Новая версия технологии редактированимя генов CRISPR-Cas9 успешно восстанавливает правильную последовательность гена дистрофина на мышиной модели мышечной дистрофии Дюшена (DMD).
Открытие технологии CRISPR-Cas9 было провозглашено как прорыв для генетических заболеваний. До CRISPR-Cas9 не было технологии, способной эффективно исправлять мутации, которые лежали в основе патологии болезней. Система CRISPR-Cas9 способна устранять мутацию и вставлять правильную последовательность гена.
Первоначально использовали два типа терапии с помощью редактирования генов системой CRISPR-Cas9: терапию, базирующуюся на соединении негомологичных концов (non-homologous end joining), которая надолго замалчивала гены, вызывающие болезнь путем индукции indel мутаций, и терапия, базирующаяся на гомологией управляемой репарации (homology-directed repair (HDR)), которая корректировала генные мутации, вызывающие болезнь, заменяя их последовательностью дикого типа. Базирующаяся на HDR терапия обладает потенциалом лечить большинство генетических болезней, благодаря своему механизму действия.
К сожалению, методы доставки компонентов этой системы, которая включает молекулу РНК, наз. гид РНК, белок, наз. Cas9 нуклеаза, и правильную последовательность ДНК, чтобы заместить мутантную (донорская ДНК), не были полностью отработаны для использования у людей. Первоначальная техника использовала доставку компонентов этой системы с помощью вирусов, но эта техника характеризуется осложнениями и нежелательными побочными эффектами. Кроме того, базирующаяся на adeno-associated viruses (AAV) доставка Cas9 in vivo (Tabebordbar, M. et al 2016; Nelson, C. E. et al 2016, Long, C. et al. 2016), обеспечивала терапевтические уровни редактирования на порядок величин ниже, приемлемых для клиники.
В ответ исследователи из the University of California, Berkeley разработали новый подход. наз. CRISPR-Gold, который использует наночастицы золота для доставки компонентов этой системы у мышей, моделирующих DMD. Наночастицы золота используются, чтобы быть покрытыми модифицированной молекулой ДНК, которая будет связываться с донорской ДНК, которая в свою очередь будет связана с Cas9 и с гид РНК.
a, CRISPR-Gold is composed of 15nm GNPs conjugated to thiol-modified oligonucleotides (DNA-Thiol), which are hybridized with single-stranded donor oligonucleotides and subsequently complexed with Cas9 RNP and the endosomal disruptive polymer PAsp(DET), where 'DET' is diethylenetriamine. b, CRISPR-Gold is internalized by cells in vitro and in vivo via endocytosis. This triggers endosomal disruption and releases Cas9 RNP and donor DNA into the cytoplasm. Nuclear delivery results in HDR.
Вся эта система затем покрывается полимером, который будет взаимодействовать с клеточной мембраной и позволит ей проникнуть в клетку. Затем компоненты этой системы высвобождаются внутри клетки, как только оболочка разрывается в стороне от места проникновения. Гид РНК, Cas9 нуклеаза и донорская ДНК могут затем проникать в ядро и корректировать мутацию.
Одна внутримышечная инъекция CRISPR-Gold мышам с DMD способна восстановить 5.4% генов дистрофина, дефекты которого вызывают DMD. Это в 18 раз больше, чем когда DMD мыши подвергаются действию регуляторной CRISPR-Cas9 системы, вызывающей лишь 0.3% восстановления. Кроме того, CRISPR-Gold эффективно редуцирует тканевой фиброз и улучшает силу и подвижность у мышей. r
Система CRISPR-Gold способна восстанавливать полностью нормальную последовательность дистрофина, тогда как прежде система CRISPR-Cas9 была способна удалять часть гена.
Исследователи изучали также надежность системы CRISPR-Gold и установили, что присутствуют лишь минимальные эффекты вне мишени и что применение CRISPR-Gold не вызывает воспалительную реакцию или потерю веса даже после множественных инъекций.
"CRISPR-Gold система способна корректировать мутации генов, вызывающих болезнь, in vivo, посредством не вирусной доставки Cas9 белка, гид РНК и донорской ДНК и , следовательно, обладает потенциалом разработки терапии генетических болезней."
