доставки обычно инкапсулируют ASO внутри водной сердцевины и между бислоями [148].
  • Carbon-based nanomaterials, подобно графену, nanodiamond, fullerenes, nanotubes, используются для разных целей, включая доставку и отслеживание лекарств в медицине [149].
    • Все системы доставки вместе с др. доступными векторами, не представленными здесь, могут быть использованы при др. болезнях, где лечение с помощью ASO является приемлемым терапевтическим подходом, таких как SMA и миотоническая дистрофия.
    В целом биологически совместимые нано-частицы обычно не разлагаются и стремятся накапливаться особенно при повторяющихся применениях, напр., при хронических болезнях. Поэтому полностью биологически разлагаемые нано-частицы., такие как нано-молекулы альбумина, экзосомы или нано-капельки являются более привлекательными для доставки лекарств. включая и ASOs.

    9. Conclusions


    In the last two decades, there has been remarkable progress in the molecular understanding of the common neuromuscular conditions, which has resulted in an impressive improvement in the diagnosis and management for these conditions. In the last few years, this knowledge has been also exploited to develop novel innovative therapeutic interventions, in which ASOs played a central role.
    Indeed, the human genome project output greatly contributed to these goals, and made feasible new therapeutic approaches as classical gene therapy, splicing modulation, RNA interference. It is likely that the combination of these strategies will expand even further for the treatment of rare neuromuscular (and other) disorders. In addition, the revolutionary CRISP-Cas9 genome editing may offer more novel therapeutic opportunities [150], if safety issues and off-target effects are solved. ASO therapies remain a valid and relatively safe approach, with increased use in clinical trials and now either approved, or in the path for approval, for several disorders. Delivery of ASOs is still a key point that should be carefully addressed, since tissue targeting is vital to reach satisfactory drug distribution therefore increasing therapy efficiency.
    Preclinical and clinical investigations for treating neuromuscular disorders have been at the cutting edge on developing extraordinarily gene therapy studies.
    We anticipate that ASO approaches for treating severe neuromuscular conditions will be a research model for improving gene therapy investigations for other disorders. Furthermore, current investigations in this field will enhance ASOs delivery improving tissue targeting specificity and increasing ASO efficacy.