Посещений: 
CRISPR/Cas9 ГЕНОТЕРАПИЯ
Успехи
CRISPR/Cas9: A revolution in genetic disease treatment? Jack Parsons  Volume 12 of The New Collection P.51-64 2017 ISSN 1757-2541
| |
|
Cystic Fibrosis, Hutchinson-Gilford progeria syndrome, HIV/AIDS. Все потенциально смертельные болезни с известной генетической причиной и все пригодны для терапии с помощью технологии редактирования генома. Некоторые признаки, такие как тип крови, детерминируются одиночным геном (и известны как моногенные признаки). Огромное большинство др. биологических признаков являются результатом взаимодействий между множественными генамии известны как полигенные признаки (Hinney et al., 2010). Чтобы поддерживать тело человека с полностью функциональным метаболизмом, органы и т.д., которые также являются адаптивными (напр., продукция меланина в коже в ответ на сильные солнечные лучи), некотрые гены д. постоянно экспрессироваться, тогда как др. экспрессируются только в определенных состояниях. В случае продукции белка, ДНК генов транскрибируется, чтобы продуцировать молекулы мРНК (Clancy and Brown, 2008). Эти мРНК (которые сами по себе могут далее изменяться или подвергаться сплайсингу в зависимости от необходимого белка) , а затем подвергаются трансляции, при этом энзимы рибосом используются для превращения сообщения, закодированного в мРНК в белок, который может выполнять затем клеточные функции (Clancy and Brown, 2008). В геноме человека (приблизительно 3.2 миллиардов 'пар оснований', составляющих блоки двунитчатой ДНК в длину) кодирующих, как было установлено, 20000 белок-кодирующих генов (Ezkurdia et al., 2013). большей части это дифферениально экспрессирующиеся белок-кодирующие гены в клетках, дающих разные ткани и органы. Генетические принципы, описанные выше действуют не только у людей, но и у всех др. животных и растений и в слегка измененном виде (в том смысле, что их геномы проще) у прокариотических организмов, таких как бактерии (Clancy and Brown, 2008).
Genes, human disease and genome editing
 A) The CRISPR/Cas9 system can be distilled to 2 essential components: 1) an RNA guide sequence to target host DNA containing a protospacer adjacent motif (PAM) and 2) the Cas9 endonuclease enzyme. B) DNA cleavage involves target recognition amidst the complex genomic milieu followed by DNA strand separation and precise enzymatic scission of the DNA backbone. C) Following DNA cleavage, non-homologous end joining (NHEJ) can potentially lead to restoration of an out-of-frame transcript without needing a DNA template. Alternatively, the homology-directed repair (HDR) pathway can use an error-free template to correct a gene mutation.
Не все человеческие тела формируются функционально здоровыми и у многих со временем возникают болезни. В то время как многие широко распространенные болезни, такие как диабет, болезни сердца и рак, могут быть очень сложными для понимания их этиологии, существуют некоторые, возникающие в результате альтераций одиночного гена или 'геномного события' (как в случае HIV/AIDS) вызывающие серьезные последствия (see Table 1). Болезни, описанные в Table 1 are тяжелые и пока возможно их паллиативное лечение (Doitsh and Greene, 2016, Gonzalo et al., 2017, Kunzelmann and Nitschke, 2000). Однако, относительная простота лежащих в основе причин этих болезней по сравнению с полигенными болезнями или болезнями стиля жизни (такими как диабет и сердечные болезни), способы лечебного воздействия на них легко представить. Делеция ΔF508 при CF, изменяющая одно основание в гене HGPS, или удаление HIV генома при HIV/AIDS снимается тяжесть этих болезней у страдающих, число которых 36.8 миллионов по всему миру (подсчитано Cystic Fibrosis Foundation, World Health Organisation and Gonzalo et al., 2017). В случае болезней человека, представленные выше примеры являются случаями, при которых genome editing (GE) технология может оказать революционное влияние. Лежащий в основе GE принцип прост: вставка, делеция или замещение ДНК в определенном месте (Ma and Liu, 2015). Последнее означает не только расположение в геноме (т.e. целенаправленное воздействие на специфический геномный локус), но и также может означать специфические типы клеток (т.e. целенаправленное воздействие на эпителиальные клетки воздушных путей, где проявления мутации CFTR наиболее тяжелые - Kunzelmann and Nitschke, 2000). Легко представить, почему заслуживающая доверие GE технология может стать столь мощной для лечения этих болезней. GE не является новой идеей. ДНК-связывающие белки, такие как Transcription Activator Like (TAL) эффекторные белки, и Zinc Finger содержащие белки связаны с нуклеазами (энзимами, разрезающими ДНК) , чтобы генерировать Zinc Finger Nuclease (ZFN) и TAL Effector Nuclease (TALEN), инструменты GE. Однако, их белковая природа затрудняет их модификации, продукцию и оценку (Ma and Liu, 2015). Итак, мы подошли к CRISPR/Cas9. CRISPRs (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) являются повторяющимися ДНК последовательностями, первоначально обнаруженными у Escherichia coli, но как оказалось широко распространены среди бактерий и archaea. Позднее было установлено, что многие последовательности ДНК в регионах CRISPR, по-видимому, вирусного происхождения. Эти регионы были найдены как активно транскрибируемые и были ассоциированы с Cas (CRISPRassociated) белками, которые могут расправлять и разрезать ДНК (Sontheimer and Barrangou, 2015). Эксперименты в 2007, с использованием бактерий Streptococcus thermophilus и инфекции бактериальным вирусом (фагами) показали, что CRISPR/Cas система кодирует ранее не охарактеризованную адаптивную иммунную систему бактерий
Table 1: Examples of some monogenic or single 'genomic event' diseases.
Болезнь вызывающие эффекты мутации CF (cystic fibrosis) transmembrane conductance regulator (CFTR) гена, наиболее распространенная из которых (ΔF508) делетирует одиночную аминокислоту в белке (Kunzelmann and Nitschke, 2000). Постоянное воспаление воздушных путей, кашель, свистящее дыхание, грудные инфекции, закупорка толстого кишечника, бесплодие (Kunzelmann and Nitschke, 2000). HGPS точечная мутация (изменение одиночного основания) в гене LMNA замещение цитозина в позиции 1824 на тимин (Gonzalo et al., 2017). Преждевременное старение, атеросклероз, почечная недостаточность, потеря поля зрения, сердечная недостаточность. Продолжительность жизни в среднем 14.6 лет (Gonzalo et al., 2017). HIV/AIDS инфекция Human Immunodeficiency Virus. Этот ретровирус встраивает свой собственный геном в клетки тела человека, заставляя их становиться факториями для новых HIV вирионов (вирусных частиц), которые способны разрушать критические иммунные клетки, известные как CD4+ T клетки (Doitsh and Greene, 2016). Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS) - неспособность иммунной системы, при этом повышается чувствительность к раковым опухолям, туберкулёзу и условно-патогенным инфекциям (Doitsh and Greene, 2016).
Необходимо отметить, что для CF и HGPS, множественные др. потенциальные генетические альтерации могут приводить к болезням. CF = Cystic Fibrosis, HGPS = Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome, HIV/AIDS = Human Immunodeficiency Virus/Acquired Immunodeficiency Syndrome.
(Barrangou et al., 2007). Проникающие фаги и др. патогены несут ДНК. Сегменты этой проникшей ДНК могут быть отловлены бактериями и включены в их собственный геном с регионы CRISPR. Эти последовательности могут быть затем скопированы (транскрибированы), чтобы давать тип РНК, известный как crRNA (CRISPR-RNA), которая ассоциирует с Cas белками. Комплекс crRNA/Cas может находить проникшую чужеродную ДНК. При обнаружении чужеродной ДНК белок Cas действует как пара 'молекулярных ножниц', вырезающих внедрившуюся патогенную ДНК, превращая её в неактивный и недееспособный патоген. Такого вырезания не происходит в CRISPR регионах. Общим результатом такого селективного вырезания чужеродной ДНК, является удаление закодированной в генах 'памяти' об инфекции (по существу является типом вакцинации) в интактных CRISPR регионах (reviewed in Amitai and Sorek, 2016). Эта система как полагают, позволяет инфицированным патогенам клеткам 'посылать' (используя crRNA в качестве адрса и штампа) пару ножниц к патогену. Достигнув соотв. адреса ножницы разрушают патогенную ДНК прежде чем она успеет внести повреждения в клетке хозяине. Копия адресной метки и штампа остаются в ДНК хозяина так что, если патоген проникнет снова, то др. содержащее ножницы послание сможет быть быстро доставлено. Это осуществляется очень быстро, поэтому эта система может формировать основу для идеальной технологии GE. Экспрессия или доставка Cas белка (Cas9 от Streptococcus pyogenes используется часто) вместе с соотв. single guide RNA molecule (sgRNA) может теоретически позволять целенаправленно воздействовать на гены в любом типе клеток (Ma et al., 2014). Белок Cas9 достаточно прост, чтобы получать его в лаб. , а sgRNAs может быть легко разработана для нахождения любого интересующего гена (Doudna and Charpentier, 2014).
Молекулярные механизмы геномного редактирования
Т.о., CRISPR/Cas9 представляет собой наиболее легко поддающуюся GE технологию. Однако каким образом индукция разрывов ДНК в определенном месте позволяет геному осуществлять редактирование? Ответ находится в методах, которые клетки могут использовать для репарации разрывов в их ДНК. Используя 'имеющуюся в наличии', систему CRISPR/Cas9 можно вызывать разрыв двойной нити в определенном месте ДНК хозяина после внесения компонентов (Cas9 и sgRNA) в клетку (see Figure 1) (Doudna and Charpentier, 2014). Не будучи репарированными двойные разрывы ДНК, скорее всего, будут вызывать гибель клетки. Используя, напр., человеческие клетки, возможны два пути репарации ДНК, в результате чего геномное редактирование становится очевиадным. Первый путь известен как NonHomologous End Joining (NHEJ), при котором концы разрывов ДНК просто повторно соединяются . Однако NHEJ часто приводит к небольшим инсерциям или делециям (известным как indels) в ДНК мишени, приводя к потере функции гена (see Figure 1) (Aparicio et al., 2014). В случае HIV/AIDS, подвергающийся целенаправленному воздействию вирусный геном при этом подавляет продукцию функционального вириона (Spragg et al., 2016).
Вторая возможность заключается в альтерациях гена мишени с использованием процесса Homology Directed Repair (HDR) (Aparicio et al., 2014). В это случае CRISPR/Cas9 используется как и прежде, но с дополнительным добавлением замещающего участка ДНК, который обладает определенным сходством (гомологией) с последовательностью мишенью. Он, скорее всего, поглощается (рекомбинирует) регионом ДНК мишени преобразовании разрыва двойной нити ДНК и поэтому может вносить замещение ДНК, важное для образования функционального редактируемого гена (see Figure 1) (Shen et al., 2017). В случае CF и HGPS (see Table 1), этот HDR CRISPR/Cas9 метод может быть использован для 'коррекции' неправильных генов, вызывающих постоянно болезни (Schwank et al., 2013, Liu et al., 2011). Обзор GE технологии и возможных путей репарации ДНК, вызывающих эффект редактирования представлен на Рис. 1. С момента открытия система CRISPR/Cas9 быстро прогрессировала как инструмент GE (к моменту написания опубликовано более 5500 научных сообщений относительно CRISPR - PubMed 2017). Многие типы клеток мыши и человека привлечены к проверке концепции CRSIPR/Cas9 (Moreno and Mali, 2017). Кроме того, многократное использование CRISPR/Cas9 было продемонстрировано, когда множественные sgRNAs были использованы для наведения Cas9, приводя к одновременному редактированию генома по многим местам (Cong et al., 2013), с высокой эффективностью. Для лечения болезней c помощью редактирования генома используются два основных подхода; in vivo или ex vivo геномное редактирование (see Figure 2).
В случае исследований CF Schwank et al., (2013) оказались способны продемонстрировать пригодность CRISPR/Cas9 для HDR GE подхода по репарации поврежденного CFTR гена в кишечных стволовых клетках, полученных от страдающих CF. Это позволяло возвращать клетки к 'здоровому' фенотипу in vitro, хотя они затем не были использованы in vivo. Сходный подход был успешно продемонстрирован в случае HGPS, используя фибробласты от пациентов, которые были получены и де-дифференцированы в индуцированные плюрипотентные стволовые клеткиl (iPSC) перед их обработкой (Liu et al., 2011). iPSCs обладают способностью дифференцироваться обратно в многие типы тканей (Liu et al., 2011), и могут быть теоретически быть использованы (как показщано на figure 2) для трансплантации свободного от болезни генома редактированной ткани обратно пациентам.
Изменение HIV генома c помощью CRISPR/Cas9, используя клетки, получаемые от пациентов
1) Доставка CRISPR/Cas9 & sgRNA к клеткам мишеням (PAM sgRNA Cas9 NHEJ HDR) 2) Cas9 идентифицирует область ДНК мишени и индуцирует DSB 3) NHEJ (gene silencing) или HDR (gene 'correction') происходят в зависимости от обеспечения 'репарирующей' ДНК (Indel repair) Замещение ДНК
также было успешно продемонстрировано in vitro, и является важной первой ступенью осуществления GE в качестве возможного лечения HIV/AIDS (rev. Spragg et al., 2016).
Genome editing - off-target effects and delivering therapy: opportunities and challenges
В то время как CRISPR/Cas9 GE доказывает, что является мощным инструментом in vitro при этом имеется потенциал использования для лечения многих болезней, остаются ключевые барьеры его использования in vivo, наиболее важными препятствиями остаются эффекты вне мишени (т.e. разрезание DNA в неправильных местах) и надежность и эффективность доставки. Эффекты вне мишени присутствуют во всех GE технологиях и охарактеризованы (Dorson and Border, 2016). Эффекты вне мишени безусловно основная проблема в терапевтическом использовании; CRISPR/Cas9 GE может создавать случайно мишени для онкогенов (генов, которые могут вызывать озлокачествление клеток ), и приводить тем самым к формированию опухолей (Cho et al., 2014). В революционном (и дискуссионном) исследовании, Liang et al. (2015) описали использование системы CRISPR/Cas9 для эмбрионов человека. Большинство объявило мораториум на такие работы (Lanphier et al., 2015), частично по этическим соображениям, связанным с 'designer babies' as well as the issue of consent where an embryo is concerned. Хотя были использованы трехядерные эмбрионы, оплодотворенные двумя спермиями и следовательно, нежизнеспособные, работа подчеркнула проблему эффектов вне мишени. Исследователи использовали конструкцию, нацеленную только на ген Beta-глобина, мутации в котором могут вызывать нарушения крови, такие как бета талассемия и серповидно-клеточная болезнь. Однако мутации вне мишени, генерируемые CRISPR/Cas9 конструкцией были многочисленны, подчеркивая серьезные проблемы с безопасностью при использовании этой технологии для лечения болезней. Для борьбы с этим исследователи экспериментируют с 'nickase' вариантами Cas9 (которые разрезают только одну нить ДНК после соединения, следовательно, необходимы две Cas9 никазы с разными sgRNAs, чтобы индуцировать разрывы одной из двух нитей ДНК) и с 'dead' Cas9 (dCas9) вариантами (неактивной, но сливающейся с разными нуклеазами), а также с альтерациями в структуре sgRNA (Moreno and Mali, 2017). Они оказались способны улучшить аккуратность в целенаправленном воздействии, но необходимы дальнейшие исследования по сведению эффектов вне мишени до достаточно низкой частоты, пригодной для использвания. В терминах терапии in vivo, которая может быть необходима при лечении HIV/AIDS, когда вирус HIV способен инфицировать многие типы клеток, имеются и др. проблемы в смысле системы доставки. В то время как непосредственное использование белков и РНК , чтобы управлять системой CRISPR/Cas9, были протестированы на клетках и животных моделях, обнаружено быстрое разрушение системы в теле (Moreno and Mali, 2017), и выявлен ограниченный период эффективности (see Table 2).
PATIENT EX VIVO GENOME EDITING IN VIVO
Эффективный подход д. обеспечивать доставку ДНК, кодирующую компоненты системы GE system, так, чтобы она экспрессировалась in vivo, предоставляя долговременное окно эффективного воздействия. Ретровирусы, лентивирусы, аденовирусы и adeno-associated viruses (AAVs) естественным образом способны доставлять генетическую информацию а клетки млекопитающих (Schmidt and Grimm, 2015). В то время как ретровирусы и лентивирусы вставляют свой генетический материал в геном хозяина (HIV является ретровирусом), геном аденовирусов и AAVs остается в клетке хозяине без интеграции (see Table 2) (Moreno and Mali, 2017). AAVs поэтому становятся предпочтительным вектором доставки, благодаря разнообразным благоприятным характеристикам, представленными в таблице 3. В самом деле, они уже используются в клинических исследованиях (Mendell and Rodino-Klapac, 2016). Однако размер доставляемого пакета в клетки мишени in vivo c помощью AAVs ограничен 4.7kb (kb = kilobase pair, 1kb being 1000 base pairs of DNA, see Table 2). Тогда как необходимая ДНК для кодирования лишь Cas9 составляет 4.2kb, кодирующие последовательности sgRNA и др. факторов, необходимых для управления экспрессией также нужно доставлять (Moreno and Mali, 2017). Чтобы предолеть ограничения пространства исследователи предлагаютиспользовать более короткие версии Cas9 от др. видов бактерий, но это часто требует более сложных последовательностей PAM для распознавания места разрезаe (Ran et al., 2015, see Figure 1). Современные работы нацелены на преобразование Cas9 белков, чтобы уменьшить точность этих необходимых PAM при использовании более коротких версий нуклеазы (Zetsche et al., 2015). Лентивирусы являются др. возможной опцией и обладают более значительным размером для багажа до 9.7kb (see Table 2). Кроме того, их способность инфицировать специфические типы клеток можно легко изменить посредством преобразования белков вирусной оболочки, чтобы целенаправленно находить рецепторы определенных типов клеток, обеспечивая доставку в определенный тип клеток инструментов для GE (Moreno and Mali, 2017). Лентивирусы являются надежным инструментом для доставки CRISPR/Cas9 e x vivo и in vivo (эксперименты на мышах) (Naldini, 2015). Недостатком лентивирусов является их интеграция в геном. В противовес AAVs, где ДНК доставляется в цитоплазму или ядро и экспрессируется без интеграции, лентивирусы случайным образом интегрируют свою геномную упаковку в геном хозяина. Эта интеграция обусловливает риск 'инсерционного мутагенеза', когда случайная вставка вирусной ДНК будет разрушать гены клетки хозяина с высоким риском нарушения функций клетки или даже генерации раковых мутаций (Moreno and Mali, 2017). Сегодня исследуются integrase (энзимы, которые катализируют интеграцию ДНК) несовершенных лентивирусов (Wang et al., 2016), но необходимы дальнейшие исследования, чтобы охарактеризовать эти векторы доставки, а также риск интеграции.
Table 2: Gene therapy delivery methods. Active timeframe of therapy after delivery, risk of insertional mutagenesis, immunogenicity and package carrying size is given for six commonly discussed gene therapy delivery vectors. AAVs = Adeno-associated viruses. Adapted from Moreno and Mali (2017).
Future avenues for CRISPR/Cas9
This review has sought to explain the CRISPR/Cas9 system in the context of genome engineering for the treatment of human diseases. It should also be noted, however, that CRISPR/Cas systems have potential uses ranging far beyond human clinical therapy. These include biomedical research, generation of disease resistant agricultural animals (Reardon 2016), enabling animal based production of human organs (Reardon, 2015), production of higher yield crops (Khatodia et al., 2016) and many more, where CRISPR/Cas GE is already making an enormous impact. Although basic characterisation of CRISPR/Cas systems has progressed rapidly since its discovery and first demonstration as a GE tool a mere decade ago, there remain key challenges to its in vivo human usage, including off target mutations and characterisation of suitable delivery methods. Additionally (and especially in the case of potential embryo GE), key ethical questions remain as to the extent to which we regulate for genome editing in humans. However, despite these challenges CRISPR/Cas GE systems hold great potential as a tool of the future and are likely to develop into a truly life-changing biotechnology.
|