Здесь мы описали новую ступень стратегии генотерапии, делающей возможной генетическую коррекцию клинически важных, происходящих из предшественников, скелетных мышц человека. Обратимо иммортализованные лентивирусные вектора оказываются надежными и эффективными в расширении пролиферативной способности DMD мышечных предшественников, позволяя им противостоять переносу новых HAC, содержащих целый локус дистрофина, и в результате увеличивать крупномасштабную экспансию клеток, необходимых для биотехнологии мед. продукта для успешной терапии. Начиная с ограниченного количества клеток (3 - 10⁴), мы получали в течение 31 дня количества клеток, потенциально достаточные для лечения детей с DMD (в пределах 10⁹ клеток; Cossu et al, 2015). Важно, что эта работа проводилась в двух независимых лаб. (в UK и в Японии) и оценивалась используя (i) два разных типа клеток, (ii) здоровые и дистрофичные генотипы, (iii) 5 разных доноров, (iv) поли-клональный и клональный анализ.

Предыдущая работа Trono с колл., показал, что комбинированная экспрессия hTERT и Bmi1 обходит репликативное старение миобластов (Cudre-Mauroux et al, 2003). Принимая во внимание преимущества доступности иммортализованных DMD миобластов, мы успешно переносили DYS-HAC2 в эти клетки. Однако, хотя трансплантация миобластов является многообещающей для локальных форм мышечной дистрофии (Perie et al, 2014), их использование при обширных мышечных нарушениях, таких как DMD, ограничено. Поэтому мы избрали мезоангиобласты, чтобы получить преимущества из-за их миграционной способности, и переносили DYS-HAC2 путем расширения их пролиферативного потенциала, используя ту же самую иммортализованную платформу. hTERT-TK и Bmi1 лентивирусные векторы, используемые в данном исследовании, первоначально были разработаны для получения реверсии иммортализованного статуса в присутствии Cre рекомбиназы и ganciclovir (Salmon et al, 2000). Использование hTERT и Bmi1 иммортализующей платформы для DMD мезоангиобластов показало, что этот подход эффективен для усиления клеточной пролиферации и делает возможным клональный перенос DYS-HAC и последующую амплификацию. Надежность использования лентивирусных векторов для обеспечения интеграции и эксцизии иммортализующих кассет, примененных в данном исследовании, подтверждено недавним клиническим исследованием генотерапии (Naldini, 2015). Кроме того, наши наблюдения вместе с рядом сообщений, показавших, что клеточное старение может быть преодолено с помощью теломеразного восстановления в комбинации с экспрессией Bmi1 или CDK4, без нарушения геномной стабильности, способности к миграции, миогенной потенции или способности приживляться в скелетных мышцах (Cudre-Mauroux et al, 2003; Zhu et al, 2007; Shiomi et al, 2011; Robin et al, 2015). Даже если мы не наблюдали экспрессии Pax7 в иммортализованных клетках, вряд ли это вызывали иммортализующие векторы, поскольку Bmi1 играет ключевую роль в поддержании регенерации скелетных мышц и поддержании пула сателлитных клеток (Robson et al, 2011; Di Foggia et al,2014; Dibenedetto et al, 2017). Это может быть обусловлено значительным проникновением (passaging) in vitro или амплификацией клеток, которые уже потеряли экспрессию Pax7 во время инициальной экспансии перед трансдукцией. Недавние успехи в очистке сателлитных клеток человека (Xu et al,2015) вместе с иммортализацией на ранних пассажах могут улучшить подобный исход. Тот же самый процесс может быть менее значимым мезоангиобластов человека, чья зависимость от Pax7 неясна. Вариабельность миогенной способности также может быть следствием высокой плотности культуры во время MMCT техники, необходимой для переноса HAC. В этом случае резервный план с MyoD-ER-индуцированным спасением дифференцировки описан здесь.

В данной работе мы также улучшили преобразование хромосом ex vivo для генотерапии. Мы впервые создали новый DYS-HAC, а именно, DYS-HAC2, свободные от потенциально иммуногенных генов и поэтому на шаг ближе к возможному клинического уровня продукту по сравнению с предыдущими DYS-HAC (Hoshiya et al, 2009). Кроме того, мы разработали следующего поколения HAC, способные поставлять геномную integration-free обратимую иммортализацию, генетическую коррекцию, дополнительную экспрессию дистрофина, индуцибельную дифференцировку и контролируемую клеточную гибель, - всё это одновременно в эписомном векторе. Эти новые HAC представляют собой самый крупный и возможно наиболее сложный разработанный вектор генотерапии: дальнейшие исследования позволят оценить его функцию in vitro и in vivo после переноса в разные миогенные клетки человека, включая время и динамику клональной HAC-обеспечиваемой иммортализации первичных клеток.

Альтернативные, специфичные для мутаций стратегии были разработаны на сегодня для DMD (Fosteret al, 2012; Bengtsson et al, 2016). Среди них, анти-смысловыми олигонуклеотидами обусловленный пропуск экзонов кажется многообещающим и ataluren недавно появился на рынке, разрешенный для нонсенс мутаций; всё же, недавние клинические испытания подчеркивают необходимость дальнейших исследований для прояснения клинической эффективности (Lu et al, 2014; Voit et al, 2014; Godfrey et al, 2017; McDonald et al, 2017). Однако, эти стратегии не могут быть использованы для значительного количества DMD мутаций в функциональных доменах или для крупных делеций (Aartsma-Rus et al,2009). "Устойчивый" пропуск экзонов посредством с adeno-associated viral vector (AAV)-обеспечиваемым редактированием генов также, по-видимому, является обнадёживающим (Long et al, 2016; Nelson et al, 2016; Tabebordbar et al, 2016; Young et al, 2016); однако, иммунные реакции против AAVs (Boisgerault & Mingozzi, 2015) и энзима редактирования (который обычно имеет прокариотическое происхождение), а также эффекты вне мишени могут замедлить перенос этого подхода в клинику. Хотя недавняя работа предоставила обнадёживающие доказательстваin vitro лентивирусного переноса полной длины дистрофина в миобласты человека (Counsell et al, 2017), HAC-обеспечиваемая генотерапия предоставляет шансы для покрытия всего спектра DMD мутаций, т.к. сохраняет весь комплекс регуляторных элементов дистрофина (Muntoni et al, 2003). Кроме того, надежность профиля и стандартные операционные процедуры для производства обеих клеточных популяций, используемых в данном исследовании, уже разработанных для аллогенных и аутологичных клинического уровня болезней (Perie et al,2014; Cossu et al, 2015), т.о., проложили пути для дальнейшего клинического переноса генетически исправленных клеток.

Хотя происходящие из iPS клеток миогенные предшественники обещают преодолеть некоторые узкие места генотерапии мышечных нарушений (rev. Loperfido et al, 2015), они находятся на очень ранней и критической стадии преклинических испытаний: проблемы безопасности должны будут быть полностью разрешены перед использованием в клинических условиях, требующих системных или многократных назначений при DMD. Важно что перенос в клинику клеток предшественников, производных iPS (напр. Chalet al, 2015; Choi et al, 2016; Darabi et al, 2012; Loperfido et al, 2015; Tedesco et al, 2012) , скорее всего, будет базироваться прежде всего на успешности клинических испытаний с их производными из тканей аналогами и технологиями, таких как описанная здесь успешность этой критической стадии.

В целом мы ожидаем, что переход на базирующуюся на HAC клеточную терапию будет сложным, но более манящим, чем те, что с др. векторами генотерапии (Tedesco, 2015). Однако, некоторые узкие места всё ещё необходимо преодолеть, такие как низкая эффективность HAC переноса в реципиентные клетки: новые технологии улучшат этот аспект (Hiratsuka et al, 2015; Suzuki et al,2016). Наконец, DMD генотерапия базируется на размере и сложности копии дистрофина, доставляемой дистрофичным клеткам, эффективность клеточной терапии для DMD связана с количеством стволовых клеток и клеток предшественников, способных достигать и приживляться в дистрофичных мышцах и на их миогенном потенциале. Хотя мы предоставили доказательства проверки принципа приживления и дифференцировки HAC-откорректированных предшественников человека in vivo (Fig 6), протоколы трансплантации всё ещё нуждаются в оптимизации для достижения клинической эффективности. Недавние работы наших и др. лаб. показали, что возможно увеличение приживления клеток с последующим функциональным ослаблением дистрофического фенотипа (Hindi et al, 2013; Giannotta et al, 2014). Комбинации этих подходов (напр. улучшение эффективности переноса HACи усиление приживления) смогут продвинуть DYS-HAC платформу ближе к клиническому переходу, хотя дальнейшие исследования всё ещё необходимы.

Итак, эта работа предоставляет первые доказательства о клинической важности переноса HAC для предшественников дистрофических мышц человека и описывает разработку следующего поколения мультифункциональных искусственных хромосом для ex vivo генотерапии.