Посещений:
ГЕНОТЕРАПИЯ и ГЕНОМНОЕ РЕДАКТИРОВАНИЕ



Пренатальное вмешательство

In Utero Gene Therapy and Genome Editing
• Heather A. Hartman • Avery C. Rossidis • William H. Peranteau
Current Stem Cell Reports 2018 pp 1–9

The rational for gene therapy and genome editing in utero is described, specifically the small size of the fetus, fetal immunologic immaturity, prenatal accessibility of stem and progenitor cells, and the ability to treat target diseases prior to birth. We review studies in normal and disease small and large animal models which demonstrate the feasibility and safety of in utero gene therapy using a variety of viral vectors. Postnatal in vivo genome editing with CRISPR-Cas9 in a number of murine disease models is discussed including the preference for nonhomologous end-joining compared to homology-directed repair in non-proliferating adult cells as a potential benefit to application of CRISPR-Cas9 genome editing to the fetus. Finally, the ethical challenges of human in utero gene therapy are discussed in the context of the EVERREST trial that is currently being designed.
In utero gene therapy and genome editing is a developing field with great potential to treat congenital monogenic diseases. More research in small and large animal models is required before clinical translation can occur.
ВОЗ подсчитала, что приблизительно 10000 болезней человека вызываются мутациями одиночных генов (monogenic). Эти болезни затрагивают многие органы, могут вызывать значительную болезненность и смертность и многие проявляются ещё до рождения или во время родов. Успехи протоколов генотерапии, включая улучшенную разработку вирусных векторов, подчеркивают потенциальные преимуществе постнатальной генотерапии для избранных болезней [1]. Более того, появление новой мощной технологии редактирования генома, включая CRISPR-Cas9, представляют беспрецедентные возможности для терапевтической коррекции моногенных нарушений [1, 2]. Хотя постнатальное применение in vivo ген-замещающей терапии и геномного редактирования несет с собой многообещающие надежды, пренатальное использование этих технологий к развивающемуся плоду может оказаться чрезвычайно успешным в определенных случаях и открывает потенциальный сдвиг порядка действия (paradigm) в лечении избранных болезней. В частности, успехи пренатального ухаживания и молекулярной диагностики сегодня позволяют диагностировать многие генетические заболевания, некоторые из которых не подходят для постнатального лечения, а лечение возможно до рождения. Способность пренатальной диагностики таких болезней, следовательно, естественно ставит вопрос о потенциале лечения таких нарушений до рождения и начала проявления симптомов. Принимая это во внимание, в данном обзоре мы сосредоточимся fна терапии in utero и геномном редактировании, на раннем опыте с замещающей генотерапией in utero у нормальных и больных, мелких и крупных модельных животных, и на современном опыте постнатального геномного редактирования, как показателе потенциальных преимуществ использования технологии геномного редактирования, особенно CRISPR-Cas9, к развивающемуся плоду для терапии.

In Utero Gene Therapy and Genome Editing: Rationale


Применение заместительной генотерапии и технологии геномного редактирования пренатально предназначено для предоставления нормальных свойств развития плоду. Оно базируется на 4 основных принципах:
  • 1. Малые размеры плода делают возможной оптимизацию ряда вирусных векторных частиц, используемых для доставки терапевтического гена или технологии геномного редактирования относительно веса реципиента. Это подкрепляется тем фактом, что день эмбриогенеза (E) 16 у плодов мышей, является самым распространенным временным промежутком для in utero генотерапии и геномного редактирования, когда его вес составляет приблизительно 0.5 г по сравнению с 1-мес. мышами, вес которых составляет ~15 г [3]. Сходным образом, плод человека составляет ~100 г на ст. 14 - 16 недель беременности в противовес 60-кг взрослым реципиентам.
  • 2. Иммунологическая незрелость плода делает возможной потенциальную доставку вирусного вектора и трансгенного продукта, включая бактериальный Cas9 белок. используемый для CRISPR-Cas9 геномного редактирования, не ограничиваемого иммунной реакцией. В 1945, Owen установил, что дизиготные близнецы телята, обладающие перекрестным плацентарным кровообращением, постоянно имеют химеризм эритроцитов, ввел концепцию об иммунологической незрелости плодов [4, 5]. Последующие исследования Billingham, Medawar и др. продемонстрировали индукцию иммунной толерантности к чужеродным антигенам после экспозиции чужеродным антигеном во время ранней беременности [6, 7]. Многочисленные исследования постнатальной генотерапии как в клинике, так и на животных моделях, продемонстрировали потенциал иммунной системы по ограничению эффективности базирующегося на вирусных векторах переноса генов. Calcedo et al. продемонстрировали, что anti-CFTR T клетки часто обнаруживаются в циркуляции людей с муковисцидозом, что должно в принципе ограничивать успешность постнатальной генотерапии [5, 8]. Сходным образом, при клинических испытаниях anti-AAV2 capsid specific T клетки были найдены в кровообращении реципиентов генотерапии, обеспечиваемой посредством adeno-associated virus serotype 2 (AAV2) , для лечения у людей гемофилии, вызванной фактором IX [9]. В этом исследовании экспрессия фактора IX снижалась со 2 по 5 неделю после применения генотерапии, тогда как уровни этих T клеток увеличивались. Наконец, нейтрализующие антитела к AAV2 и AAV8 вирусам, как было установлено, присутствуют у многих детей и молодых людей из-за естественной инфекции, начинающейся с ранней жизни [5, 10]. Совсем недавно исследование Wang et al. подтвердило индукцию anti-streptococcus Cas9 (SpCas9) иммунной реакции вследствие постнатальной доставки, обеспечиваемой аденовирусом, SpCas9 у взрослых мышей [11]. Это подтверждает, что эффективность постнатальной генотерапии и редактирования будет ограничиваться антителами и T клетками обеспечиваемой реакцией на вирусные вектора и трансгены. Напротив, генотерапия с помощью AAV векторов на плодах модельных мышей и овец, демонстрирует экспрессию трансгенных продуктов с иммунной толерантностью трансгенам и капсидным белкам вирусных векторов [12, 13]. Сходным образом, Colletti et al. продемонстрировал, что эпителиальные клетки тимуса и клетки корпускул Hassall's эффективно трансдуцируются во время ранней беременности, создавая центральную и периферическую терпимость к трансгенным продуктам, соотв., на модельных овцах [14]. Трансдукция во время поздней беременности приводит к достоверному снижению толерантности. В исследовании Tran et al., овцы, которые были трансдуцированы пренатально ретровирусным вектором, несущим β-galactosidase, были подвергнуты действию очищенного продукта трансгена спустя 40 мес. после воздействия in utero [15]. Овцы, которые были трансдуцированы in utero имели низкие уровни после стимуляции периферических лимфоцитов по сравнению с контрольными овцами, демонстрируя, что система ретровирусной доставки прекрасно персистирует в постнатальной жизни. Многие болезни-мишени для генной терапии могут нуждаться в повторных дозах терапевтического вектора. Повторные постнатальные инъекции вирусного вектора, несущего "терапевтический " трансген, после инициальной in utero инъекции вирусного вектора или терапевтического трансгена, не приводят к иммунной реакции на трансгенный продукт. Напротив, этот подход (пренатальная генотерапия, сопровождаемая постнатальными повторными инъекциями) давала реакцию антител на капсиный белок AAV вирусного вектора, подтверждая, что in utero генотерапия приводит к индукции толерантности к трансгену без индукции толерантности к доставляющему вирусному вектору. Более того, это указывает на то, что продолжающееся присутствие антигена необходимо для поддержания иммунной толерантности после экспозиции in utero. Т.о., чтобы сделать возможным повторяющееся дозирование терапии с помощью вирусных векторов постнатально, необходимы дополнительные исследования по оценке подходов по избеганию реакции на вирусные вектора.
  • 3. Вообще-то наивысшим онтологическим преимуществом осуществления in vivo заместительной генотерапии или терапевтического геномного редактирования у плода является общедоступность и пролиферативная природа стволовых клеток и клеток предшественников многих органов. Идеальными клетками мишенями для генотерапии являются клетки предшественники, такие, в которых терапевтический ген проходит в следующие клеточные поколения. Эта даже более важно для редактирования генома in vivo, при котором временные механизмы доставки (наночастицы, неинтегрируемые вирусные вектора) позволяют осуществить "коррекцию" генома, передаваемую далее в течение всей жизни индивида, если это происходит в стволовых клетках или клетках предшественниках. Многочисленные исследования на мышах и крупных модельных животных продемонстрировали способность целенаправленно воздействовать на клетки предшественники многих органов, благодаря доставке вирусного вектора in utero. Гематопоэтические предшественники у плодов овец успешно подвергались целенаправленному воздействию трансгена для β-galactosidase и экспрессия трансгена сохранялась более 40 мес. после трансдукции [15]. Экспериментальная модель на собаках mucopolysaccharidosis type I также была использована для доставки ретровирусов in utero, переносящих α-L-iduronidase в клетки предшественники многих тканей; однако, экспрессия трансгена не обнаруживалась у выживших щенков [16]. Приматам вводили внутрь амниона rAAV, несущий GFP, и обнаружили продолжающуюся экспрессию GFP в клетках легких типа I и II в ворсинках тонкого кишечника в возрасте 15 мес., что указывало на успешную трансдукцию клеток предшественников [17]. Наиболее впечатляющие исследования были проведены на мышиных моделях. Эти исследования подчеркнули три важные переменные, затрагивающие способность и эффективность целенаправленного действия на разные органы: вирусный вектор или механизм доставки, способ применения и возраст беременности, в котором производятся инъекции in utero .
    • Методы доставки могут быть подразделены на вирусные и не вирусные [18]. Методы не вирусной доставки разнообразны и включают физические методы, такие как электропортация [19], microfluidic деформация [20] и прямые инъекции в клетки [21, 22]. Хотя физические методы доставки пригодны для манипуляций ex vivo, их использование in vivo пока ограничено. Альтернативной техникой не вирусной доставки in vivo является использование систем доставки с помощью наночастиц, таких как базирующиеся на липидах наночастицы [23]. Однако, на сегодня базирующиеся на вирусных векторах методы доставки обладают наибольшим потенциалом клинического применения in vivo. Три наиболее распространенные вирусные вектора включают лентивирусы, аденовирусы (Ad) и AAVs. Лентивирусы являются однонитчатыми РНК ретровирусами, которые интегрируются в геном и вызывают низкую иммуногенность в клетках. Аденовирусы являются двунитчатыми ДНК вирусами, которые не интегрируются и обладают способностью упаковывать крупные объемы, но обладают высокой иммуногенностью и часто вызывают воспалительные реакции [24]. AAVs являются не интегрирующимися вирусами, которые менее иммуногенны, обладают меньшей способностью к упаковке и могут целенаправленно воздействовать на избранные ткани благодаря серотипам AAV. Недавние исследования на постнатальной модели мышей продемонстрировали важность AAV серотипа для тканевого тропизма, исследования подтвердили способность AAV векторов разных серотипов трансдуцировать целенаправлено клеточные популяции разных органов при доставке in utero (Table 1) [13,28, 29, 30].

    Table 1 Prenatal and postnatal AAV tropism

    В дополнение к методу доставки (не вирусный и вирусный и специфический), важен способ введения и возраст беременности. В исследовании Endo et al., у которых лентивирус переносил трансген GFP, инъекции производили в амниотическую полость, чтобы целенаправлено воздействовать на плоды мышей на ст. E8 - E18 [31]. Они продемонстрировали способность эффективно трансдуцировать клетки органов от всех трех зародышевых слоёв исследуя 4 мес. спустя специфические органы, трансдукция которых зависела от возраста беременности во время инъекции [31]. успешность этого подхода зависела от нормального развития складок во время эмбриогенеза, от воздействия на систему органов и ассоциированных с ними предшественников амниотической жидкости. Т.о., напр ., на ранних сроках беременности доставка вирусного вектора успешно трансдуцировала клетки ЦНС и предшественники кожи, поскольку вирусный вектор вводили до закрытия нервной трубки или до формирования защитного эпителиального барьера кожи. Способность учитывать нормальные процессы развития, чтобы целенаправленно воздействовать на клетки определенного органа посредством инъекций внутрь амниона, также прекрасно продемонстрирована в исследованиях, где инъекции в амнион на поздних сроках беременности лентивирусов или AAV эффективно трансдуцировали легочные эпителиальные клетки [32]. В этой системе вирусные вектора инъецировали в то время, когда обычно возникали дыхательные движения плода, так что плод "вдыхал" вирусный вектор с последующей его трансдукцией легочных клеток. Кроме того, вирусный вектор мог вводиться внутривенно [13, 33, 34], внутритрахейно [35], внутримышечно [36,37], и внутрибрюшинно [29, 37] , эти пути успешно доставляли вирусные вектора в органы мишени, включая головной мозг, сердце, легкие и мышцы.
    Наконец, пролиферативная природа стволовых клеток плода и клеток предшественников подтверждает, что в принципе плод является идеальным кандидатом для редактирования геноам in vivo. Это особенно справедливо для homology-directed repair (HDR), которая нуждается в пролиферации клеток (конец S, G2 фаза) [38]. В противоположность клеткам многих органов взрослых, такие клетки предшественники легочного эпителия (клетки альвеол типа II) и кардиомиоцитов, которые преимущественно не делятся, у плодов же эти органых характеризуются пролиферативными клетками.
    Важным для генотерапии и редактирования геном in utero является потенциал целенаправленной терапии болезни до рождения и начала симптоматики. Т.о., болезни с высокой перинатальной болезненностью и смертностью, для которых нет адекватной постнатальной терапии, д. стать идеальными мишенями для генотерапии или геномного редактирования in utero. Это демонстрируется рядом примеров болезней легких, таких как дефицит surfactant белка, а также болезни накопления метаболитов, такие как mucopolysaccharidosis type VII (MPSVII).

    Diseases Treated by In Utero Gene Therapy


    Хотя постнатальная генотерапия исследуется годами и на сегодня существует множество текущих клинических испытаний подобной генотерапии, генотерапия плодов ещё не вступила в фазу клинических испытаний (clinicaltrials.gov). Поэтому наше понимание способности генотерапии in utero для лечения врожденных болезней пока базируется на животных моделях. В частности мышиные модели являются превалирующими для изучения in vivo генотерапии на плодах. Преимущества модели включают обилие моделируемых болезней, короткий период беременности и низкая цена и доступность методов и реагентов для тщательной и объективной проверки вопросов по поводу гипотез. Болезни, были изучены и были облегчены с помощью генотерапии in utero у мышиных моделей включали, но не ограничивались гемофилией, болезнью Вильсона, расщеплением губ и нёба, epidermolysis bullosa, талассемией, hypophosphatasia, и лизосомными болезнями накопления [12, 21, 29, 35, 39-41]. Крупные модельные животные были также использованы для изучения избранных болезней. Приматы модели использовали для переноса гена человеческого фактора IX (hFIX) in utero посредством AAV продемонстрировали долговременную экспрессию hFIX с высокими уровнями персистенции терапевтических пределов [28, 34]. Приматы с низкой экспрессией трансгена получали ещё постнатальные дозы, которые оказались неспособны усиливать экспрессию трансгена и вызывали в результате нейтрализующие антитела к белкам вирусного вектора, но не были клинически токсичными. Эти результаты слегка отличаются от исследований в случае гемофилии у мышей, у которые повторное постнатальное применение AAV, содержащих трансген, приводило у усилению экспрессии человеческого фактора IX при отсутствии иммунной реакции на человеческий фактор IX, но животные не давали антител к вирусному вектору после повторного постнатального воздействия [12]. Сходным образом, AAV, изучали толерантность к трансгену у модельных мышей и овец для hFIX после in utero аденовирусной доставки [42, 43]. У модельных мышей in utero внутривенная доставка с помощью аденовирусного вектора, несущего hFIX, продемонстрировала сохраняющуюся экспрессию hFIX и постнатально на уровнях более высоких, чем при постнатальной инъекции мышам [42]. Антитела к hFIX не были обнаружены у 5 из 9 пренатально инъецированных мышей, которые получали повторно постнатально hFIX, указывая на индукцию иммунной толерантности. При сравнении взрослых мышей, которые не были трансдуцированы пренатально, обнаруживались высокие уровни антител hFIX в ответ на инъекцию hFIX. David et al. осуществили сходное исследование на плодах овец, используя β-galactosidase и hFIX аденовирусные вектора путем внутривенного, внутрикардиального, внутрипеченочного, внутрибрюшинного, внутримышечного и внутриамниотического введения [43]. Сыворотка от пренатально обработанных овец имела не обнаружимые уровни антител к человеческому фактору IX. Однако, они продемонстрировали антитела к аденовирусным векторам при высочайших уровнях у овец, обработанных внутрибрюшинно, демонстрируя потенциально высокую иммуногенность аденовирусных векторов, даже, когда они доставлялись до рождения.
    Эти исследования моделей с болезнями и использование терапевтических трансгенов против снова подтверждают способность генотерапии in utero для индукции иммунной толерантности к трансгенному продукту, но не к вирусному вектору и подчеркивая важность преклинических исследований на крупных животных. Значение крупных животных в качестве моделей перед клиническими испытаниями пренатальной генотерапии для лечения intrauterine growth restriction (IUGR). Кролики, моделирующие IUGR, после внутриплацентарной доставки insulin-like growth factor 1 (Ad-IGF-1) посредством аденовирусов, обнаруживали исчезновение IUGR при минимальном переносе гена матерям или детенышам [44]. Сходным образом, IUGR у плодов овец подвергался воздействию доставки с помощью аденовирусов vascular endothelial growth factor (Ad-VEGF), инъецируемого в маточную артерию, наблюдалось улучшение постнатального роста в Ad-VEGF группе по сравнению с контролем [45, 46]. Результаты подобных исследований VEGF генотерапии были многообещающими и стали основой для клинического испытания EVERREST, которое было разработано для лечения IUGR с помощью пренатальной доставки Ad-VEGF через маточную артерию [47, 48].

    Genome Editing: the Basics and Experience With Postnatal Therapeutic In Vivo Genome Editing


    Некоторые болезни не могут быть откорректированы просто добавление экзогенного гена и вместо этого требуют коррекции или замалчивания вредных мутаций. Геномное редактирование использует нуклеазы, предназначенные для целенаправленного воздействия на специфическую последовательность генома. Эти нуклеазы традиционно предназначены разрезать двойную нить ДНК с последующей зависимостью механизмов репарации от нормальной клеточной ДНК, чтобы или замалчивать мутантный ген, вырезать намеченный сегмент ДНК или корректировать намеченную мутацию. В частности, после разрыва двойной нити ДНК, механизмы традиционной репарации ДНК включают nonhomologous end-joining (NHEJ) и homology-directed repair (HDR) [49, 50]. NHEJ использует "воссоединение" концов ДНК в месте разрыва двойной нити, который появляется при склонности к ошибкам приводя к инсерциям или делециям оснований (indels) в месте разрыва. Если нуклеаза нацелена на один сайт генома (т.e., используется только одна guide RNA (gRNA)), indels при NHEJ могут быть результатом преждевременного STOP кодона и вызывать последующее молчание гена мишени. Вместо этого, если два сайта подвергаются целенаправленному действию нуклеаз на геном (тi.e., используются две gRNAs), то разрывы двойной нити ДНК в двух местах будут сопровождаться NHEJ, то в результате вредный сегмент может быть вырезан из ДНК или будет восстановлена рамка считывания гена. В качестве альтернативы NHEJ, HDR происходит, когда нуклеаза обеспечивается матрицей для репарации ДНК, несущей правильную последовательность ДНК. Этот процесс происходит с меньшей эффективностью, чем NHEJ и, как обсуждалось выше, нуждается в пролиферации клеток. HDR, однако, также обладает большим терапевтическим потенциалом, чем NHEJ т.к. он не ограничен болезнью, которая может быть ослаблена при замалчивании мутации или эксцизии сегмента ДНК, но может быть использован для коррекции болезни, вызываемой мутациями, это предполагает, что необходимы нуклеазы, которые будут подходить к последовательности мишени. Четыре основных семейств нуклеаз были использованы для редактирования генома: meganucleases [51, 52, 53], transcription activator-like effector-based nucleases (TALENs) [2], zinc finger nucleases (ZFNs) [54, 55] и clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas система.
    Мы кратко обсудим аспекты безопасности CRISPR-Cas9 редактирования генома и исследования постнатального in vivo использования для терапевтических причин [56-60]. CRISPR-Cas9 ст ала использоваться для in vivo постнатального геномного редактирования у ряда мышиных моделей с моногенными нарушениями. В частности, NHEJ была использована для коррекции дефектов сплайсинга у мышей. моделирующих врожденную muscular dystrophy type 1A (MDC1A), аутосомно рецессивную нейромышечную болезнь, вызываемую рядом мутаций в гене LAMA2 и характеризующаяся слабостью мышц новорожденного, гипотонией и нейропатией, вызываемой нарушениями миелинизации. Используя adeno-associated virus (AAV) несущий CRISPR-Cas9, Kemaladewi et al. продемонстрировали успешную эксцизию интронного региона, содержащего мутацию в LAMA2, это эффективно восстанавливало экспрессию белка LAMA2 и улучшало функцию мышц [61]. Кроме того, постнатальное CRISPR-Cas9-обеспечиваемое редактирование генома было использовано для эксцизии нежелательного сегмента ДНК посредством NHEJ и облегчало течение болезни у мышиных моделей с мышечной дистрофией Дюшена [62, 63] и атаксией Friedreich's [64]. HDR также была использована для постнатального in vivo редактирования генома у мышиных моделей врожденных болезней. В одном из первых исследований было продемонстрирована коррекция болезни у модели посредством in vivo CRISPR-Cas9, Yin et al. использовали у мышей, моделирующих наследственную tyrosinemia type I, фатальное заболевание, вызываемое дефицитом fumarylacetoacetate hydrolase (FAH), это приводит к тяжелой недостаточности печени [65], чтобы устранить нарушение. Cas9, вместе с одной из трех гидов РНК и короткой однонитчатой ДНК в качестве донора матрицы вводили внутривенно взрослым Fah-/- мышам. Это приводило к инициальной коррекции в 0.4%, этого было достаточно, чтобы спасти инъецированных мышей от гибели. Более того, благодаря избирательному преимуществу, обеспечиваемому успешно отредактированными клетками, популяция Fah-позитивных гепатоцитов расширялась до более 30% спустя 33 дня после воздействия. Дефицит ornithine transcarbamylase (OTC) ещё одно генетическое заболевание печени, которое связано с 50% смертностью новорожденных самцов, которые оказываются гемизиготными по этой X-сцепленному дефициту [66]. Мыши spfash, характеризуются G - A точечной мутацией в экзоне 4 гена OTC, воспроизводя эту болезнь путем 20-кретного уменьшения белка OTC, заставляя затронутых мышей погибать на диете с высоким содержание белка [67]. Yang et al. оказались способны достичь 10% эффективности редактирования посредством HDR, используя системы двойных AAV для доставки CRISPR-Cas9 и репарирующей матрицы новорожденным мышам. Это приводило в результате к повышению жизнеспособности по сравнению с контролем [68]. Важно, что когда сходный протокол был использован у взрослых мышей, то достигались низкие уровни HDR с преобладанием NHEJ и неспособностью устранять летальный фенотип. Эти результаты подчеркивают необходимость пролиферации клеток, которая снижена у взрослых реципиентов, для эффективной HDR .

    Ethics


    Short- and long-term studies of in utero gene therapy in small and large animal models are encouraging for the future application of these techniques to patients with congenital disorders for which no postnatal therapeutic options exist. In order to proceed to clinical trials of in utero gene therapy, there must first be proof of successful, safe postnatal gene therapy [5]. Thus, the clinical successes in postnatal gene therapy for hemophilia and diseases of the retina [69, 70] offer hope for the future application of prenatal gene therapy. However, the application of replacement gene therapy and genome editing to a developing fetus carries with it unique considerations including the risk of insertional mutagenesis, disruption of normal organ development, and a potential for germline alteration [5]. The risk of germline transduction following in utero gene therapy was studied in the fetal sheep model in which the sperm from 6 of 19 sheep were noted to have the provirus and immunohistochemical analysis of the testes suggested very low levels of germ cell transduction [71]. Subsequent analysis of factors leading to inadvertent germline transduction revealed that germ cells were transduced after retroviral delivery via the intraperitoneal route at all gestational ages [72]. Sheep transduced before 65-day gestation manifested a transduction frequency of 8.6?±?2.9%. However, delivery of the retrovirus after 70-day gestation resulted in very low levels of germ cell transduction. This suggests that the susceptibility of germline tissues to in utero gene therapy is dependent on gestational age, with higher rates of transduction early in gestation during germ cell migration [72]. Of note, germ cells of female sheep that underwent in utero gene transfer with retroviral vectors did not demonstrate any transgene expression [71]. With respect to genome editing, the prevalence of off-target mutagenesis must be fully investigated in small and large animal models prior to clinical application.
    Current studies in animal models are working to address these ethical questions and are providing the appropriate foundation that will be required for the clinical application of in utero gene therapy/genome editing in the future. The promise of the future clinical application of prenatal gene therapy and genome editing is highlighted by the EVERREST trial which proposes to use adenoviral-mediated delivery of VEGF via the uterine artery to correct IUGR [47o]. In preparation for this trial, ethical and social considerations of gene therapy in a pregnant mother to target a defect in prenatal development have been extensively explored. Guided interviews with key stakeholders including disability groups, professional bodies, patient support groups and women/couples who experienced severe fetal growth restriction were performed. The majority of stakeholders and women/couples were generally supportive of the EVERREST trial. Most expressed that maternal treatment for fetal benefit was acceptable, provided that the mother agreed and there were no undue risks involved. Most women were more concerned about potential harm to the fetus over potential maternal risk. While stakeholders were divided about the consentability of a pregnant woman burdened with the stress of severe fetal growth restriction, almost all women interviewed responded positively to the proposed EVERREST clinical trial.

    Conclusions


    Clinical gene therapy trials are ongoing to treat severe congenital diseases postnatally. Fetal gene therapy and genome editing, however, may possess several advantages over postnatal therapy in select cases. In utero treatment allows for targeting of cell populations that are slowly dividing or quiescent postnatally. It permits therapeutic transgenes to be delivered prior to symptom onset and irreversible damage. Despite the benefits to fetal therapy, barriers still exist. Treatments must be shown to be safe to both the mother and the fetus, and therapies must offer superior advantages compared to postnatal treatment options.