Advances in Genome Editing | |
|---|---|
|
|
 Исследователи из Harvard University модифицировали CRISPR/Cas9, создав новый "редактор оснований" Nature, который постоянно и эффективно превращает основание цитозин (C) в урацил (U) с малым количеством ошибок клеточных линях мышей и человека.
Механизм homology-directed repair, который запускается при разрывах двойной нити ДНК, неэффективен (инкорпорации редки) и часто вносят новые ошибки в форме случайных indels вокруг разрыва.
Исследователи из Harvard инактивировали часть Cas9, так что она не может вызывать разрывы двойной нити. Замем они привязали Cas9 к энзиму, наз. cytidine deaminase, который непосредственно катализирует превращение C в U (по-существу эквивалент тимина, T), без разрезания ДНК. Посылка такого аппарата в клетку создает несоответствие (mismatched)оснований в мишени, соответственно между новым внесенным U, и исходным гуаниновым основанием(G) на противоположной нити. "Это [несоответствие] искажает ДНК," объясняет Liu. "Это создает забавное небольшое выпячивание, которое не выглядит нормальным."
Выаячивание приводит в готовность разные клеточные механизмы репарации, mismatch repair, которые удаляют одно из несоответствующих др. др. оснований и замещают его комплементарным к оставшемуся основанию. В отсутствие какой-либо информации о том, какое из оснований неправильное репарация несоответствия вызывает желательное превращение G в A приблизительно в 50 % времени; остальное время тратится на превращение U обратно в C.
Но устранение несоответствия не содержит дальнейшей необходимой информации: обнаруживаются крошечные разрывы в остове ДНК, называемые зарубки) "Вновь синтезированная ДНК обнаруживает тенденцию иметь несколько nicks. Следовательно, возможно манипулировать репарацией несоответствий, корректируя нити ДНК, которые мы не желаем, а именно нити, содержащей G ", сказал Liu.
Затем Cas9 снова был модифицирован, на это раз так, что стало можно создавать nick в неподвергнутой редактированию, G-содержащей нити, тогда как оставшаяся редактированной, U-содержащая нить остается интактной. "Теперь клетка говорит, 'Ага несоответствие находится здесь и виновые основания д.б. G, поскольку это д. быть вновь синтезированная нить,т.к. она содержит в себе nick,'" говорит Liu. " и будет преимущественно корректироваться эта G, с использоанием др. нити в качетве матрицы."
Применив эту технику к 6 локусам в клетках человнка, группа сообщила о целенаправленной коррекции оснований у более 37 процентов, приблизительно 1% последовательностей обнаруживал indels. Напротив, обычная техника Cas9 редактирования, тестированная по 3 локусам, обнаружила менее 1% эффективности и более 4% образования indels. Исследователи также продемонстрировали потенциал техники по коррекции ассоциированных с болезнью мутаций путем превращения варианта APOE, гена, сцепленного с болезнтью Алцгеймера, в в версию с низким риском в клетках мышей.
Однако, поскольку метод пока способен только превращать C-G в U-A (т.e., T-A) пары оснований и в некоторых случаях редактирует др. C основания в непосредственной близости к мишени, но он будет улучшен.
Также появившиеся в Nature две работы, были повящены потенциалу альтернативному Cas9: энзиму Cpf1. CRISPR/Cpf1 создает "липкие концы"- довески на разрезанной ДНК, которые покидают неспаренные основания на каждой из сторон разрыва, скорее, чем тупые концы, продуцируемые с помощью Cas9's разрезания двойной нити ДНК.
Emmanuelle Charpentier с колл. в Max Planck Institute for Infection Biology в Германии показали, что в отличие от Cas9, Cpf1 преобразует и РНК в добавление к разрезанию ДНК. Между тем Zhiwei Huang из Harbin Institute of Technology, Китай, с колл. описали краталлическую структуру CRISPR/Cpf1.
"Липкие концы более эффективны, чем тупые концы для репарации ДНК в клетках," говорит Huang. "Мы полагаем, что нимание структуры Cpf1 может помочь нам не только узнать, как работает механизм Cpf1, но и разработать более специфический и более эффективный инструмент радактирования генома." |
