Дегенерация межпозвонковых дисков (IVD) является связанным с возрастом процессо, который характеризуется катаболическим сдвигом, приводящим к разрушению матрикса и в конечном итоге к структурной недостаточности. iВидимые дегенеративные изменения впервые появляются в nucleus pulposus (NP) и связаны со сдвигом от коллагена типа II к более фиброзному типу коллагена I, а также с редукцией протеогликанов и последующей потерей гидротации и высоты диска.¹ Однако, annulus fibrosus (AF) также подвергаются дегенеративным изменениям, на что указывает дизорганизация ламеллярной структуры, возможно приводящая к структурным дефектам, таким как расщепления и слезы (tears).² Измененный биохимический статус во время дегенерации вносит вклад в развитие тканевых повреждений путем возникновения областей с пиками напряжения, воздействующих на дизинтегрированную ткань гиперфизиологическими нагрузками, которым невозможно противостоять.³ Поскольку IVD обладают низкой регенеративной способностью и заживление возможно только на месте наружной части AF, где доставка питательных веществ наибвысшая, дегенерация постепенно прогрессирует при отсутствии лечения.

Хотя дегенерация дисков является главной причиной болей в спине, только у части она становится симптоматичной и ощущается как т. наз degenerative disc disease (DDD), которая связана с повышением давления воспалительных молекул, включая interleukins IL-1β, IL-8, and IL-6 и tumor necrosis factor (TNF)-α (rev. References 4-7). В этот момент пациенты, страдающие от DDD первоначально лечатся консервативно, т.е. с помощью физиеотерапии и аналгетиков, но может быть также подвергнута дискэктомии, если симптомы не снижаются. Т.о., современное лечение нацелено на симптомы, но не подлежащие молекулярные процессы, вызывающие дегенерацию дисков и боли. Поэтому оновные усилия направлены на разработку новых, биологически нацеленных опций, с упором на 2 подхода: с одной стороны, регенеративная терапия для противодействия дегенеративному процессу пока без ясных результатов. Использование клеточной терапии, напр., лечение стволовыми клетками. негативно затрагивает микроокружение IVD, это характеризуется высокими механическими нагрузками, воспалительными цитокинами, гипоксией, низкими уровнями глюкозы, кислым pH и высокой осмолярностью.⁸ Использование анаболических субстанций приводит к затруднению продукции внеклеточного матрикса (ECM) из-за низкого количества клеток внутри IVD (4000 cells/mm3 в NP и 9000 cells/mm3 в AF) и ещё более из-за того, что эти немногие клетки метаболически не очень активн.^{9, 10} Результатом инъекций классических анаболических факторов, таких как bone morphogenetic protein (BMP)-7;, transforming growth factor (TGF)-β или growth differentiation factor (GDF)-5 становятся ещё большие проявления из-за короткогой полу-жизни этих ростовых факторов и их быстрой диффузии из IVD.⁸

С др. стороны многочисленные недавние исследования сфокусированы на способах модуляции воспаления в IVD, в основном путем подавления воспалительного каскада (напр., epigallocatechin gallate [EGCG], resveratrol или piperine)^11-13 или путем нейтрализации воспалительных медиаторов (напр., infliximab, a TNF-α ингибитор ¹⁴). Хотя такие молекулярные воздействия составляют новые способы молекулярной модуляции болезни, их успех скорее неудовлетворителен особенгно из-за повторяющихся инъекций лекарств в IVD.¹⁵

геномное редактирование приводит к стабильному фенотипическому изменению и поэтому может постоянно устранять лежащуют в основе болезни причину болезни. Техника точного генетического репрограммирования обладает огромным потенциалом изменения традиционного "симптоматического" лечения не только моногенных болезней, но и также связанных с фозрастом и цивилизацией нарушений. Кроме того, эти техники могут быть применены к базовым и преклиническим исследованиям, чтобы генерировать болезненные фенотипы in vitro и in vivo/ Кстати, известная техника геномного редактирования базируется на ДНК-связывающих нуклеазах, а именно преобразованной Zinc Finger Nucleases (ZFN) и Transcription Activator-like Effector Nucleases (TALEN), а также на наводящих РНК нуклеазах, особенно Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats-associated Cas9 (CRISPR/Cas9).¹⁶ ZFNs и TALENs были использованы для непосредственгой коррекции мутаций, вызывающих болезни, связанные с гемофилией B или серповидно-клеточной болезнью. ZFN- и TALEN-базирующиеся терапии продемонстрировали успешность в клинических испытаниях, напр., для HIV, подтвердив потенциал геномного редактирования для использования в базовой науке, медицине и биотехнологии. Однако, их основным неудобством стали связанные с ними с проблемы (относительно затруднительная подготовка функциональных ДНК-связывающих нуклеаз) и затраты, связанные с их разработкой и развитием.^{17, 18} CRISPR/Cas9 вызывает разрывы двойной нити ДНК (DSB) в геномном локусе мишени, её легче препарировать и перепрограммировать.

Система CRISPR/Cas9 состоит из бактериальной эндонуклеазы Cas9, которая может быть напрправлена на любую последоваательность ДНК c помощью single-guide RNA (sgRNA). sgRNA - это короткая синтетическая РНК, состоящапя из каркасной последоваательности, необходимой для связывания Cas9, т.е. crRNA, петли, и транс-активирующей crRNA (tracrRNA), и польтзователем определяемый вариабельный в 17-20 нуклеотидов спейсер, определяющий мишень в геноме для модификации.²⁰ Короткий нуклеотидный спейсер в sgRNA является комплементарным последоваательности мишени в ДНК генома в тесной близи к protospacer adjacent motif (PAM)? который, в случае Cas9 получен из Streptococcus pyogenes, он законсервирован в виде NGG последоваательности. Однако, PAM не является частью gRNA т.к. он присутствует только в нижестоящей ДНК мишени (Figure 1).^{21, 22} Распознавание ДНК мишени гарантируется формированием гетеродуплекса между нуклеотидами спейсера из sgRNA и комплементарной нитью ДНК мишени, это сопровождается обеспечиваемым c помощью Cas9 разрезами ДНК.²³ Обычно дикого типа Cas9 обнаруживает активность по разрезанию двунитчатой ДНК, обеспечиваемой двумя дорменами, RuvC и HNH.²⁴ По сравнению с др. компонентами наведения программируемая нуклеаза воздействует целенаправленно на ДНК локус, разработка и синтез sgRNA довольно просты и подходящи по цене. Однако sgRNA всё ещё может распознавать в геноме схожие одиночныеоснования, вызывая нежелательные DSB и мутации. Чтобы уменьшить это неудобство разрабатываются более точные sgRNA, синтетически продуцируются Cas9, или nickase-Cas9 (Cas9n) с точечной мутацией D10A, обладающей способностью разрезать только одну нить ДНК.^25-27 Система CRISPR/Cas9 была успешно использована для индукции мутаци1й одиночных генов, множественных мутаций в одной клетке,²⁸ и разрезание сильно метилированных регионов.²⁹ Более того, получен набор разнообразных мутаций.^{25, 30, 31} Поэтому CRISPR/Cas9 представляет собой программируему, разностороннюю и эффективную систему редактирования любого гена. Кстати, система была использована для выявления точной функции генов, джля обнаруэжения новых лекарственных мишеней, продукции аккуратных моделей болезней человека и разработтки можной эффективной генотерапии.^{32, 33}



Figure 1 Open in figure viewerPowerPoint

Schematic representation of the CRISPR/Cas9 system. Single?guide RNA (sgRNA) consists of tracer RNA (trRNA); a loop; crispr RNA (crRNA); and protospacer sequence, which is homologous to the target DNA. wtCas9 possess 2 cleavage activities, HNH and RuvC. CRISPR/Cas9 editing tools consist of sgRNA guiding precisely the Cas9 enzyme to the DNA based on the homology between the protospacer motif and DNA. When the heteroduplex between sgRNA and target DNA is formed, Cas9 performs DNA cleavage in close proximity of the PAM sequence and introduces a double?strand DNA break

Базирующаяся на CRISPR/Cas9 техника может быть использована не только для разрушения, но и для репарации и/или регуляции экспрессии генов (Figure 2). Чтобы сгенерировать CRISPR/Cas9-обеспечиваемый нокаут, РНК-гид Cas9 индуцирует DSBs, обычно вызывающие путь репарации посредством соединения негомологичных концов the nonhomologous end-joining (NHEJ). NHEJ вызывает небольшие случайные вставки или делеции (indels), приводящие к мутациям сдвига рамки считывания и потере функциональных фенотипов.³⁴ CRISPR/Cas9-обеспечиваемое редактирование генов происходит в присутствии матричной ДНК, когда DSBs репарируются подобным образом, то это наз. путем homology-directed repair (HDR), который действуцет вместо NHEJ и делает возможной точную инсерцию донорской ДНК в сайт мишень. Помимо сайт-специфичности репарации ДНК, HDR может использоваться для генерации контролируемого нокаута генов и инверции маркерных последовательностей или гене резистентности для дальнейшей селекции клеток с желательным фенотипом.³⁵ CRISPR/Cas9-обусловленная регуляция транскрипции генов может быть достигнута с помощью CRISPR interference (CRISPRi) и CRISPR activation (CRISPRa), включая CRISPR/Cas9-обеспечиваемую эпигенетическую модификацию гистонов. Эти техники используют каталитически неактивную RNA-guided Cas9 (т. наз. dead Cas9, dCas9), слитую с транскрипиционными активаторами и репрессорами (VP64 и KRAB, соотв.)^{36, 37} или с гистон-модифицирующими доменами (напр., p300, LSD1), которые могут регулировать транскрипцию путем изменения структуры хроматина.³⁸ Эти gRNA-dCas9 комплексы могут быть разработаны, чтобы обратимо целанеаправлено воздействовать на специфические регуляторные последовательности, действуя в качестве каркаса для различных факторов транскрипции или непосредственно взаимодействовать стволовые клеткией.^{17, 33} Кроме того, технология CRISPR (в частности CRISPR/Cas13) может быть использована для редактирования РНК путем целанаправленного действия Cas13a белка на РНК, вместо ДНК.³⁹



Figure 2 Open in figure viewerPowerPoint

Mechanism of action of CRISPR/Cas9?based techniques. (1) CRIPSPR/Cas9 gene editing: wtCas9 with both cleavage activities is used to create a double?strand break on the target DNA, which can be repaired either by nonhomologous end joining (NHEJ) or by homology directed repair (HDR) in case a template DNA is provided. (2) CRISPR/Cas9 interference (i) or activation (a): deathCas9 (dCas9) without cleavage activity is guided to the DNA site around the transcription start site. dCas9 fused with KRAB domain is used for transcription repression, whereas dCas9 fused with VP64 is used for transcription activation of target gene. (3) CasFISH?mediated chromosome labeling. dCas9 is fused with fluorophore tag and guided in vitro to the target chromosomal DNA that shall be visualized

Table 1. Specifications of different CRISPR/Cas?based techniques

CRISPR/Cas9 позволяет определять, как генотип влияет на фенотиппутем выявления деталей генетической и эпигенетической регуляции функции клеток. изучению IVD исторически препятствовала медленная пролиферация и дедифференцировка клеток IVD, а также отсутствие стабильных клеточных линий. Недавно иммортализованные NP и AF клеточные линии крыс были получены с использованием rho-associated kinase (ROCK) ингибитора Y27632.⁴⁰ Поскольку ингибиторы киназ часто обнаруживают неспецифические эффекты, точное целенаправленное воздействие на ROCK ген с помощью CRISPR/Cas9 д. стать альтернативным инструментом для иммортализации клеток IVD. Др. возможным использованием CRISPR/Cas9 в первичных IVD клетках может стать предупреждение их дедифференцировки.⁴¹ Целенаправленная экспрессия генов, ассоциированных с дедифференцировкой, таких как collagen II с помощью CRISPRa или collagen I с помощью CRISPRi, возможно позволит более длительно использовать культивируемые in vitro клетки IVD. Collagen II и aggrecan недавно были целенаправленно подвергуты действию CRISPRa в происходящих из тканей стволовых клетках (ASCs), чтобы изменить их клеточный фенотип в направлении IVD фенотипа и это может быть также применено непосредственно к клеткам IVD.⁴²

Исследования хряща в клеточной линиии Swarm rat chondrosarcoma (RCS) обычно используюдтся для изучения специфических фенотипов хондроцитов, благодаря их сходству с нормальным хрящом крыс и способностью генерировать колониии клеток. Недано получена линия RCS клеток, стабильно экспрессирующая Cas9 (RCS-Cas9), и исполтьзована для изучения функции молекул ECM aggrecan и hyaluronan.^{43, 44} Нокаут aggrecan в RCS-Cas9 клетках предоставил дополнительные знания о роли aggrecan в прикреплении клеток, формировании хондросаркомы и регуляции генов,⁴³, тогда как нокаут hyaluronan synthase-2 выявил важную роль hyaluronan в сборке матрикса вокруг хондроцитов.⁴⁴ В хондрогенной линии клеток мышиной тератокарциномы (ATDC5), CRISPR/Cas9-вызванная делеция специфического сайта связывания microRNA miR-322, снижала уровни белка mitogen-activated protein kinase kinase 1 (MAP2K1 или MEK1) и предоставила новую информацию о развитии хряща.⁴⁵

Подобно этим клеточным линиям клетки IVD со стабильной экспрессией Cas9 помогут объяснить взаимоотношения между генотипом и фенотипом IVD в будущем. Недавние исследования биологии IVD подчеркнули важность мембранных белков, а именно, рецепторов клеточной поверхности (напр., toll-like receptor (TLR) TLR2⁴⁶), каналов (напр., aquaporins⁴⁷, transient receptor potential cation channel subfamily V member 4 (TRPV4)48) и ажгезивных молекул (напр., integrins⁴⁹) , т.к. эти белки позволяют клеткам IVD воспринимать свое окружение и реагировать на его изменения. Хотя экспрессия и активность этих молекул изменяется во время DDD, понимание точной их функции остается неясным, поскольку ингибиторы/антагонисты и активаторы/агонисты часто не избирательны или имеют короткий период полу-жизни.^{50, 51} Система CRISPR/Cas9 позволяет исследовать точные взаимодействия между клетками и ECM с помощью функциональных нокаутов, нокдаунов или knockins рецепторов, специфических субъединиц и партнерров по интеграции. В качестве примера, gRNA-обусловленное молчание с помощью dCas9-KRAB-GFP (CRISPRi) было использовано для изучения роли N-cadherin (CDH2) в NP алетках свиньи и человека, показавшего, что CDH2 оегулирует фенотипы ювенильных NP клеток во время формирования кластеров из NP клеток.⁵² Как стабильные, так временные CRISPR/Cas9 модификации обнаруживали потенциал обнаружения механизмов, участвующих в обороте ECM (напр., matrix metalloproteinases [MMPs], disintegrin и metalloproteinase with thrombospondin motifs [ADAMTS]), жизнеспособности и старении и механотрансдукции клеток IVD. Кроме того, CRISPRi недавно был использован для изучения роли цитокиновых рецепторов TNFR1 и IL1R1 и их нижестоящей передачи сигналов, способствующих воспалению преимущественно в клетках IVD человека.⁵³ Идентификация и анализ некодирующих регуляторныъх последовательностей, таких как энхансеры энзимов, деградирующих ECM, также возможны.⁵⁴

Более того, трансдукция клеток мишеней объединенной лентивирусной библиотекой, несущей множественные gRNA и Cas9 белок или только gRNAs-Cas9 для орпделенных наборов генов, может позволить осуществить функциональный скрининг и идентификацию молекулярных путей, участвующих в разных болезнях,^55-57 возможно включая и DDD. CRISPR/Cas9 также вносит вклад в изучение геномных регионов, способных к молекулрням взаимодействиям, благодаря разработке CRISPR искусственных ДНК-связывающих молекул, обеспечивающих иммунопреципитацию хроматина (enChIP), где специфические антитела были слиты с dCas9 и экспрессировались одновременно с gRNA.⁵⁸ При изучении IVD, особенно в исследованиях, сфокусированных на насыщении кислородом IVD, enCHiP может, напр., быть использован для исследования взаимодействия между hypoxia-responsive elements (HREs) и факторами, вызывающими гипоксид, такими как HIF=1α.^{47, 59} Ещё одно использование технологии CRISPR - это визуализация геномных локусов в клеточных ядрах или т. наз. Cas9-обусловленной флюоресценции in situ гибридизации (CASFISH)⁶⁰ (Figure 1). Путем использования многоцветных dCas9/sgRNAs, несколько локусов мишеней были мечены одновременно,⁶⁰ напр., fibronectin, TGF-β1, и MMPs в IVDs человека.^{61, 62} По сравнению с традиционным методом, CASFISH может предупреждать разрушение пространственной организации генетических элементов.⁶⁰